APEX-array. Tecnologia di microarray basata sulla reazione APEX (Arrayed Primer Extension)

Transcript

1 APEX-array Tecnologia di microarray basata sulla reazione APEX (Arrayed Primer Extension)

2 APEX-array Preparazione del campione Le regioni genomiche di interesse vengono amplificate per PCR Nella mix di PCR una parte dei dttp viene sostituita con dutp, per consentire la successiva frammentazione con l enzima Uracil N-Glicosilasi (UNG) I prodotti vengono miscelati, concentrati e purificati dai dntp non incorporati mediante l utilizzo dell enzima fosfatasi alcalina shrimp (sap) I campioni vengono poi riscaldati a 95 per inattivare gli enzimi e per denaturare e frammentare il DNA a livello dei siti uracile

3 APEX-array Reazione APEX Arrayed Primer Extension Single Nucleotide Extension DNA frammentato DNA polimerasi Single Nucleotide Extension A C T G DNA polimerasi ddntp marcati Lavaggi

4 Ricerca di mutazioni mediante APEX-array

5

6 APEX-array Rilevamento della fluorescenza

10

11

12 APEX-array Analisi dei risultati mediante Software

13 APEX-array Analisi dei risultati mediante Software

14

15 APEX-array commercialmente disponibili Disease Position Genes List of Genes 1 Thalassemia Hereditary hearing loss Cystic fibrosis CFTR 4 Ashkenazi Jewish diseases beta-globin gene, deltaglobin gene Connexin 26, Connexin 30, Connexin 31, pendrin, mitochondrial DNA, prestin HEX A, BLM, ASPA, SMPD1, IKBKAP, DYT1, MEFV,MCOLN1, FANCC, F11, G6PC, BCKHDB, GJB2, LDLR, DLD, GDE, SERPINA1, NEB, PCDH15, ABCC8, GBA, CFTR

16 APEX-array commercialmente disponibili 5 Disease Position Genes List of Genes Stargardt disease, age related macular degeneration, cone-rod dystrophy ABCA4 6 Bardet Biedl Corneal dystrophy BBS1, BBS2, BBS3, BBS4, BBS5, BBS6, BBS7, BBS8, BBS9, BBS10,BBS12, PHF6, ALMS1, GNAS1 COL8A2, TGFBI, VSX1, CHST6, KRT3, KRT12, GSN, TACSTD2, CYP4V2, SOD1, TCF8/ZEB1, SLC4A11, UBIAD1

17 APEX-array commercialmente disponibili Disease Position Genes List of Genes Congenital stationary night blindness Vitelliform macular dystrophy Autosomal dominant retinitis pigmentosa Autosomal dominant optic atrophy BEST OPA-1 RHO, PDE6B, GNAT1, CABP4, GRM6, SAG, NYX, CACNA1F, CACNA2D Ca4, FSCN2, IMPDH1, NRL, PRPF3, PRPF31, PRPF8, RDS, RHO, ROM1, RP1, RP9, CRX, TOPORS, PNR, KLHL7

18 Array CGH

19 CNV Copy Number Variation Le CNV consistono in differenze nel numero di copie di determinati segmenti di DNA, osservate durante la comparazione di due o più genomi Queste possono essere acquisizioni o perdite di copie di tali segmenti rispetto ad una sequenza genomica considerata di riferimento

20 Anomalie dovute alla variazione del numero di copie di geni sono eventi comuni nei tumori solidi e nei disordini costituzionali Spesso però le delezioni e/o le duplicazioni sono criptiche perchè la loro dimensione risulta essere inferiore al limite di risoluzione di un bandeggio cromosomico convenzionale (10 Mb) Già lo sviluppo di tecniche quali la FISH e la CGH hanno consentito di espandere il campo della della Genetica Medica, cosentendo di analizzare regioni cromosomiche sempre più piccole

21 FISH Fluorescence In Situ Hybridization È una tecnica di ibridazione che permette di identificare sequenze specifiche di DNA su cromosomi metafasici o nuclei interfasici fissati su vetrino Tale identificazione avviene mediante sonde marcate con fluorocromi che emettono a diverse lunghezze d onda

