Polymerase chain reaction e sue applicazioni

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1 LEZIONE 4 Polymerase chain reaction e sue applicazioni La polymerase chain reaction o PCR è una tecnica relativamente recente che ha rivoluzionato la Biologia molecolare. Ideata da Kary Mullis intorno ai primi anni 80, è stata perfezionata e automatizzata al punto da sostituire molte tecniche di clonaggio tradizionale. Numerosi varianti della PCR base trovano applicazioni, tra l altro, nella ricerca di base, in diagnostica molecolare e in ambito forense.

2 PCR Base La tecnica della PCR si basa sulla amplificazione di specifici frammenti compresi tra le estremità di due primers definiti dallo sperimentatore, attraverso la reiterazione di n cicli, ciascuno dei quali include uno step di denaturazione, uno di appaiamento e uno di estensione. La reiterazione automatizzata della procedura, le alte temperature di esercizio e la possibilità di definire esattamente la sequenza da amplificare conferisce alla PCR grande sensibilità, specificità e versabilità. Considerando i primi due cicli, l amplificazione della sequenza bersaglio è uguale a circa 2n-2. In pratica dopo 30 cicli di PCR la nostra sequenza bersaglio si sarà amplificata 228 volte, producendo più di 250 milioni di molecole.

3 La sensibilità della PCR L amplificazione esponenzionale delle sequenze bersaglio e la selettività conferita dalla scelta dei primers conferiscono alla PCR una altissima sensibilità anche a partire da preparazione non purificate In teoria questa tecnica ha le potenzialità per amplificare un gene unico da un unica cellula! In effetti si è già riusciti a determinare il sesso di nascituri a partire da singole cellule fetali, amplificando 149 bp di una sequenza (DZY1) altamente ripetuta e specifica per il cromosoma Y. Un aspetto interessante è la capacità della PCR di funzionare a partire da preparazioni non purificate. Questa proprietà permette per es. di analizzare colonie batteriche trasfor- mate, selezionando rapidamente le colonie positive da quelle negative (colony PCR). Ma la capacità della PCR di utilizzare stampi grezzi va ben oltre! Nelle applicazioni forensi la PCR riesce ad amplificare correttamente sequenze di DNA provenienti da reperti legali come capelli o tracce di sangue secco. Ancora più sorprendentemente è stato possibile amplificare DNA amplificato da mummie egiziane e, addiritura, quello di una pianta preistorica, amplificata a partire da un reperto fossile risalente al Miocene, 18 milioni di fa!

4 ELEMENTI NECESSARI ALLA REAZIONE: 1- DUE OLIGONUCLEOTIDI COMPLEMENTARI A DUE REGIONI SITUATE SU FILAMENTI OPPOSTI DEL DNA STAMPO AI LATI DELLA REGIONE CHE SI VUOLE AMPLIFICARE 2- DNA STAMPO CHE CONTENGA LA REGIONE DA AMPLIFICARE 3- POLIMERASI TERMOSTABILE (NON VIENE DENATURATA SE PORTATA A 95 C) 4- I 4 DESOSSIRIBONUCLEOSIDI TRIFOSFATI

5 PROCESSO DI PCR PREVEDE UN CERTO NUMERO DI CICLI. OGNI CICLO CONSISTE DI 3 PASSAGGI: 1- DENATURAZIONE: TEMP. 94 C. IL DNA STAMPO VIENE DENATURATO 2-APPAIAMENTO: C. I PRIMERS SI APPAIANO CON IL DNA STAMPO 3- SINTESI: TEMP.72 C E OTTIMALE PER IL FUNZIONAMENTO DI Taq (Termus aquaticus) POLIMERASI

6 Denaturazione 3-3 Annealing 3-3 Estensione 3

7 S&R Fig. 6.1

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14 La Taq polimerasi Le prime PCR, effettuate utilizzando la polimerasi Klenow, erano molto inefficenti perché, essendo termolabili, dovevano essere rimpiazzate ad ogni ciclo di amplificazione Un significativo miglioramento della PCR si deve all introduzione di un nuovo tipo di polimerasi termostabile isolata da Thermus acquaticus, un batterio isolato nelle pozze termali. Questa polimerasi ha un optimum a 72 C e resiste alle alte temperature usate negli step di denaturazione permettendo l automatizzazione dell intera procedura, oltreché un deciso miglioramento della specificità della reazione. Esistono oggi numerose varianti della Taq polimerasi, come le polimerasi isolate da Thermus flavus (Tfl polimerasi) e Thermus thermophilus (Tth polimerasi) e molte altre. Caratterististiche importanti di polimerasi di questo tipo sono:la termostabilità, la processività (affinità per lo stampo che determina il numero di base incorporate prima della dissociazione), la fedeltà di incorporazione.

