TAPPE STORICHE DEL CONCETTO DI MALATTIA

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1 TAPPE STORICHE DEL CONCETTO DI MALATTIA Patologia d organo (Morgagni) Patologia cellulare (Virchow, microscopia ottica) Relazione fra malattia e lesione anatomopatologica Relazione fra alterata funzione e difetto di cellule o tessuti Patologia metabolica Relazione fra alterata funzione e alterazioni (biochimica) biochimico-metaboliche Patologia subcellulare (microscopia elettronica e biochimica frazioni subcellulari) Patologia molecolare (Relazioni genotipo-fenotipo) Relazione fra alterata funzione e difetto a livello di organelli e strutture sopramolecolari Relazioni fra alterata funzione e difetto a livello di singola molecola Medicina molecolare Genomica e post-genomica

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4 REGOLAZIONE DELLA TRASCRIZIONE I

5 REGOLAZIONE DELLA TRASCRIZIONE II

6 REGOLAZIONE DELLA TRASCRIZIONE III

7 Controllo trascrizionale del gene della Globina

8 Controllo trascrizionale di geni fotoresponsivi

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10 TRADUZIONE

11 Zinc Finger Helix Loop Helix Leucine Zipper Lamda Repressor FENOMENI COTRADUZIONALI/ POST-TRASCRIZIONALI IMPORTANZA DEL FOLDING

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14 CLASSIFICAZIONE DEI FATTORI DI TRASCRIZIONE

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16 ALTERAZIONI DELLA MOLECOLA DI DNA ROTTURA: - ossidazione - idrolisi delezioni, inversioni, traslocazioni MODIFICAZIONI DI SEQUENZA: modificazioni di sequenza - mutazioni puntiformi aminoacidica, frameshift, splicing - microdelezioni INTRODUZIONE DI SEQUENZE: alterazioni qualitative e/o - mutagenesi inserzionale quantitative del trascritto - amplificazione EPIGENETICHE: - configurazione cromatina, - metilazione, acetilazione, ecc. alterata espressione genica

17 Meccanismi di alterazioni del DNA Agenti che danneggiano il DNA Radicali dell ossigeno: rottura scheletro, ossidazione basi azotate - endogeni (mitocondri, reticolo, perossisomi) - esogeni (xenobiotici, farmaci, alimenti, fumo, ecc) Radiazioni - UV: formazione di dimeri di purine - radiazioni ionizzanti: danno diretto alle basi azotate e formazione di radicali liberi Chimici ambientali e farmacologici: rottura scheletro, mutazioni puntiformi, depurinazione, metilazione, addotti agenti alchilanti analoghi delle basi puriniche e pirimidiniche metaboliti reattivi che formano addotti covalenti Agenti virali: mutagenesi inserzionale

18 Tipi di danno al DNA Mismatches per errori di replicazione del DNA (errori DNA polimerasi) Modificazioni di una o più basi in qualsiasi posizione Alterazione della metilazione genica (ipo/iperespressione del gene) Rotture (radiazioni e chimici) della singola o della doppia elica con possibilità di delezioni e traslocazioni Cross-links, legami covalenti tra le basi (chemioterapici) delle due catene Formazione di addotti covalenti con molecole esogene Errori dell appaiamento dei cromosomi Non disgiunzione cromosomica Alterazione dei meccanismi di riparazione del DNA

19 Meccanismi di alterazioni del DNA Meccanismi spontanei Il DNA subisce cambiamenti continuamente: A. Depurinazione: Rottura per idrolisi spontanea dei legami delle purine con il desossiribosio (perdita di circa 5000 purine al giorno /cellula umana). B. Deamminazione: idrolisi spontanea del gruppo amminico con trasformazione della citosina a uracile (frequenza di circa 100 basi al giorno) B. IDROLISI IDROLISI A. IDROLISI influenzate da fluttuazioni termiche

20 Meccanismi di alterazioni del DNA Danni causati da agenti alchilanti Agenti alchilanti (carcinogeni ambientali o chimici) attaccano preferenzialmente adenina e guanina (purine) rendendo più labile il legame con il deossiribosio e favorendo la depurinazione. La replicazione del DNA apurinico può generare una mutazione per sostituzione casuale della base. Altri agenti alchilanti, come l ethylmetane sulfonate (EMS) agiscono trasferendo gruppi etilici e metilici al DNA, causando disappaiamento delle basi.

