BIOTECNOLOGIE ANIMALI APPLICAZIONI

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1 BIOTECNOLOGIE ANIMALI APPLICAZIONI Mutazioni

2 Gene dell ipertrofia muscolare (doppia coscia) nei bovini da carne Mutazione puntiforme gene che determina l ipertrofia muscolare nei bovini, carattere noto come doppia coscia. Si manifesta in diverse razze bovine: la razza nella quale è stato studiato in maniera più approfondita e da più lungo tempo è la Blu Belga; tra le razze italiane esso è presente nella razza Piemontese e anche in quella Marchigiana. A livello fenotipico, gli animali con il carattere doppia coscia, presentano: a) una ipertrofia muscolare generalizzata di circa il 20%, ma localizzata in prevalenza nel treno posteriore, mentre tutti gli altri organi sono di dimensioni ridotte; b) tessuto muscolare con contenuto adiposo ridotto sino al 40% ed anche minore contenuto di tessuto connettivo, caratteri entrambi apprezzati dal consumatore; c) indice di conversione alimentare inferiore del 9% rispetto alla norma; d) aumento delle distocie (+15%) a causa del maggiore peso alla nascita ed alla conformazione dei vitelli.

3 Locus responsabile del carattere della doppia coscia: identificato a livello genomico nel gene della miostatina (GDF8) enzima che esercita una funzione di regolazione negativa sullo sviluppo delle masse muscolari e che nel bovino è localizzato sul cromosoma 2. Negli animali portatori, la miostatina non svolge bene la sua azione di contenimento dello sviluppo delle masse muscolari Un aspetto interessante di questo gene è che le variazioni genetiche che hanno causato la formazione dell allele responsabile dell ipertrofia muscolare non sono le stesse nelle differenti razze.

4 Razza Piemontese: l allele che determina il carattere doppia coscia è dato dalla mutazione alla posizione 938 del terzo esone, con una sostituzione di una Guanina con una Adenina: tale sostituzione causa nella proteina una sostituzione alla posizione 313 di un AA tirosina con un AA cisteina, con susseguente inattivazione della funzionalità della proteina e quindi comparsa dell ipertrofia muscolare. Razza Blu Belga: esiste una delezione di una sequenza di 11 basi ( ) nel terzo esone del gene della miostatina che determina una prematura interruzione nella fase di traduzione. Razza Marchigiana: individui ipertrofici mostrano una transversione Guanina Timina in posizione 874, con conseguente cambiamento di un codone che codificava l acido glutammico in un codone di stop della traduzione. Mutazione fa si che parte della proteina ricca in cisteina (6 aa), non venga tradotta con conseguente perdita dell attività della proteina stessa.

5 Marchigiana Blu Belga Piemontese

6 Un applicazione importante in campo zootecnico degli RFLPs riguarda l individuazione del polimorfismo al locus della k-caseina (k-cn) nella specie bovina. Le varianti genetiche più diffuse di questa caseina sono due: A e B. La variante B conferisce al latte una superiore attitudine alla caseificazione. Dal latte prodotto da vacche omozigoti BB si ottiene, rispetto a quello prodotto da vacche AA, una resa in Parmigiano Reggiano superiore del 10%. Pertanto, ai fini del miglioramento genetico delle caratteristiche qualitative del latte destinato alla caseificazione si dovrebbe mirare all aumento della frequenza dell allele B della k-cn.

7 Elettroforesi del latte genotipo al locus k-cn femmine Inconveniente superato tecnica degli RFLPs. La sequenza di DNA che codifica per l allele A della k-cn presenta un sito di taglio per l endonucleasi PstI, mentre quella che codifica per l allele B ne è priva. Bovino omozigote BB con l enzima PstI e poi evidenziamo la regione del genoma che contiene il gene della k-caseina, otterremo un tracciato con un frammento di DNA lungo 4600 coppie di basi (4.6 kb). Se invece digeriamo il DNA di un bovino omozigote AA, poiché in questo è presente il sito di taglio per PstI, otterremo due frammenti, uno di 4.3 kb ed uno di 0.3 kb, originatisi dal taglio del frammento di 4.6 ad opera dell enzima PstI. L eterozigote AB li avrà tutti e tre.