15 Clonaggio di prodotti di PCR Oltre che per scopi analitici la PCR può essere utilizzata per clonare geni. Quando si usano polimerasi con attività proofreading, come per esempio Pfu oppure Pwo i prodotti di amplificazione prodotti avranno estremità piatte e potranno essere normalmente subclonati. Quando invece si usano polimerasi non proofreading come la Taq polimerasi, i prodotti di amplificazioni prodotti, a causa della modesta attività di tipo terminal trasferasica propria delle polimerasi termostabili di questo tipo, avranno incorporata una A sporgente all estremità 3 e non potranno essere subclonate. Per aggirare l ostacolo sono possibili 3 strategie: Incorporare siti di restrizione nei primers Clonare il prodotto di PCR in un vettore T/A Clonare il prodotto di PCR in un vettore TOPO

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17 Fedeltà di sintesi della Taq polimerasi Un aspetto di particolare importanza è costituito dalla fedeltà di incorporazione. In generale le DNA polimerasi duplicano il DNA fedelmente, ma non esattamente, con un tasso d errore intorno a Questa bassa frequenza di errore è mantenuta grazie alla presenza di attività 3 - esonucleasica di correzione di bozze (proofreading). La Taq polimerasi, tuttavia, è priva di attività proof reading ed incorpora, in media, una base sbagliata ogni sintetizzate ( 1,1 x10-4 ). Anche se questa caratteristica non è rilevante nelle tecniche analitiche può essere un grosso problema nei clonaggi. Esistono in commercio DNA polimerasi termostabili con attività di proofreading con tassi di errore più bassi, fino a 1,6 x 10-6, che andrebbero usati nei clonaggi molecolari. E stato inoltre capito che l assenza di attività 3 - esonucleasica di correzione di bozze della Taq è uno dei principali fattori che determinano l incapacità della PCR di amplificare stampi più lunghi di 3 Kb. L utilizzo di miscele di polimerasi contenenti polimerasi con attività di proofreading viene oggi utilizzata nelle cosidette LA-PCR (Long Accurate PCR) capaci di amplificare templati fino a 40 Kb

18 Tassi di errore di alcune DNA polimerasi termostabili Taq (Thermus aquaticus) 1.1 x 10-4 base substitutions/bp 2.4 x 10-5 frameshift mutations/bp 2.1 x 10-4 errors/bp 7.2 x 10-5 errors/bp 8.9 x 10-5 errors/bp 2.0 x 10-5 errors/bp 1.1 x 10-4 errors/bp KlenTaq (Thermus aquaticus) 5.1 x 10-5 errors/bp Vent (Thermococcus litoralis) 2.4 x 10-5 errors/bp 4.5 x 10-5 errors/bp 5.7 x 10-5 errors/bp Vent(exo-) (Thermococcus litoralis) 1.9 x 10-4 errors/bp Deep Vent (Pyrococcus species GB-D) No published literature. New England Biolabs claims fidelity is equal to or greater than that of Vent. Deep Vent(exo-) No published literature. Pfu (Pyrococcus furiosus) 1.6 x 10-6 errors/base Replinase (Thermus flavis) 1.03 x 10-4 errors/base Pwo (Pyrococcus wosei) 3,2 x 10-6 errors/base

19 Il problema dei falsi positivi A causa della sua elevata sensibilità la PCR può dare falsi positivi, per evitare i quali, devono essere osservate alcune precauzioni. In presenza di genomi complessi, specie a temperature poco stringenti, i primers possono appaiare in regioni non omologhe. Se entrambi i primers appaiano su uno pseudo-target, questo può essere selettivamente amplificato. Per minimizzare questo problema si ossevano alcune precauzioni di carattere generale, come quello di preparare la reazione a bassa temperatura, usare pipette Gilson protette da filtri o lavorare in cappe a flusso laminare, o effettuare, quando opportono, PCR annidate (nested PCR; vedi dopo). Esistono in commercio, inoltre, polimerasi modificate, chiamate hot start che sono appositamente studiate per minimizzare questo problema. Sono basate su forme inattive della polimerasi, che vengono attivate dalle alte temperature. Un esempio è costituito da polimerasi inattive perchè inglobate in palline di cera, che all innalzarsi della temperatura fondono, liberando ed attivando l enzima.

