Corso di Laurea Triennale in Biotecnologie per la salute. Biochimica clinica. Le proteine plasmatiche

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1 Corso di Laurea Triennale in Biotecnologie per la salute Biochimica clinica Le proteine plasmatiche

2 Le proteine (dal greco protos: principale) Sono sostanze organiche formate da aminoacidi uniti con legame peptidico e da composti, diversi dagli aminoacidi (carboidrati nelle glicoproteine, lipidi nelle lipoproteine, ecc.) legati con legame covalente La luciferina delle lucciole L emoglobina degli eritrociti La cheratina di capelli, squame, corna, lana, unghie

3 Le proteine sieriche Sono costituite da una mescolanza di specie molecolari diverse per natura chimica, origine e funzioni in particolare, nel siero si trovano: proteine semplici, costituite unicamente da aminoacidi, come l albumina proteine complesse o coniugate nelle quali sono presenti zuccheri, lipidi o loro derivati, legati alla catena proteica con legame di natura covalente e, quindi, sufficientemente stabile

4 Caratteristiche chimico-fisiche In base alla solubilità, le proteine sieriche sono frazionabili in: Albumine, solubili in acqua Globuline, solubili in soluzioni saline In condizioni fisiologiche,le proteine sieriche costituiscono una soluzione colloidale* sufficientemente stabile Tale soluzione diventa progressivamente instabile quando la concentrazione dell albumina è al di sotto del 50% del totale e la frazione globulinica aumenta. *contenente sostanze diverse tra loro presenti in uno stato finemente disperse. Es.: il latte è costituito da una soluzione acquosa di sali, carboidrati, lipidi " in emulsione e una miscela di proteine in dispersione colloidale.

5 Funzioni biologiche delle proteine plasmatiche Alcune proteine rivestono precise funzioni biologiche nel plasma: Funzione nutritiva (frazione albuminica) Capacità tampone (nonostante l effetto tampone dovuto all emoglobina sia preponderante, le proteine plasmatiche ne prendono parte) Coagulazione e fibrinolosi (molte proteine coinvolte sono già presenti allo stato attivo nel plasma, altre sono in uno stato inattivo o vengono liberate in conseguenza alla cascata emocoagulativa) Fattori di difesa (immunoglobuline e fattori del complemento) Funzioni di trasporto (le proteine plasmatiche rendono biodisponibili molte sostanze insolubili in acqua-lipidi ormoni steroidei, vitamina, bilirubina, sostanze tossiche, farmaci, alcuni metalli, creando con le stesse dei lagami differenti per affinità e specificità Mantenimento della pressione colloidoosmotica (l albumina, sia per la sua concentrazione che per il basso peso molecolare, gioca un ruolo chiave nella distribuzione dei fluidi extracellulari) Altre proteine, come gli ormoni, alcuni enzimi, presentano una localizzazione plasmatica transitoria, ma non esplicano funzioni biologiche.

6 Sintesi Sono sintetizzate prevalentemente dal fegato, ad eccezione delle immunoglobuline (sintetizzate dalle plasmacellule), di alcuni costituenti del sistema del complemento (sintetizzati dai macrofagi), di alcune lipoproteine (sintetizzate dalle cellule intestinali) e da altre proteine endoteliali. Nel plasma sono contenuti 6-8 g/dl di proteine immunoglobuline Fattore VIII Cellule di Kupffer del fegat

7 Le proteine plasmatiche sono in equilibrio dinamico con le componenti dei tessuti e dei liquidi biologici La sintesi delle proteine plasmatiche è influenzata da fattori ormonali (tiroxina e cortisolo aumentano la velocità di sintesi dell albumina), stato nutrizionale e condizioni generali di salute. Presentano un turnover peculiare per ogni frazione e sono degradate ed eliminate, principalmente, a livello epatico e gastrointestinale