22 FISH Fluorescent In Situ Hybridization CONSENTE DI CLASSIFICARE ANOMALIE DI NUMERO E DI STRUTTURA NON DEFINITE CON LE TECNICHE DI BANDEGGIO E DI IDENTIFICARE RIARRANGIAMENTI CRIPTICI NON EVIDENZIATI DALLA CITOGENETICA TRADIZIONALE, SOPRATTUTTO MICRODELEZIONI TIPI DI SONDE: Sequenze ripetute: alfoidi, ßsatellite, classical satellite e telomeriche Genoteche cromosoma specifiche (painting): sono costituite da un pool di sequenze specifiche di un cromosoma intero (totali o parziali) Genoteche banda specifiche Sequenze a singola copia: clonate in diversi tipi di vettori (plasmidi, fagi, cosmidi, BAC, PAC, YAC)

23 FISH Fluorescent In Situ Hybridization

24 FISH Fluorescent In Situ Hybridization Principali applicazioni diagnostiche della FISH: 1) diagnosi delle sindromi da microdelezione o da microduplicazione 2) studio delle delezioni subtelomeriche 3) caratterizzazione di marker cromosomici 4) caratterizzazione di riarrangiamneti cromosomici, sia bilanciati che sbilanciati 5) determinazione della percentuale di mosaicismi cromosomici

25 CGH Comparative Genomic Hybridization La CGH convenzionale è una tecnica che è stata sviluppata per rilevare variazioni del numero di copie di geni specialmente in campioni oncologici, per i quali era difficile ottenere metafasi con risoluzione di bandeggio accettabile.

26 Studio di alterazioni genomiche in oncologia Loss Gain Oncosoppressore Oncogene Lo sviluppo di tumori solidi è associato all acquisizione di alterazioni genetiche complesse che modificano la normale proliferazione e sopravvivenza cellulare Molti di questi cambiamenti coinvolgono acquisizione e/o perdita di parti del genoma: amplificazione di un oncogene o delezione di un oncosoppressore sono considerati meccanismi di tumorigenesi

27 CGH Comparative Genomic Hybridization Il principio della tecnica si basa su una competizione per il legame su un supporto normale (cromosomi in metafase) di due DNA genomici marcati con fluorocromi diversi. Un DNA è estratto dal paziente in esame mentre l altro DNA è un pool di DNA genomico di riferimento

28 CGH Comparative Genomic Hybridization In questa competizione comparativa si legherà in proporzione più DNA da testare in ogni locus se maggiore sarà il numero di copie presenti in quel locus rispetto al numero di copie presenti nel DNA genomico di controllo. Viceversa se ne legherà meno se minore sarà il numero di copie presenti in quel locus rispetto al numero di copie presenti nel DNA genomico di controllo

29 CGH Comparative Genomic Hybridization

30 CGH Comparative Genomic Hybridization Il risultato viene espresso dal rapporto delle 2 fluorescenze. In caso di numero di copie normali avrò 2 copie di DNA da testare e 2 copie del DNA di controllo genomico, per cui il rapporto tra i 2 fluorocromi 2/2 è pari a 1. In caso di trisomia del DNA da testare il rapporto sarà pari a 1,5 e cioè 3/2. Viceversa in caso di monosomia il rapporto sarà pari a 0,5 e cioè ½ La CGH tradizionale presenta alcuni problemi tra cui la variabilità della morfologia dei cromosomi che ne limitano la risoluzione a circa 3-7 Mb per le delezioni e 2 Mb per le amplificazioni).