21 Meccanismi di alterazioni del DNA Danni causati da raggi ultravioletti Radiazioni UV agiscono sul DNA, provocando cross-link tra pirimidine adiacenti, con formazione di dimeri di timina (preferibilmente), che bloccano la replicazione del DNA. Alternativamente, questa può procedere e le basi relative vengono inserite casualmente, risultando in una mutazione La capacità di mutagenesi degli UV spiega perchè inappropriata ed esagerata esposizione fa aumentare il rischio dei tumori della pelle.

22 Meccanismi di alterazioni del DNA Danni causati da raggi gamma e X, radicali liberi I raggi gamma e X oltre ad interagire direttamente con la molecola del DNA, ionizzano molecole vicine, come l acqua, provocando la formazione di radicali liberi I radicali liberi contenenti ossigeno sono estremamente reattivi ed attaccano immediatamente la molecola di DNA, alterando le basi per ossidazione e provocando frequentemente la rottura della singola o della doppa elica. Questo secondo evento è molto difficile da riparare e causa frequentemente mutazioni Inoltre le radiazioni ionizzanti possono provocare anche rottura di cromosomi

23 Meccanismi di riparazione del DNA Nonostante le migliaia di modificazioni casuali create ogni giorno nel DNA di una cellula umana dall energia del calore, da incidenti metabolici, da fattori esterni, etc. si accumulano soltanto pochi cambiamenti stabili (mutazioni) Meno di un cambiamento accidentale per mille nel DNA provoca una mutazione, mentre il resto viene eliminato con notevole efficienza dai meccanismi di riparazione del DNA Esistono numerosi meccanismi di riparazione, catalizzati da una serie di enzimi diversi Quasi tutti questi meccanismi dipendono dalla presenza di due copie dell informazione genetica, una su ciascun filamento di DNA Se la sequenza di un filamento viene accidentalmente cambiata, l informazione resta nella sequenza di nucleotidi dell altro filamento.

24 Gli effetti delle alterazioni del DNA dipendono dal tipo e dall efficienza dei sistemi di riparazione. Correzione degli errori durante la replicazione Correzione del danno degli agenti alchilanti Riparazione per rimozione e sostituzione di una singola base Correzione degli accoppiamenti sbagliati Riparazione mediante escissione di nucleotidi Riparazione della rottura della doppia catena

25 Gli effetti delle alterazioni del DNA dipendono dal tipo di cellula in cui si verificano Nelle cellule germinali: - malattie genetiche trasmissibili (I e II generazione) Nelle cellule somatiche proliferanti (staminali) - malattie malformative (durante lo sviluppo) - tumori Nelle cellule somatiche non proliferanti (differenziate) - contributo a degenerazione ed invecchiamento - alterato ricambio dei componenti cellulari

26 Mutazioni Lesioni accidentali avvengono continuamente nel DNA - cambiamenti spontanei - cambiamenti indotti da eventi danneggianti La maggior parte di questi cambiamenti sono temporanei perchè vengono corretti da processi di riparazione del DNA. Quando questi processi falliscono, si ha un cambiamento permanente nel DNA: mutazione Se il cambiamento avviene in un punto vitale della sequenza, che codifica per un gene, o che ne regola l espressione: mutazione genica