8 La concentrazione totale delle proteine è determinata da: Fattori primari Velocità di sintesi proteica Aumento (ipergammaglobulinemia e paraproteinemia) Diminuzione (malnutrizione, malassorbimento, sindromi epatiche, immunodeficienze) Velocità di rimozione Aumento (perdita di proteine, stati catabolici) Volume del plasma Diminuzione (disidratazione) Aumento (eccessiva idratazione, aumento della permeabilità capillare) Fattori secondari Posizione al momento del prelievo Presenza di flebo Aumenti transitori di permeabilità capillare (setticemia o infiammazioni) Stasi: Aumento di proteine totali, ferro, lipidi, colesterolo, alcuni enzimi, bilirubina Diminuzione di potassio Diffusione di fluidi dalla circolazione all interstizio

9 Può essere accelerato per: " Aumento delle perdite (emorragie, proteinuria, ustioni, ecc.) Turn-over proteine totali g al giorno " Aumento del consumo in condizioni di esaltata funzione biologica di alcune frazioni (aptoglobina nelle anemie emolitiche, fibrinogeno nella coagulazione, ecc.) " Aumento del catabolismo nelle cellule dei tessuti (albumina e transferrina nelle flogosi e neoplasie)

10 Volume di distribuzione " La concentrazione di proteine plasmatiche è influenzata dalla postura: un aumento del 10% si ha, in 30 min, quando si passa dalla posizione supina a quella eretta. " Ciò dipende dall aumentata diffusione dei liquidi dal comparto vascolare a quello interstiziale. Il paziente in ortostatismo ha una concentrazione ematica di alcuni analiti più alta rispetto al paziente degente Link Standardizzazione del prelievo del campione biologico ê condizioni che possono influenzare i risultati analitici ê postura

11 Standardizzazione del prelievo del campione biologico E noto che il prelievo va effettuato sul paziente riposato e a digiuno da almeno 6-8 ore, ma ci sono numerose condizioni che possono influenzare i risultati analitici. 1. Alimentazione 2. Postura 3. Attività fisica 4. Azione farmacologica e metabolica 5. Ritmi cronobiologici 6. Metodo di prelievo

12 Postura Riposo a letto (pz. degenti) e ortostatismo (pz ambulatoriali) influenzano la concentrazione di numerose sostanze Il paziente in ortostatismo ha una concentrazione ematica di alcuni analiti più alta rispetto al paziente degente Esempio I seguenti analiti risultano più ELEVATI NEI PZ AMBULATORIALI Emoglobina Proteine totali Sostanze legate a proteine Calcio, colesterolo, bilirubina

13 Funzioni principali in cui sono implicate le proteine Regolazione della distribuzione dei liquidi fra sangue e tessuti Pressione osmotica e oncotica o colloidale Genesi dell edema tissutale

14 La distribuzione dei liquidi corporei L acqua è il costituente principale dell organismo il contenuto in acqua del corpo umano corrisponde al % del peso corporeo nell uomo e al 55-60% nella donna La quantità di acqua totale tende a diminuire con l età: nel bambino e nell adolescente, infatti, l acqua totale costituisce una quota maggiore.

15 L acqua totale è distribuita in due compartimenti: Intracellulare Extracellulare intravasale extravasale/interstiziale Il volume di questi compartimenti è determinato in gran parte dalla pressione osmotica dei suoi soluti. volemia