20 Un altro tipo di polimerasi hot start è costituito da un complesso polimerasi/anticorpo anti-polimerasi che viene disattivato ad alte temperatura liberando l attività enzimatica. Un ulteriore esempio è costituito dalla AmpliTaq Gold, una polimerasi modificata chimicamente che rimane inattiva fino a quando la temperatura non viene portata a 95 C per. Il miglior sistema per minimizzare i falsi positivi dovuti a contaminazioni esterne, tuttavia, consiste nell utilizzare l uridina trifosfato (UTP) al posto della desossitimidina trifosfato (dttp) e l enzima uridil glicosidasi nella miscela di reazione. In virtù della sua somiglianza strutturale al dttp, l uridina trifosfato può sostituire questo nucleotide nelle reazioni di allungamento stampo-dipendenti catalizzate dalle polimerasi. La presenza dell enzima uridil-n glicosidasi (UNG) nella miscela di reazione, distruggerà qualunque residuo di precedenti amplificazioni eventualmente presenti nella reazione senza disturbare il DNA stampo. All inizio della reazione di PCR, infine, l elevata temperatura del primo step di amplificazione provvederà a distruggere l uridil-n-glicosidasi.

21 -3 3 primer1 Falso target -3 Il Primer1 appaia erroneamente primer2 3 primer1 Sequenza complementare al primer 1 I filamenti si separano.se Il Primer 2 si appaia... la sua estensione copia il falso target e crea una regione complementare al primer 1 Sequenza complementare al primer 1 3 Il Primer1 si estende Amplificazione specifica del falso bersaglio

22 Nested PCR La nested PCR è una variante della tecnica di PCR che consiste nello utilizzo di due coppie di primers, una esterna che genera un normale prodotto di PCR ed una coppia con primers all interno del prodotto amplificato: Se il prodotto di amplificazione fosse aspecifico la seconda PCR non andrebbe a buon fine. -3 Primer 1 Primer Primo prodotto di amplificazione Primer 3 Primer Secondo prodotto di amplificazione

23 Clonaggio di prodotti di PCR Oltre che per scopi analitici la PCR può essere utilizzata per clonare geni. Quando si usano polimerasi con attività proofreading, come per esempio Pfu oppure Pwo i prodotti di amplificazione prodotti avranno estremità piatte e potranno essere normalmente subclonati. Quando invece si usano polimerasi non proofreading come la Taq polimerasi, i prodotti di amplificazioni prodotti, a causa della modesta attività di tipo terminal trasferasica propria delle polimerasi termostabili di questo tipo, avranno incorporata una A sporgente all estremità 3 e non potranno essere subclonate. Per aggirare l ostacolo sono possibili 3 strategie: Incorporare siti di restrizione nei primers Clonare il prodotto di PCR in un vettore T/A Clonare il prodotto di PCR in un vettore TOPO

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25 (alcune) applicazioni della PCR nelle tecniche di ingegneria genetica nella diagnostica molecolare nella evoluzione molecolare in ambito forense nelle analisi di laboratorio nelle scienze ambientali ecc. ecc...

26 RT-PCR mrna + RTasi + oligo-(dt)primer mrna AAAAAAA-3 TTTTTTTT- cdna Rnasi H TTTTTTTT- 3 first -strand cdna Primer 1 TTTTTTTT- 3 AAAAAAA-3 Primer 2 Primer PCR

27 Per ottenere informazioni qualitative e quantitative sui livelli di espressione genica, spesso la RT-PCR è impiegata al posto del Northern blotting per la maggiore facilità d uso e per la maggior sensibilità A causa della grande sensibilità della PCR, tuttavia, i risultati quantitativi sono poco o punto attendibili. Sono stati messi a punto alcune tecniche per ovviare a questi inconvenienti. Tra queste: La PCR semi-quantitativa La PCR competitiva La real-time PCR

28 PCR Semi-quantitativa Una delle cause della inattendibilità della RT-PCR, a livello quantitativo è la difficolta di stimare esattamente la fluorescenza o la radioattività di prodotti di amplificazione che vanno a saturazione. La saturazione della reazione di PCR dipende, tra l altro, dalla: Inattivazione della Taq polimerasi Deplezione dei NTP Deplezione dei primers Inibizione da parte della pirofosfatasi Auto-appaiamento di DNA amplificati Una semplice variante della PCR, nota come PCR semiquantitativa risolve in parte questo problema.poichè è noto che i primi cicli di amplificazione seguono un andamento ragionevolmente lineare, La PCR semiquantitativa consiste nell effettuare una PCR solo per pochi cicli, di risolvere i prodotti di amplificazione su gel di agarosio e di visualizzare il risultato mediante Southern blotting e ibridizzazione con una sonda radioattiva.