31 Array CGH I limiti della CGH sono stati superati con l applicazione a tale tecnica della tecnologia dei microarray CGH Array CGH

32 Array CGH Gli array CGH sono inizialmente stati sviluppati sostituendo i cromosomi delle metafasi di riferimento con una matrice su cui sono spottati cloni YAC, BAC o PAC (Yeast-Lievito, Bacterial, Plasmide Artifi cial Cromosome) contenenti frammenti genomici di circa 150 Kb corrispondenti a loci specifi ci del cromosoma

33 Array CGH L utilizzo di tali cloni permette l immediata correlazione tra l eventuale alterazione e una precisa posizione nel genoma. La risoluzione genomica dipende quindi dalla lunghezza dei cloni utilizzati e dalla distanza tra un clone e l altro

34 Array CGH PROCEDURA Estrazione DNA da sangue intero Marcatura Dna test e Dna reference (Cy3 e Cy5) Coibridazione Dna test e Dna reference Ibridazione Dna test/dna reference sull array Scansione ( Scanner) Elaborazione dati (Software adeguato)

35 Array CGH

36 Array CGH

37 Array CGH

38 Array CGH

39 Array CGH POSSIBILI APPLICAZIONI DELLA CGH-ARRAY NELLO STUDIO DELLE ANOMALIE CROMOSOMICHE STUDIARE GLI SBILANCIAMENTI PRESENTI NELL INTERO GENOMA STUDIARE PARTICOLARI REGIONI CROMOSOMICHE STUDIARE PARTICOLARI RIARRANGIAMENTI CROMOSOMICI, ANCHE APPARENTEMENTE BILANCIATI, PER INDIVIDUARE EVENTUALE GUADAGNO O PERDITA DI MATERIALE GENETICO

40

41

42 CGH convenzionale vs CGH-array POTERE DI RISOLUZIONE CGH convenzionale Kb CGH-array 1000 Kb La risoluzione è limitata dalla grandezza degli inserti dei cloni e dalla distanza genomica tra di essi

43 Caratteristiche generali Array CGH La risoluzione dipende dalla distanza genomica tra le sonde sull array e dalla loro dimensione La sensibilità è influenzata dal rapporto segnale/rumore L intensità del segnale è determinata dalla complessità del DNA contenuto negli spot e dalla qualità del campione Vantaggi Indipendenza da cellule in divisione Capacità di analizzare l intero genoma in un esperimento Elevata specificità, sensibilità e risoluzione Rapidità

44 Array CGH Svantaggi Incapacità di rilevare riarrangiamenti bilanciati e poliploidie Limitata abilità di individuare mosaicismi Fattori tecnici influenti Specificità e intensità dei segnali di ibridazione Quantità e qualità del campione di DNA Fattori biologici influenti Sequenze altamente ripetute e disperse Presenza di low-copy repeats (LCRs) Presenza di polimorfismi del numero di copie (LCVs)

45 Array CGH di oligonucleotidi Una grande evoluzione nella tecnica degli Array CGH è stata l intoduzione della tecnologia degli array di oligonucleotidi ad alta densità Gli array più sofisticati utilizzano sonde di nucleotidi sintetizzate in situ sul supporto Questi tipi di array sono in grado di raggiungere risoluzioni funzionali fino a 4 Kb

46

47 CGH-array di oligonucleotidi CGH convenzionale CGH-array di cloni CGH-array di oligo POTERE DI RISOLUZIONE Kb 1000 Kb 4 Kb DIMENSIONE DELLE SONDE Kb b La risoluzione è limitata dalla grandezza delle sonde e dalla distanza genomica tra di esse

48 Una delezione sul braccio corto del cromosoma 1 BAC array FISH Loss Gain

49 Oligonucleotide array BAC array Raw Dye reversal smoothed Loss Gain Loss Gain Loss Gain

50 Anomalie dovute alla variazione del numero di copie di geni sono eventi comuni in numerose patologie, ma

51 CNV sono state identificate in un analisi mediante array- CGH su individui apparentemente sani, (Iafrate et al., 2004; Sebat et al., 2004) Un analisi su 270 individui provenienti da diverse aree geografiche (Europa, Africa e Asia) ha permesso di stimare che le CNV interessano circa il 12% del genoma umano (Redon et al. 2006) Le CNV sono una delle più grandi fonti di variabilità e diversità genetica Le CNV di individui sani possono comunque essere associate alla suscettibilità a malattie (HIV/AIDS, malaria, schizofrenia, aterosclerosi, psoriasi, ecc.)