16 In condizioni normali il volume dei diversi compartimenti è mantenuto entro ben determinati valori, anche se c è uno scambio costante, dalla pressione osmotica* dei vari soluti/elettroliti (proteine plasmatiche, Na +, K + ). Le membrane biologiche, infatti, si comportano come delle membrane semipermeabili**. *Osmosi: è quel processo per il quale si verifica il flusso di acqua da una soluzione più diluita verso una soluzione più concentrata nel caso che esse siano separate da una membrana semi-permeabile. Il flusso di acqua si ferma solo quando le concentrazioni dei soluti nelle due soluzioni si eguagliano (la pressione osmotica è uguale). **Membrana semi-permeabile: permette il passaggio del solvente ma non dei soluti. Elettroliti: particelle cariche positivamente o negativamente (ioni positivi-cationi- o negativi-anioni) presenti nelle soluzioni. Sono i principali soluti dei liquidi dell organismo e, quindi, regolano la pressione osmotica di questi fluidi. Determinano il volume di ogni compartimento e più precisamente: PROTEINE PLASMATICHE (>albumina) COMPARTIMENTO INTRAVASALE Na + COMPARTIMENTO INTERSTIZIALE K + COMPARTIMENTO INTRACELLULARE

17 Lo scambio di liquido tra plasma sanguigno e liquido interstiziale è regolato dalla legge di Starling. Legge di Starling: la quantità di liquido che filtra all esterno all estremità arteriolare dei capillari equivale all incirca alla quantità di liquido che viene riassorbita all estremità venulare. Quindi, il bilancio normale dei liquidi è mantenuto da due gruppi opposti di forze: 1) Quelle che causano USCITA di liquido dal letto vascolare: a. pressione idrostatica intravasale b. pressione osmotica del liquido interstiziale 2) Quelle che causano ENTRATA di liquido nel letto vascolare: a. pressione osmotica delle proteine plasmatiche (pressione oncotica) Questo è vero per circa il 90% del liquido. Il restante 10% viene drenato dai vasi linfatici per poi tornare nel circolo sanguigno.

18 Edema È l accumulo di liquido in eccesso negli spazi interstiziali (intercellulari) e nelle cavità del corpo (idrotorace, idropericardio, ascite-idroperitoneo). L edema polmonare (il liquido che riempie alveoli polmonari ostacola scambio ossigeno e facilita infezioni) e quello cerebrale possono provocare morte Può ostacolare la riparazione delle ferite e la risoluzione di infezioni

19 Trasudato: liquido povero di proteine che risulta dall ultrafiltrazione del plasma attraverso la parete capillare. Responsabile dell edema che si verifica nei disturbi emodinamici. Essudato: liquido ricco di proteine dovuto all aumentata permeabilità endoteliale. Responsabile dell edema infiammatorio. Quando la natura della raccolta di liquido non è chiara si parla di versamento.

20 Il segno della fovea l edema si riconosce premendo con una certa forza un dito sulla cute: si forma una piccola infossatura fossetta

21 L edema può essere: a) localizzato ostruzione venosa localizzata (ingessature stretta, trombo venoso) ostruzione linfatica (linfedema) (post-operatoria-iatrogena, paraplegia) edema infiammatorio acuto (segni della flogosi, fossetta assente) b) generalizzato aumento della pressione idrostatica (scompenso cardiaco) riduzione della pressione oncotica delle proteine plasmatiche ipoproteinemia- (sindrome nefrosica)

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23 Utilità delle proteine in biochimica clinica Rivestono una posizione strategica a causa delle strette relazioni tra il metabolismo proteico del fegato e quello degli altri organi e tessuti Sono facilmente analizzabili e consentono di ottenere informazioni sul metabolismo proteico dell intero organismo Per esempio: del fegato, che produce la maggior parte delle proteine dei reni, in quanto in condizioni patologiche le proteine possono essere perse con le urine; del sistema immunitario (le gamma globuline possono essere diminuite nelle immunodeficienze o aumentate nel mieloma multiplo).