29 PCR competitiva Anche se la PCR semi-quantitativa riesce a dare stime ragionevoli dei livelli di espressione relativi, recuperando, in parte il rapporto tra quantità di messagero e livello di amplificazione, i suoi risultati sono comunque molto approssimati e non può risalire in alcun modo alla concentrazione esatta dei trascritti. La PCR competitiva affronta il problema in modo indiretto: non potendo conoscere la concentrazione esatta del trascritto in esame si preoccupa di compararlo con quella di un mrna o di un DNA a concentrazione nota. In questa tecnica vengono usati due DNA, amplificabili con una stessa coppia di primers, ma risultanti in amplificati di dimensioni diverse. Un DNA, il competitore, è di concentrazione nota. Vengono allestite una serie di reazioni parallele in cui il cdna incognito viene mantenuto costante, mentre il competitore viene aliquotato in diluizioni seriali. La PCR competitiva riesce a stimare la concentrazione di un cdna rispetto alla concentrazione di un DNA competitore, ma non può risalire alla concentrazione del mrna corrispondente, perché non riesce a valutare la variabilità del processo di retrotrascrizione. Quando è possibile avere un mrna competitore di concentrazione nota, si può effettuare una variante di PCR competitiva a partire dalla retro-trascrizione del mrna. I risultati, in questo caso, riescono a stimare la conc. del mrna in esame.

30 1 Diluizioni seriali di una quantità nota di competitore 2 Effettuare la PCR con la stessa coppia di primers competitore (a) primer 1 primer 2 target (b) primer 1 primer a b Quantità approssimativamente uguali 6 Analizzare su gel. La coppia con quantità di amplificati approssimativamente uguali indica che il cdna target e il DNA competitore, in competizione per gli stessi primers, all inizio dell amplificazione erano presenti in quantità uguali. Poiché la concentrazione del DNA competitore è nota, si può risalire alla concentrazione del cdna incognito

31 Real time PCR La PCR in tempo reale è una implementazione della PCR che permette di avere informazioni quantitative più precise sulla quantità e concentrazione di cdna amplificati e dei loro mrna corrispondenti. Sebbene in una PCR sia difficile stabilire correlazioni quantitative tra il numero di molecole stampo e il numero di molecole amplificate, è più facile correlare la quantità di stampo con il numero di cicli necessari per ottenere un prodotto rivelabile. Il modo più facile per identificare, al suo primo apparire, un prodotto di PCR è quello di monitorare di continuo l andamento della reazione, senza dover interrompere la reazione per poterla visualizzare su gel. La real time PCR risolve questo problema utilizzando precursori fluorescenti che vengono incorporati nel prodotto in formazione o che si intercalano alla doppia elica, man mano che si forma. In ogni caso sarà possibile monitorare in tempo reale la formazione del prodotto di amplificazione seguendone l assorbimento con un sistema spettrofotometrico, in un sistema automatizzato che provvede anche alla routine della PCR.

32 In un esperimento tipico di real time PCR, al procedere dell amplificazione si accumuleranno quantità progressivamente crescenti di prodotti di amplificazione fluorescenti, sino a superare la soglia di sensibilità ed essere rivelati dallo strumento (V1). Dopo un certo numero di cicli Si prenderà un secondo punto (V2) da cui si traccerà una retta, che, estrapolata a 0 determinerà Il numero di cicli necessari per la rivelazione di un prodotto evidenziabile. Fluorescenza V2 Limite di sensibilità si rivelazione 10 V1 A 15 B 20 Questo numero, nota come valore CT, è correlato alla quantità iniziale di stampo. quantità di stampo maggiori produrranno valori CT più bassi. C Numero di cicli della PCR 35

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43 Uno dei problemi che si presenta è che lo strumento non è in grado di discriminare la fluorescenza dei prodotti di amplificazione specificifici da quelli aspecifici. Per ovviare a questo inconveniente si sono sviluppati metodi automatizzati basati su ulteriori oligonucleotidi marcati, che sono in grado di discriminare, con metodi diversi (idrolisi della sonda, ibridizzazione della sonda, doppia ibridizzazione della sonda) tra amplificazioni specifiche e aspecifiche garantendo maggiore accuratezza. Ecco, ad esempio, un metodo basato sull uso di un terzo primer specifico per la regione amplificata ma modificato in modo da avere un fluorocromo al e un quencher al 3. Per ogni ciclo di amplificazione l attività -3 esonucleasica della polimerasi degraderà il primer modificato rilasciando il fluorocromo e, allontandolo dal quencher, attivandolo, R R Q 3 3 Q 3 3 R R 3 Q Q 3 3 3

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54 I molecular beacons

55 Mutagenesi sito-specifica Gene wild-type TRASCRIZIONE GAC 3 TRADUZIONE Asp Proteina wild-type Gene con mutazione puntiforme introdotta TRASCRIZIONE GCC 3 TRADUZIONE Ala Proteina mutante con la mutazione desiderata pronta per la caratterizzazione