8 K-caseina

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10 BIOTECNOLOGIE ANIMALI APPLICAZIONI Aberrazioni

11 Polimorfismo della caseina alfa s1 nei caprini Inserzione e/o delezione: polimorfismo al locus della caseina alfa s1 (as1-cn) nella specie caprina Latte caprino elettroforesi 7 diversi alleli (caseina alfa s1) associate differenze quantitative contenuto proteina

12 Abbiamo infatti: degli alleli forti (A, B e C) che sono associati ad un contenuto elevato di caseina alfa-s1 nel latte (3,6 grammi litro); una capra omozigote (AA o BB o CC) contenuto in caseina alfa s1 nel latte di circa 7,2 grammi litro un allele intermedio (E), associato ad un contenuto intermedio di as1- cn (1,6 g/l) capra omozigote EE avrà 3,2 grammi/litro di as1-cn, mentre una eterozigote AE, ad esempio, avrà 5,2 (3,6+1,6) grammi litro di as1-cn due alleli deboli (F e D) associati ad un contenuto basso (0,6 g/l) di as1-cn nel latte un allele nullo (0) che non produce as1-cn nel latte capre omozigoti 00 producono un latte privo di as1-cn

13 Varianti associate ad elevati contenuti di as1-cn abbiano una frequenza elevata nelle razze rustiche Presenza è abbastanza ridotta nelle razze specializzata ad elevato livello produttivo, come la Saanen o l Alpine, dove invece prevalgono gli alleli associati a contenuti ridotto o intermedio

14 Le varianti A, B, C e D sono costituite da 199 aminoacidi Si differenziano fra loro per delle sostituzioni aminoacidiche, Alleli E ed F presentano una delezione di 11 e 37 aminoacidi Mutazioni responsabili della riduzione di 37 aminoacidi nell allele F è dovuta ad una serie di mutazioni a livello dei siti che controllano il congiungimento delle sequenze esoniche durante il meccanismo di maturazione del mrna. Cellule del tessuto secernente della ghiandola mammaria di capre omozigoti FF presentano diversi tipi di mrna della as1-cn (almeno 9), la maggior parte dei quali deriva da un meccanismo anomalo di maturazione e sono prive di tre esoni (9, 10 e 11).

15 Delezione 11 aa (E) Delezione 37 aa (F) 199 aminoacidi

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18 Quantità di mrna trascritto dall allele F risulta circa 6 volte inferiore a quella trascritta dall allele A. Anomalo processo di maturazione del mrna due inserzioni (di 11 e 3 coppie di basi) all interno del nono introne e delezione di un singolo nucleotide nell esone 9. Allele E inserzione di un segmento di circa 500 coppie di basi nell esone 19, segmento che viene trascritto in mrna e che determina una riduzione del tasso di sintesi proteica. Allele nullo delezione di un segmento di 8000 coppie di basi (probabilmente contiene gli ultimi 8 esoni) compromette totalmente la funzionalità del gene

19 L attuale utilizzo degli strumenti molecolari in Italia per i bovini da latte Cosa si fa attualmente con i marcatori molecolari? 1. Diagnosi di parentela 2. Varianti proteiche del latte 3. Caratteri recessivi 4. Fattore rosso

20 Diagnosi di parentela Animali attualmente sottoposti alla diagnosi di parentela: Tutti i tori avviati alla FA (test sul padre e sulla madre) Tutti gli animali provenienti da ET Vacche partecipanti a mostre nazionali Stalle di nuova iscrizione (controllo a campione)

21 Diagnosi di parentela - metodica 1. Gruppi sanguigni: vengono analizzati, con questa metodica, su richiesta, quegli animali i cui genitori non hanno genotipo DNA depositato 2. MICROSATELLITI Microsatelliti analizzati: BM1824, BM2113, ETH3, ETH10, ETH225, INRA023, SPS115, TGLA227, TGLA53, TGLA122, TGLA126, AGLA293, BM1818, CYP21, INRA005, MGTG4B, SPS113, TGLA53, TGLA57 International Panel of Microsatellites for Cattle Parentage Testing (ISAG Panel)

22 Varianti proteiche del latte 1. Esistono diversi tipi di proteine del latte: K-caseine β-lattoglobulina 2. Vantaggi nella caseificazione 3. K-caseine: esistono due varianti alleliche principali A e B 4. Le ricerche hanno dimostrato che la variante B è la + favorevole

23 Varianti proteiche del latte 1. Considerato il fatto che l 80% del latte prodotto in Italia è destinato alla produzione di formaggio, può essere importante x l allevatore conoscere il genotipo degli animali che sta usando 2. La frequenza allelica dipende dalla razza Frisona Bruna

24 Varianti proteiche del latte 1. L ANAFI esegue il test su tutti i tori avviati alla FA e su tutte le vacche rank 98 (miglior 2 %) Frequenza allelica?