24 Alterazioni delle proteine del plasma Alterazioni nella concentrazione plasmatica delle proteine possono riscontrarsi sia in condizioni patologiche a carico del metabolismo proteico, sia in situazioni che alterano la volemia. il valore assoluto della concentrazione non è indicativo, e NON riflette generalmente le variazioni quantitative di singole entità proteiche

25 La concentrazione è sempre dipendente da due fattori: La quantità del soluto La quantità del solvente La concentrazione di una soluzione di zucchero può essere aumentata: diminuendo il volume del solvente (b) aumentando la quantità del soluto (c)

26 L aumento delle proteine totali può essere causato da: Disidratazione o processi di emoconcentrazione sia fisiopatologici che legati a fenomeni di stasi durante il prelievo: in questi casi si ha un aumento proporzionale di tutte le frazioni proteiche Un aumento delle gamma-globuline, in alcune malattie croniche (es., cirrosi epatica, malattie autoimmuni) Presenza di proteine abnormi (derivate da cloni unicellulari).

27 La diminuzione delle proteine totali è un fenomeno di più frequente riscontro, e può essere causata da: Durante la gravidanza, a causa dei fenomeni di iperidratazione, si riscontra una diminuzione della protidemia generale, che però non indica una diminuzione delle proteine in senso assoluto. Una reale diminuzione della protidemia si riscontra in seguito a diminuita sintesi proteica (per insufficiente apporto proteico alimentare, malassorbimento, ecc.), o ad aumentata perdita proteica (attraverso il rene, l intestino, per emorragie, in seguito ad ustioni o neoplasie).

28 Distribuzione delle proteine plasmatiche negli spazi interstiziali Il contenuto proteico dei liquidi extravascolari è variabile, in quanto è legato alla composizione proteica del plasma, al peso molecolare delle proteine, alla permeabilità della parete capillare, all eventuale stasi locale di proteine In condizioni fisiologiche, le plasmaproteine si distribuiscono negli spazi extravascolari (nel liquido interstiziale, sinoviale e cerebrospinale, nelle cavità sierose e nel liquido intraoculare) in condizioni di equilibrio con il pool plasmatico.

29 Mentre, in condizioni patologiche tale equilibrio è spostato e provoca una anomala distribuzione proteica, dovuta a: Modificazioni idrostatiche Modificazioni osmotiche Aumento della permeabilità capillare

30 Modificazioni osmotiche L ipoproteinemia, e in particolare l ipoalbuminemia, provoca una diminuzione del gradiente osmotico tra il plasma e i tessuti e quindi un movimento di H2O verso gli spazi interstiziali

31 Modificazioni idrostatiche L aumento della pressione arteriosa capillare, della pressione venosa o l ostruzione dei vasi linfatici provoca un movimento di H2O verso gli spazi interstiziali

32 Aumento della permeabilità capillare tipica delle patologie infiammatorie Se l integrità anatomica-capillare è preservata, il liquido extravascolare presenta un modesto contenuto in proteine e si parlerà si trasudato per capillari gravemente danneggiati, si riscontra un incremento spiccato della quota proteica e si parlerà di essudato, caratterizzato da una concentrazione proteica superiore a g/l, aspetto giallo/dorato/paglierino, vischioso con fiocchi di fibrina essudato

33 Dosaggio delle proteine Proteine totali Albumina Routine biochimica Proteine specifiche Indagini speciali

34 Modulo di richiesta indagini biochimiche Proteine specifiche Elettroforesi delle proteine

35 Sangue intero Plasma Siero Tipologia di campione

36 Proteine totali Il laboratorio di biochimica misura le concentrazioni di proteine totali e albumina in un campione di siero. Le variazioni nella concentrazione totale di proteine sono frequenti Paraprotinemia Disidratazione o Emoconcentrazione Cambiamenti posturali Aumento delle gamma-globuline Proteine abnormi Bassa concentrazione di albumina Iperidratazione (gravidanza) Diminuita sintesi Perdita renale, intestinale, nelle ferite o nelle ustioni

37 Elettroforesi delle proteine plasmatiche Le principali frazioni proteiche vengono separate in base alla loro diversa velocità di migrazione su gel (di acetato di cellulosa o di agarosio) nel caratteristico tracciato a cinque bande, poi sottoposto a lettura densitometrica Permette di ottenere la loro separazione qualitativa e la loro analisi quantitativa Albumina A α1 α2 β γ α1-antitripsina α2-macroglobulina aptoglobina Immunoglobuline Transferrina C3 del complemento