56 Mutagenesi sito-specifica Numerose varianti della PCR sono state adattate per effettuare manipolazioni in vitro. Una delle più semplici ed utilizzate consiste nell incorporare nel DNA da amplificare delle sequenze varianti o mutate, disegnando dei primers omologhi al 3 ma varianti al. Se la sequenza omologa al 3 è sufficientemente lunga, il primer sarà comunque in grado di innescare la sintesi di DNA da parte della Taq polimerasi. In un facile esempio dobbiamo inserire in un vettore, in maniera direzionata, una cds ( sequenza codificante), di cui conosciamola sequenza nucleotidica, contenuta in un frammento di restrizione Kpn I. 1 cds HindIII,SmaI, BamHI,PstI,XhoI,EcoRI Kpn I Kpn I

57 dsdna wild-type cccttgatatggagaatgtga 3 3 gggaactatacctcttacact Sequenza Originale presente sul vettore plasmidico che dovrà ospitare il gene di interesse digeribile con NdeI. dsdna mutato cccttcatatggagaatgtga 3 3 gggaagtatacctcttacact Sequenza mutata con sito di restrizione per NdeI (sottolineata a sinistra nel dsdna, mentre sotto sono evidenziati con ^ i siti di taglio per l enzima): 5'...C A^T A T G...3' 3'...G T A T^A C...5' Strategia per mutagenizzare il DNA bersaglio (per semplicità si descriverà solo il filamento 3 ) Viene disegnata la sequenza mutata desiderata contenente il sito di restrizione per NdeI catatg 3. Viene ricercata la sequenza più simile a quella mutata sul DNA originale: gatatg 3 (c è solo un nucleotide diverso, g al posto di c) Si aggiungono nucleotidi della sequenza originale a monte e a valle della sequenza mutata per avere degli oligo di lunghezza variabile tra 20 e 45, con un contenuto di coppie GC di circa il 40%. Queste condizioni a volte non sono facili da realizzare, e comunque si può provare anche con oligo di composizione e lunghezza diversi, come nell esempio riportato (sottolineata): cccttcatatggagaatgtga3 Si procede alla progettazione della sequenza complementare (3 ) a quella trovata in modo da avere una coppia di primers che si possa ibridare su entrambi i filamenti del DNA bersaglio: 3 gggaagtatacctcttacact Si calcola poi la Temperatura di annealing stimandola in base a quella di melting calcolata utilizzando tools bioinfomatici on-line, come: ( La temperature di melting dovrebbe essere più alta possibile per ottenere il massimo della specificità di legame (consigliata dal protocollo originale > 78 C). Ad esempio per questa coppia di primers la Tm calcolata è di circa 55 C. Nella successiva PCR la Temperatura di annealing viene impostata circa 5-8 C al di sotto della Tm teorica, per tener conto del mismatch derivante dalla mutagenesi inserita. Al termine della PCR avremo un DNA plasmidico mutante che porterà un sito di restrizione per l enzima NdeI originariamente assente nel vettore originale.

58 Mutagenesi tramite sistema Quick Change Sintesi del Filamento mutante tramite PCR. Il frammento da mutare è stato clonato da un plasmide (estratto da un ceppo di E.coli dam+ (Dam metila l adenina della sequenza GATC). Il plasmide viene usato come stampo in una reazione di PCR con due primer sovrapposti e complementari, ciascuno dei quali contiene la mutazione desiderata (indicata con x) Fasi della PCR: 1) Denaturazione del DNA templato metilato (gialloverde) 2) Annealing dei primer recanti la mutazione (frecce rosa-azzurre) 3)Estensione dei primers tramite polimerasi Pfu dotata di attività di proofreading Digestione del DNA stampo Terminata la PCR viene digerito il DNA stampo (wild-type e metilato) con l enzima di restrizione Dpn I (che digerisce solo il DNA metilato). Trasformazione. Trasformazione con il plasmide mutante (rosaazzurro) in cellule E.coli competenti che provvederanno anche a saldare la nick presente sull amplificato.

59 Mutagenesi inserzionale tramite Overlap Extention

60 Mutagenesi inserzionale tramite tecnica del Megaprimer

61 Mutagenesi a cassetta

62 2 aggiungiamo un sito di restrizione Bam HI e EcoRI rispettivamente al e al 3 del gene usando i primers 1 e 2 e amplifichiamo la sequenza tra essi compresa cds KpnI KpnI primer 2 Ba mh GG AT I TC CT T Ec A A o RI G primer 1 Bam HI Eco RI GGATTC CCTAAG 3 GAATTC CTTAAG digeriamo inserto e vettore BamHI/EcoRI, purifichiamo e lighiamo Bam HI BamHI EcoRI GATTC G G CTTAA Eco RI