27 MUTAZIONI GENICHE

28 IL CODICE GENETICO

29 MUTAZIONI PUNTIFORMI

30 MODALITA DI MUTAZIONE

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38 Da genotipo a fenotipo

39 Da genotipo a fenotipo

40 ALTERAZIONI QUALITATIVE perdita o guadagno di funzione ALTERAZIONI QUANTITATIVE aumento o diminuzione

41 PATOLOGIA MOLECOLARE DELLE PROTEINE ASSENZA ACCUMULO STRUTTURA ANOMALA Mutazione genica Alterazione della trascrizione Alterazioni della maturazione e/o dello splicing (comprende stabilità mrna e/o espressione genica da sirna - microrna, antisenso, ecc..) Alterazioni della traduzione Alterazioni post-traduzionali (folding, interazioni molecolari, glicosilazione, idrossilazione, fosforilazione, proteolisi, modificazioni lipidiche): PROTEOMICA

42 CLASSIFICAZIONE DELLE MALATTIE DA ALTERAZIONE DI UN SINGOLO GENE IN BASE AL MECCANISMO D AZIONE DELLA PROTEINA MUTATA 1) DIFETTI DI PROTEINE ENZIMATICHE 2) DIFETTI DEI RECETTORI DI MEMBRANA E DEI SISTEMI DI TRASPORTO 3) DIFETTI DEI RECETTORI NUCLEARI 4) DIFETTI DI PROTEINE NON ENZIMATICHE 5) DIFETTI CHE COMPORTANO UN ALTERATA REAZIONE AI FARMACI

43 DIFETTI DI PROTEINE ENZIMATICHE Catalizzatori che aumentano la velocità delle reazioni chimiche Specificità di substrato Piccole quantità Sito attivo Alterazione qualitativa Alterazione quantitativa DEFICIT ENZIMATICO

44 SUBSTRATO Enzima 1 PRODOTTO INTERMEDIO 1 Enzima 2 PRODOTTO INTERMEDIO 2 Ciclo metabolico alternativo Enzima 3 PRODOTTO FINALE

45 A B D ACIDO IDROSSIFENILPIRUVICO ALCAPTONURIA ACIDO MALEILACETICO E ACIDO OMOGENTISICO ACIDO FUMARILACETACETICO ACIDO IDROSSIFENILACETICO ACIDO IDROSSIFENILLATTICO TIROSINOSI ACIDO FUMARICO ACIDO ACETACETICO A FENILALANINA IDROSSILASI B PEROSSIDASI C FUMARILACETATO IDROSSILASI D TIROSINASI C E OMOGENTISICO OSSIDASI

46 FENILALANINA IDROSSILASI (PAH) (fegato, rene, pancreas)

47 FENILCHETONURIA Numerose varianti Fenilchetonuria classica (PKU): carenza di PAH (98-99%) Alte concentrazione di fenilalanina nel sangue e nelle urine. Attivazione di vie metaboliche alternative con formazione di acido fenillattico, acido fenilperuvico, fenilacetico, acido o- idrossi fenilacetico. Sudorazione con classico odore di muffa o di topo

48 FENILCHETONURIA CLASSICA Ritardo mentale (QI >50-60 in meno del 4%); incapacità a parlare e camminare; convulsioni; ipopigmentazione di occhi, cute, peli; eczema. Quadro clinico prevenuto da dieta povera di fenilalanina nei primi 30 giorni di vita: test in neonati Regime dietetico continuo Fenilchetonuria materna: effetto teratogeno Alterazioni cerebrali progressive durante lo sviluppo causate da: Iperfenilaninemia (saturazione dei siti di fissazione e assorbimento degli aa per sintesi proteica cerebrale e mielina e competizione su tirosinasi per sintesi melanine) Carenza di tirosina Carenza amine biogene: dopamina, serotonina, noradrenalina (acido fenilpiruvico che inibisce enzimi)

49 Diverse mutazioni che inibiscono l attività di PAH dal 50 al 100% Quadro clinico in base ad attività enzimatica residua 13 esoni Mutazioni in tutti gli esoni e nelle flanking regions Mutazioni: Missenso Non senso Splicing alternativo Frameshift Delezioni inserzioni