38 Elettroforesi delle proteine Si definisce la migrazione di particelle dotate di carica elettrica attraverso un mezzo fluido e sotto l influenza di un campo elettrico Studio delle macro molecole al fine di ottenere la loro separazione qualitativa e la loro analisi quantitativa Mobilità elettroforetica Massa molecolare Conformazione della proteina Punto isoelettrico (pi)

39 Elettroforesi zonale Supporto solido inerte Separazione in bande o zone Colorazione delle bande Quantificazione delle bande

40 Acetato di cellulosa Non presenta fenomeni di adsorbimento Alto potere risolutivo Tempi brevi di esecuzione Tempi brevi di colorazione Elettroforesi su acetato di cellulosa Molecole con carica netta positiva catodo (-) Molecole con carica netta negativa anodo (+) La mobilità elettroforetica dipende da: Intensità del campo elettrico Coefficiente frizionale (dimensione e carica della particella) Colorazione e quantificazione Colorazione che lega specificatamente le proteine del plasmatiche Quantificazione mediante densitometria

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42 Elettroforesi delle proteine del siero Campione: prelievo di sangue venoso (provetta da siero) sottoposto ad una centrifuga che separa la frazione corpuscolata dalla parte liquida (siero). Tecnica: le proteine sottoposte ad un campo elettrico costante, tendono a migrare verso il polo positivo con una differente velocità di migrazione (direttamente proporzionale alla carica elettrica ed inversamente proporzionale alla massa molecolare), dividendosi in bande o zone di migrazione. Siero, non plasma, per eliminare l interferenza del fibrinogeno Separazione delle proteine in base alla loro carica

43 I tracciati elettroforetici, una volta colorati, sono letti mediante il densitometro: le bande proteiche vengono trasformate in picchi di diversa altezza, a base larga o stretta a seconda della loro intensità di colorazione e della loro larghezza, che rispecchiano la quantità proporzionale delle diverse proteine contenute nel siero. Sul protidogramma normale si ritroveranno quindi diversi picchi e curve

44 Sul protidogramma di un soggetto normale si ritroveranno quindi diversi picchi e curve: il primo, più alto e stretto è quello di albumina, seguito da quello molto basso di α1 globuline, e da quelli di α2, di β1, di β2 globuline; al termine del grafico si vanno a posizionare le γ globuline con una curva bassa e larga.

45 Aumenti o diminuzioni in altezza o nel numero di tali picchi, sono quindi da mettere in relazione all aumento o alla diminuzione patologica o fisiologica delle proteine che le compongono. Esempi di tracciati anomali

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47 Raccomandazioni Per l analisi sono raccomandati campioni freschi. I sieri devono essere prelevati seguendo le procedure convenzionali per i test clinici di laboratorio. I sieri vanno refrigerati (2-8 C) e si possono conservare fino ad una settimana. Se necessitano periodi di conservazione più lunghi mantenere i campioni congelati (fino ad un mese).

48 CAMPIONI DA EVITARE - Non utilizzare campioni di siero emolizzati - L'emolisi causa un aumento delle zone alfa-2 e beta. - Evitare campioni di plasma - Evitare campioni vecchi o mal conservati o francamente lipemici Variazioni relative a erroneo campionamento Si possono verificare falsi aumenti di β globuline per migrazione di plasma, anzichè di siero: il fibrinogeno migra tutto in zona β2 causando un aumento proporzionalmente rilevante, ma non patologico, di queste proteine. Situazione simile si ha anche con la migrazione di campioni sierici emolizzati o lipemici: sia l emoglobina, sia le lipoproteine vanno infatti a posizionarsi tutte in zona β causandone un aumento più o meno importante.