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66 RACE (Rapid amplification of cdna ends) Nella costruzione di una libreria a cdna capita spesso di sotto-rappresentare le estremità al o al 3. Un metodo per minimizzare questo inconveniente consiste nell amplificazione, per PCR, delle estremità al o al 3, utilizzando un innesco gene-specifico (GSP) e un innesco universale. mrna AAAAAAA-3 Primer gene-specifico 1 AAAAAAA Terminal trasferasi + dctp 3 CCCCCC GGGGGG 3 CCCCCC GGGGGG 3 CCCCCC 3 Primer gene-specificico 2 (nested) Frammento di gene amplificato al

67 3 RACE mrna AAAAAAA-3 TTTTTTT- transcriptasi inversa RNAsi H TTTTTTT- 3 Primer sequenza specifico TTTTTTT- 3 AAAAAAA-3 TTTTTTT- AAAAAAA-3 oligo dt primer 3 3 TTTTTTT- AAAAAAA-3 TTTTTTT-

68 PCR inversa (IPCR) per l amplificazione di sequenze ignote fiancheggianti sequenze note Bam HI EcoRI EcoRI primer 1 primer 2 Digestione del DNA contenente il TAG con enzimi di Restrizione primer 1 Bam HI primer 2 3. Ligazione e circolarizzazione PCR con i primer orientati verso l esterno EcoRI EcoRI primer 2 primer 1

69 Il sequenziamento a ciclo termico ( PCR asimettrica) DNA stampo PCR con un solo primer ddatp dda dda dda dda dda Vengono effettuate 4 rezioni di PCR, ognuna contiene un solo primer e uno dei 4 dideossi nucleosidi trifosfati. Si generano le consuete famiglie di filamenti a catena terminata che vengono risolti per elettroforesi su gel di poliacrilammide

70 Applicazioni diagnostiche e forensi La PCR ha rivoluzionato il campo della diagnostica molecolare, fornendo nuovi e potenti strumenti per effettuare diagnosi precoci di alterazioni genetiche anche a livello di singolo nucleotide L estrema sensibilità e la possibilità di funzionare a partire da campioni non trattati si è rivelata invalutabile nella diagnosi prenatale di malattie genetiche, nell analisi precoce di marker tumorali e nei follow up clinici conseguenti ad asportazioni chirurgiche di tumorali. Anche in campo forense e medico legale la PCR si è imposta come strumento essenziale sul quale si basano analisi di paternità e perizie medico-legali ormai utilizzate comunemente a scopo probatorio nei tribunali di tutto il mondo.

71 Diagnosi di infezioni batteriche e virali mediante PCR Le diagnosi di infezioni batteriche o virali mediante PCR rappresentano una valida alternativa alle tecniche diagnostiche tradizionali effettuate mediante isolamento dei ceppi patogeni in coltura e loro riconoscimento morfologico oppure con tecniche immunologiche. Questi metodi sono estremamenti lenti, poco sensibili e, in alcuni casi, impossibili da effettuare, quando non si riesce a coltivare in coltura qualche patogeno. La PCR riesce, al contrario, a identificare velocemente e con estrema sensibilità la presenza di patogeni. L utilizzo (e l ottimizzazione) della PCR Multiplex, inoltre, permette di diagnosticare contemporaneamente la presenza di più patogeni come rosolia, toxoplasmosi, citomegalovirus, parvovirus B-19, papilloma virus, HIV, HCV, Herpes virus, Epstein Barr virus Ecco alcune delle applicazioni più importanti ed utilizzate: Diagnosi della Tubercolosi mediante PCR Il Mycobacterium tubercolosis è presente in numero ridottissimo nei tessuti colpiti (difficile diagnosi istologica). Per la diagnosi con PCR si estrae il DNA da una lesione e lo si amplifica con primers specifici per un gene altamente conservato in tutte le specie di Mycobacterium. Qualora un segmento vengo amplificato, esso viene ibridizzato con delle sonde specie-specifiche in modo da identificare il ceppo in questione. Con questo approccio è possibile rilevare 10 bacilli su 106 cellule eucariotiche.