50 EMOGLOBINOPATIE Disordini delle emoglobine Alta diffusione Elevata morbidità Meccanismi patogenetici noti a livello molecolare Mutazioni strutturali dell emoglobina Alterazioni dell espressione genica delle globine (a e b)

51 FUNZIONE DELL EMOGLOBINA Trasporto di ossigeno nei globuli rossi (6 isoforme) STRUTTURA DELL EMOGLOBINA Molecola tetramerica a struttura globulare Subunità uguali due a due SUBUNITA 1 catena polipeptidica: GLOBINA 1 gruppo prostetico: EME

52 GLOBINA: - struttuta ad alfa-eliche (7-8) conservate - nicchia idrofobica (EME) - regione di interazione con altre subunità EME: - pigmento (protoporfirina) contenente ferro che si combina con l ossigeno Modificazioni allosteriche :movimento critico nel contatto alfa1 e beta2 +/- O2 SITI CONSERVATI IN TUTTE LE GLOBINE F8 CD1 (istidina):legame covalente con il ferro dell eme (fenilalalnina): incastro della porfirina dell eme nella sua tasca

53 ISOFORME DELLE GLOBINE 6 DIVERSE ISOFORME PRODUZIONE EQUIMOLARE Periodo di sviluppo (switch temporale) Combinazioni delle subunità 2 globine a e z 2 globine b o g o d o e 2 famiglie di geni (asimili e b-simili) Duplicazione genica

54 CROMOSOMA 16 CROMOSOMA 11 5 z Hb f embrionale z2 e2 e 5 Sacco vitellino yz z2 g2 Gg ya1 ya2 a2 a1 a2 e2 Hb fetale a2 g2 Hb adulta a2 d2 Ag yb d b Fegato fetale Midollo osseo 3 a2 b2 3

55 EMOGLOBINA ADULTA Globina b2 Globina b1 Hb A a b a2 b2 141 aa 146 aa E6 EME Fe E6 Movimento critico a1 : b2 nel passaggio tra stato ossigenato a deossigenato PM EME Fe Globina a1 Globina a2 DOSAGGIO GENICO e MALATTIA 4 geni a 2 geni b Corredo diploide Alterazioni b globina (50%) Alterazioni a globina (25%) malattia postnatale malattia fetale e post-natale

56 EMOGLOBINOPATIE 1. VARIANTI STRUTTURALI: alterazioni della struttura della globina, senza alterazione della sintesi 2. TALASSEMIE: diminuzione della sintesi di una o più globine ---> sbilanciamento delle quantità relative (a : b) 3. HPFH Persistenza ereditaria dell emoglobina fetale

57 1. VARIANTI STRUTTURALI Mutazioni puntiformi Mutazioni più complesse di uno dei geni strutturali delle globine A. Varianti che causano ANEMIA EMOLITICA alterazioni delle proprietà fisiche di Hb - HbS - HbC Emoglobine instabili - Hb Hammersmith B. Emoglobine con ALTERAZIONI del TRASPORTO di O2 - Hb M - Hb Kempsey - Hb Kansas C. Varianti a fenotipo TALASSEMICO - Hb E - Hb Lepore

58 ALTERAZIONI PROPRIETA FISICHE DELLE Hb EMOGLOBINA S (Hb S) Anemia falciforme o drepanocitosi autosomica recessiva Clinica (omozigosi) - anemia emolitica - epato - splenomegalia - infezioni ripetute - crisi di gonfiore alle estremità Eterozigosi: rischio in condizioni rarissime Distribuzione geografica alta frequenza in Africa equatoriale (vantaggio selettivo sulla malaria) Alterazione genica mutazione missense A --> T codone 6 b globina sostituzione Acido glutammico (E) con Valina (V) (polare) (non polare)