25 Varianti proteiche del latte vacche rank 98 (miglior 2 %)

26 Varianti proteiche del latte tori avviati alla FA

27 Varianti proteiche del latte Rapporto tra EBV medi tori FA e genotipo per le K- caseine

28 Varianti proteiche del latte Razza BRUNA 3x > razza Frisona

29 inbreeding (% ) Caratteri recessivi Blup Animal model Italian Holstein Inbreeding trend birth year BLAD Mulefoot CVM

30 Caratteri recessivi: Complex Vertebral Malformation

31 Caratteri recessivi: Razza Frisona: BLAD ( Bovine Leukocyte Adhesion Deficiency ) DUMPS (Deficiency of Uridine Monophosphate Synthase ) CVM ( Complex Vertebral Malformation ) MULE FOOT CITRULLINEMIA Razza Bruna: WEAVER o PDME (Progressive Degenerative Myeloencephalopathy ) SMA( Spinal Muscular Atrophy )

32 Caratteri recessivi: BLAD compromette la sintesi di alcune proteine di membrana dei leucociti, che risultano cosi incapaci di assolvere il proprio ruolo nel contrasto delle infezioni Candidate gene approach (Uomo): gene CD18 2 mutazioni puntiformi 1. Sostituzione dell acido aspartico con la glicina nell aminoacido 128 (allele D128G) 2. Mutazione silente

33 Caratteri recessivi: BLAD I leucociti non sono quindi in grado di aderire alle pareti venose prossime all aerea colpita

34 Caratteri recessivi: BLAD L enzima di restrizione TaqI riconosce la sequenza tcga e taglia la sequenza tra i nucleotidi T e C

35 Caratteri recessivi: BLAD Gel di Agarosio (BLAD PCR con TaqI)

36 Caratteri recessivi: BLAD Frequenza portatori : US Holstein: 15 % dei tori di FA, 8 % delle vacche Italia: 8 % dei tori di FA La comparsa di questa anomalia può essere ricondotta ad un toro nato nel 1952 : Osborndale Ivanhoe. Uno dei suoi discendenti portatori (Carlin-M Ivanhoe Bell) è stato uno dei tori + utilizzati nel mondo!

37 Bovine Leucocytes Adhesion Deficiency BLAD

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39 Caratteri recessivi: CVM Identificata in Danimarca nel 2000 (Agerholm, J.S., Bendixen, C., Andersen, O., Arnbjerg, J., Complex vertebral malformation in Holstein calves. J. Vet. Diagn. Invest. 13, ) Il feto omozigote recessivo viene abortito o soccombe precocemente a causa di gravissime anomalie nello sviluppo della colonna vertebrale ed un ridotto sviluppo corporeo (nanismo). Carlin-M Ivanhoe Bell!

40 Caratteri recessivi: CVM Doppio danno economico: 1. Perdita del vitello 2. Problemi riproduttivi nella madre con eventuale eliminazione per riduzione della produzione [Nilesen et al. Livestock Production Science 79 (2003) ]

41 Caratteri recessivi: CVM Linee di azione: 1. Identificare ed eliminare i portatori? 2. Identificare e segnalare i portatori? Kuhn et al. (J. Anim Sci. Vol. 88, Suppl. 1: T39) 1. Non si evidenziano differenze produttive tra vacche portatrici e non 2. Eliminare l allele non dovrebbe avere conseguenze negativi sui livelli produttivi

42 Caratteri recessivi: CVM ANAFI Linea morbida : 1. Tori già in FA: Testati ed identificati tutti i soggetti che presentano un ascendente riconducibile ad Ivanhoe Bell 2. Tori avviati alla FA: Testati tutti i soggetti che presentano un ascendente riconducibile ad Ivanhoe Bell. Se portatori non possono essere adibiti alla F.A. 3. Possibilità di utilizzare un filtro nel Software Programma di Accoppiamento

43 Caratteri recessivi: CVM PAC e CVM

44 Caratteri recessivi: identificazione l approccio utilizzato per il CVM viene utilizzato anche nel caso degli altri caratteri: Si testano tutti i tori con un portatore tra gli ascendenti. Se portatore e avviato alle prove di progenie, non autorizzato alla FA portatore non portatore CVM CV TV SINDATTILISMO EREDITARIO o PIEDE DI MULO o MULE-FOOT MF TM BLAD BL TL ACONDROPLASIA (BULL-DOG) BD BT

45 Fattore rosso melanociti OLMO PREL.TUGOLO MF TL G.M.** Eumelanina (nera) Feomelanina (rossa) AL.PAR. F. SAFETY RED ET TV TL

46 Fattore rosso OLMO PREL.TUGOLO MF TL G.M.** 2 locus coinvolti: AL.PAR. F. SAFETY RED ET TV TL Extension: codifica per recettore melanocortico 1 (MSHR o MC1R) Agouti

47 Fattore rosso Nero OLMO PREL.TUGOLO MF TL G.M.** AL.PAR. F. SAFETY RED ET TV TL 2 locus coinvolti: Una mutazione (delezione) puntiforme altera la funzione del MC1R Rosso

48 Fattore rosso OLMO PREL.TUGOLO MF TL G.M.** POSAL CORKY ROYALIST TV TL RF AL.PAR. F. SAFETY RED ET TV TL Anomalie: BC = animali rossi ma eterozigoti Black-red (Telstar Red) Cosa spinge un allevatore ad utilizzare un Rosso?

49 Fattore rosso Fattore rosso marcatore associato alla produzione? Differenze non significative