72 Diagnosi dell infezione da HIV Diagnosi immunologica Diagnosi molecolare Diagnosi virologica La diagnosi immunologica è impiegata per screening di routine, utilizzando ELISA, o western Blots. Si basa sul fatto che la maggior parte dei soggetti infettati produce anticorpi anti-hiv ( anti-p24, anti gp41 e gp160) tra 6 settimane a 6 mesi dal contagio (finestra sierologica). Diagnosi di HIV mediante PCR Nel periodo susseguente al contagio in cui non si sviluppano anticorpi, detto finestra sierologica o periodo finestra non è possibile diagnosticare l HIV se non mediante PCR. Utilizzando primers specifici per il DNA virale è possibile amplificare sequenze di DNA virale integrate in poche cellule di sangue periferico. L utilizzo della RT-PCR, che consiste nella retrotrascrizione di una popolazione di copie a DNA (cdna) degli mrna dell individuo infetto, seguito dall amplificazione per PCR di sequenze Virali, permette di discriminare tra sieropositivi con infezione latente e malati di AIDS con infezione in corso e viene comunente utilizzati nei follow-up clinici per monitorare la progressione Dell infezione

73 Diagnosi di malattie geniche e genetiche La PCR e, in generale, le analisi molecolari sono oggi in grado di diagnosticare la presenza di numerose malattie dovute a mutazioni geniche in cellule autosomiche, che non verranno trasmesse alla progenie (tipicamente nel caso di vari tipi di tumori) oppure dovute a mutazioni geniche ereditarie, sia di tipo monogenico che multigenico. Leucemia mieloide cronica Linfoma follicolare non-hodgkin Linfoma di Burkitt Leucemia linfoide acuta M3 Linfoma non Hodgkin bcr-abl t(9;22) bcl-2 C-myc pml-rar t(15;17) gene del recettore delle cellule T Da minime quantità di materiale di partenza, si possono avere in poche ore risultati affidabili. Particolarmente importante la possibilità di effettuare analisi prenatali estremamente precoci in grado di migliorare la qualità di vita dei nascituri o di dettare comportanti etici o precauzionali.

74 Determinazione del sesso Molte malattie ereditarie sono legate al cromosoma X e colpiscono quasi esclusivamente i maschi. Esempi di malattie genetiche legate all X sono : L emofilia Il favismo La distrofia muscolare di Duchenne Molte forme di ritardo mentale L ittiosi La possibilità di diagnosticare precocemente il sesso di un nascituro di genitori portatori sani è quindi importante per evitare gravi patologie Nel cromosoma Y sono presenti delle sequenze uniche come la sequenza DYZ1 di 3,5 kb ripetuta ben 5000 volte che possono essere amplificate mediante PCR. La presenza di cellule fetali nel sangue periferico, permette di eseguire l analisi anche senza effettuare l amniocentesi. Anche in questo caso è possibile amplificare le sequenze DYZ1. In questo caso, però, sono necessari cicli di amplificazione. Per ridurre l amplificazione di tratti indesiderati si utilizzano dei primers annidati (nestedprimers).

75 Diagnosi prenatale di emofilia effettuata mediante PCR Nel gene mutato viene perso il sito di BclI per cui l azione dell enzima di restrizione non produce due frammenti (99 e 43 bp) ma rimane il frammento integro (142 bp). Gene del fattore VIII polimorfismo per Bcl I I II presenza del sito Bcl I I-1 I-2 II-1 II-2 II-3 (-) (+)

76 La conoscenza della base molecolare di molte malattie genetiche, ne permettono l analisi con varie tecniche di genetica e biologia molecolare, come il linkage associato a RFLP noti, o l ibridazione con oligonucleotidi sequenza specifici ( ASO). Anche quando non è nota la natura esatta della mutazione, è possibile individuare alleli mutanti anche di un solo nucleotide con la SSCP (single strand conformation poliphormism). (A) Oligonucleotide normale CACCAAAAGATGATATTTTC (B) Oligonucleotide mutante CACCAAA TGATATTTTC Nota la sequenza fiancheg- I giante la mutazione si amplifica per PCR un fram mento che lo contenga da individui sospetti II 1 normale portatore 2. Si trasferiscono i prodotti di amplificazione mediante slot blotting distribuendolo in diversi slots 3. Si ibridano le reazioni A B con ASO specifici per la sequenza normale e mutata I-1 II-1 II-2 II-3 II-4 I-2 controllo

77 Il morbo di Huntington E una malattia neurodegenerativa che è causata dal malfunzionamento del gene Htt sul cromosoma 4 che codifica per la proteina Huntingtina (coinvolta nel trasporto vescicolare assonale), dovuta a mutazioni che introducono ripetizioni della tripletta CAG. Nel morbo di Huntington, la PCR amplifica una regione del cromosoma che ha un numero variabile di sequenze CAG che si ripetono. Gli individui normali possono avere fino a 30 copie della sequenza, mentre i malati di Huntington hanno da 37 fino ad oltre un centinaio. Nel gel che mostra i risultati dell'esperimento effettuato su una famiglia con il padre che ha il morbo di Huntington, i figli 4 e 9 mostrano delle sequenze normali per questa regione, ciò prova che non avranno la malattia. L'individuo 6 normale ha delle sequenze amplificate simili al padre malato, ciò mostra che anch'egli avrà il morbo di Huntington. La grandezza dei frammenti CAG si correlano con l'età dell'insorgenza della malattia. Siccome il padre ha mostrato la malattia a 40 anni, e il figlio 6 ha la stessa grandezza del frammento, possiamo prevedere che probabilmente svilupperà la malattia al raggiungimento dei 40 anni.