59 PATOGENESI DELL ANEMIA FALCIFORME BASI MOLECOLARI mutazione A ---> T sostituzione Glu ---> Val, codone 6 globina b BASI FISICHE b O2. interazione Val con sito idrofobico dell altra catena (eliche E ed F) in condizioni di bassa tensione di Aggregazione in fibre e precipitati allungati BASI CELLULARI Alterazioni citoscheletriche e FALCIZZAZIONE Alta tensione di O2 Bassa tensione di O2 T VAL HbS GAT GLU Hb A2/B2

60 CONSEGUENZE: 1. Emolisi splenica 2. Occlusione vasale

61 ALTRE MUTAZIONI DELLA SUPERFICIE DELLA MOLECOLA EMOGLOBINA C (Hb C) Disordine emolitico lieve BASI MOLECOLARI: Mutazione puntiforme codone 6 Glu ---> Lys solubilità ----> cristallizazione riduzione della deformabilità degli eritrociti Hb SC: anemia emolitica più lieve dell a. falciforme complicanze per occlusione vascolare retinopatia

62 EMOGLOBINE INSTABILI Hb denaturate ----> corpi di Heinz EMOGLOBINA HAMMERSMITH Autosomica dominante Cartteristiche cliniche: anemia emolotica grave cianosi: Basi molecolari: mutazioni puntiformi codone 42 globina b Sost. Phe ----> Ser Phe42 residuo CD1 Alterazione tasca dell EME Instabilità di Hb Affinità per O2

63 VARIANTI CON ALTERATO TRASPORTO DI O2 METEMOGLOBINE (Hb M) Autosomica dominante OSSIEMOGLOBINA DESOSSIEMOGLOBINA Fe +2 stato ridotto (ferroso) METEMOGLOBINA (non lega O2) Fe +3 stato ossidato (ferrico) Spontaneo Metemoglobina reduttasi

64 Mutazioni (a o b) tasca dell eme Ferro resistente a Metemoglobina reduttasi Caratteristiche cliniche Eterozigoti asintomatici cianosi omozigoti letale Esempio: emoglobina HIDE PARK b92 His ---> Tyr (residuo F8)

65 EMOGLOBINE CON ALTERATA AFFINITA PER O2 Interfaccia a1 b2: scorrimento catene + O2 Forma rilassata - O2 Forma tesa Mutazioni interfaccia a1 b2 Esempi: Hb Kempsey Hb Kansas Effetti molecolari e clinci opposti Hb Kensey Hb Kansas b 99 Asp ----> Asn ---> Rilassata b 102 Asn ----> Thr ---> Tesa affinità per O > 02 nei tessuti Policitemia affinità per O2 Asintomatica, cianosi

66 VARIANTI CON FENOTIPO TALASSEMICO Emoglobina E (Hb E) autosomica recessiva alta frequenza eterozigosi composta con b talassemia mutazione b 26 Glu ---> Lys alterazione di splicing 60% % Omozigosi: asisntomatici o lieve anemia

67 Emoglobina Lepore (fusione) catena non a N-ter aa d C-ter aa b MEIOSI: crossing over ineguale tra d e yb Gg Ag d b/d b Anti Lepore b/d Gg Ag d yb b Gg Ag Gg Ag d/b Lepore d/b b talassemia di grado variabile

68 TALASSEMIE Disordine monogenico più comune Riduzione livelli di sintesi globine a o b Alterazione del rapporto a : b Globina in eccesso relativo Precipitazione ANEMIA EMOLITICA Diminuzione di Hb ANEMIA IPOCROMICA MICROCITICA

69 a-talassemia b-talassemia Distrubuzione geografica: MEDITERRANEO AFRICA CENTRO-ORIENTALE INDIA ASIA Vantaggio selettivo degli eterozigoti contro la MALARIA