78 Il morbo di Huntington I dati qui sotto mostrano il risultato dell'elettroforesi di frammenti amplificando con la PCR le sonde usate per il sito che risulta alterato nel morbo di Huntington. Il genitore maschio, contrassegnato dal quadrato nero, ha sviluppato il morbo di Huntington all'età di 40 anni: I suoi figli con il morbo di Huntington incluso il 6 (3,5,7,8,10,11), e l'età alla quale si sono avuti i primi sintomi, sono indicati dal numero sotto la banda della frazione ottenuta per PCR Qual'è la prognosi per i figli normali 4,6, e 9?

79 DNA fingerprinting Un importante campo di applicazione è rappresentato dall amplificazione di siti ipervariabili del genoma umano, dove esistono numerose regioni polimorfiche, incluse molte sequenze ripetute in tandem, la cui esatta sequenza differisce da individuo a individuo (a parte i gemelli monozigoti). Queste sequenze possono essere sfruttate per una tipizzazione fine in molti modi. Il più semplice e diffuso deriva dalla generazione di RFLP (restriction fragment lenght poliformism) che si ottengono digerendo genomi diversi con uno o più enzimi di restrizione, spesso associati all utilizzo di sonde marcate. I profili di restrizione che si ottengono variano da individuo a individuo e sono noti come DNA fingerprints. Una variante importante di questa tecnica utilizza la PCR per amplificare sequenze a ripetizione variabile (VNTR) utilizzando primers fiancheggianti. Anche in questo caso queste si può ottenere una mappa individuale (fingerprinting) utilizzata in svariate applicazioni forensi e medico legali. Una ulteriore variante all utilizzo della PCR per amplificare VNTR consiste nella cosidetta RAPD-PCR ( random amplified polimorphic DNA) che si basa sull utilizzo di primers casuali a bassa omologia. Anche in questo caso si ottengono profili di amplificazioni caratteristici da individuo a individuo.

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82 Applicazioni forensi Negli eucarioti superiori i geni rappresentano solo una piccola parte del genoma, che è prevalentemente costituito da DNA intergenico. Tra queso una parte importante è costituita da elementi ripetuti disposti in tandem detti satelliti Tipo di ripetizione Ripetizione per locus Numero di loci Lunghezza ripetizione Satellite per cromosoma Minisatellite Migliaia per genoma Microsatellite Fino a 105 per genoma 1-6 La distribuizione casuale e l estrema variabilità di queste sequenze in tandem VNTR (variable number tandem repeat le rendono molto utili per le tipizzazioni genetiche,

83 regione a lunghezza ipervariabile (VNTR) individuo A individuo B VNTR 1 cromosomi omologhi VNTR 2 A B

84 I VNTR sono molto utili nei test di paternità e nelle cause giudiziarie, perché permettono di Comparare velocemente campioni di DNA anche in assenza di informazioni sulle sequenze Nelle prime applicazioni sonde VNTR multiple venivano ibridate in esperimenti Southern a dare dei profili di DNA ( DNA fingerprinting) sostanzialmente unici da individuo a individuo. Questa applicazione richiede abbondante materiale di partenza ed è attualmente usato prevalentemente nelle analisi di paternità. Nel tipico esempio esempio accanto permette di risolvere facilmente un caso di paternità dubbia

85 L utilizzo di sonde multilocus dà pattern complessi da cui è facilmente possibile escludere un caso dubbio, ma più difficile provarlo. L uso di sonde VNTR molocus è possibile è da risultati ancora più certi. Inoltre la possibilità di amplificazione con PCR rende queste tecniche rapide e veloci. Variabilità di un singolo VNTR tra individui L applicazione di queste tecniche a casi di polizia giudiziaria implica, quasi sempre la presenza di referti difficili come capelli, tracce di sangue secco, tracce di sperma ecc. In questi casi sono prevalentemente utilizzati singoli VNTR, che vengono amplificati per PCR e, successivamente ibridati per Southern

86 Esempi di Fingerprinting di DNA utilizzato in un casi di stupro

87 Testo di riferimento: "Dai geni ai genomi" 2^ edizione italiana, di Jeremy W. Dale e Malcom von Schantz EdiSES Per questa lezione consultare il capitolo 8 Testi di approfondimento generale: "Genomi 2" T.A.Brown 2004 EdiSES