70 ALFA - TALASSEMIE Difetti Hb fetali ed adulte Hb H = b4 HB Barth = g4 condizione clinica Geni a funzionali Genotipo Catena a normale 4 aa/aa 100% silente 3 aa/a- 75% Tratto a-talassemico (anemia lieve, microcitosi) 2 aa/-- a-/a- 50% Hb H (anemia emolitica, moderatamente grave) a-talassemia omozigote (idrope fetale Hb Bart) 1 a-/-- 25% 0 --/-- 0% --/aa frequente sud-est asiatico ----> OMOZIGOSI

71 BASI MOLECOLARI DELLE a - TALASSEMIE Delezioni del gene ALTA FREQUENZA Crossing-over ineguale a1/a2 ya1 a2 a a1 Complesso gene a triplicato ya1 a2 a1 ya1 a2 a1 ya1 a Complesso gene a singolo Rari soggetti normali con triplo a

72 Forme mutate non delete Mutazione del codone di stop Esempio: EMOGLOBINA CONSTANT SPRING Arg Stop CGU UAA.. UAA CGU CAA... UAA Arg Gln Stop 31 aa in più ---> alterazioni sito di poliadenilazione ---> RNA instabile

73 BETA - TALASSEMIE Difetti emoglobina adulta Patologia post-natale (prima dei 2 anni) Diminuzione b > anemia ipocromica microcitemia sbilanciamento a : b Aumento relativo a > emolisi periferica eritropoiesi inefficace a2 d2 Hb A2 aumentata a2 g2 Hb F aumentata Sopravvivenza selettiva sottopopolazioni di globuli rossi Grande variabilità genetica degli alleli omozigoti eterozigoti composti (+ frequente) TALASSEMIA MAJOR eterozigoti TALASSEMIA MINOR Lieve anemia Microcitemia Globuli rossi ipocromici

74 TALASSEMIA MAJOR (Morbo di Cooley) b 0 b + no Hb A piccole quantita di Hb A FENOTIPO CLINICO Anemia emolitica post-natale (emolisi intramidollare e periferica) Difetti di crescita Splenomegalia Grossa espansione midollo osseo FACIES TALASSEMICA Zigomi sporgenti e mascelle prominenti Ittero Emocromatosi Globuli rossi ipocromici e variabili in forma e grandezza TRASFU SIONI TRAPIANTO DI MIDOLLO OSSEO TERAPIA GENICA?

75 BASI MOLECOLARI DELLE b -TALASSEMIE DELEZIONI (infrequenti) TALASSEMIE SEMPLICI Hb Lepore Delezione 619 bp Indiani Asiatici TALASSEMIE COMPLESSE Grosse delzioni di più geni del cluster TALASSEMIA db 0 TALASSEMIA gdb 0 severe delezione db db 0 ( 17 % Hb F) HPFH Persistenza dell emoglobina fetale Stato benigno (a2 b2) Non avviene switch post-natale Hb F persiste e compensa Hb A HPFH senza delezioni Mutazioni promotore gene g (CAAT Box) Clinicamente normali

76 ALTERAZIONI SEQUENZE CODIFICANTI RNA NON FUNZIONALE Mutazioni non senso (b 0 ) Cod 39 CAG ---> UAG gln Stop Sardegna Mutazioni con scivolamento del codice di lettura Delezione 1 base codone 16 senso (b 0 ) Trp Gly Lys Val Asn UGG GGC AAG GUG AAC UGG GCA AGG UGA Trp Ala Arg stop Stop codone 18

77 ALTERAZIONI DELLO SPLICING 1. GIUNZIONI INTRONE / ESONE (b 0 ) Introne 2 Esone 3 CAG / CTC CGG / CTC Accettore 2. NUOVO SITO DI SPLICING (b + ) Introne I GG > AG 10 % Uso di siti di splicing criptici (introne 2)i % Proteina alterata +19 nucleotidi --> stop Proteina più lunga 3. Hb E (b +, b E ) 60% Hb A 40% Hb E

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80 Struttura dei recettori per le LDL