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61 Quadro proteico elettroforetico (PQ) Prealbumina Albumina α-1 globuline α-2 globuline Β globuline γ globuline Albumina g/dl α1 α g/dl g/dl β g/dl γ g/dl

62 Tracciato elettroforetico normale 1. La banda A corrispondente all albumina 2. La banda α1 corrispondente all α1 antitripsina 3. La banda α2 costituita da due proteine: α2-macroglobulina e l aptoglobina 4. La banda costituita nella parte anodica dalla transferrina e nella parte catodica dalla frazione C3 del complemento 5. La banda γ rappresentata dalla maggior parte delle immunoglobuline

63 Aumenti o diminuzioni in altezza o nel numero dei picchi del protidogramma sono quindi da mettere in relazione all aumento o alla diminuzione patologica o fisiologica delle proteine che li compongono Più proteine si trovano in una banda, più alto sarà il rispettivo picco L altezza corrisponde grosso modo alla quantità totale di proteine appartenenti ad una categoria, ma se per esempio delle gamma globuline (immunoglobuline IgA, IgD, IgE, IgG, IgM) si vuole sapere la quantità di ognuna delle diverse classi, si dovrà ricorrere al dosaggio individuale.

64 Prealbumina g/l 2.7% proteine totali Varia con l età Trasporto aminoacidi, farmaci, ormoni, vitamine Marker stato nutrizionale Aumento: patologie renali acute (sindrome nefrotica) Diminuzione: denutrizione, patologie epatobiliari, stati infiammatori

65 Albumina Valori di riferimento: 3,6-4,9 g/dl È la proteina più abbondante della frazione sieroproteica Viene sintetizzata e secreta dal fegato Tempo di persistenza: circa 20 giorni Le funzioni principali sono: il mantenimento della pressione oncotica Il trasporto di acidi grassi, bilirubina, ormoni e farmaci

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68 Nel siero la misura viene impiegata nella pratica clinica per la valutazione degli stati disprotidemici, ma va tenuto presente che l unica variazione clinicamente significativa è la sua diminuzione, la sua concentrazione plasmatica può aumentare infatti solo per emoconcentrazione. Disidratazione Emoconcentrazione Infusione di albumina Insufficiente apporto Ridotto assorbimento Perdita Ridotta sintesi Ipercatabolismo Emodiluizione L ipoalbuminemia è responsabile di ipoprotidemia, poiché costituisce da sola il 55-64% delle proteine plasmatiche totali

69 L ipoalbuminemia può essere dovuta a varie cause: diminuita sintesi (disfunzione epatica o dieta povera di proteine) alterata distribuzione tra il compartimento ematico e gli spazi extravascolari a causa di un aumento della permeabilità capillare in caso di shock settico e dopo interventi di chirurgia perdita verso l esterno come nella sindrome nefrosica, ustioni o enteropatia essudativa processi infiammatori, in cui la sintesi dell ALB è down regolata in favore delle proteine della fase acuta gravidanza per aumento del volume plasmatico di circa il 40% disordini congeniti della sintesi albuminica

70 Le 4 cause principali che derminano abbassamento della concentrazione di albumina plasmatica.

71 1) Distribuzione anomala l albumina può distribuirsi nello spazio interstiziale per effetto di un aumentata permeabilità capillare, nella risposta alla fase acuta dell infiammazione (in presenza di citochine infiammatorie, Tumor necrosis factor, interleuchine..)

72 2) Sintesi diminuita Può essere dovuta a malnutrizione, malassorbimento, malattia epatica cronica nello stadio avanzato Profilo normale Cirrosi

73 3) Diluizione Si può generare un ipoalbuminemia per effetto di una sovraidratazione, Es., in condizioni parafisiologiche come gravidanza e allattamento per effetto della ipervolemia

74 4) Escrezione anomala o degradazione Tra le cause principali ci sono la compromissione renale, ustioni, enteropatia con perdita di proteine, ferite, emorragia, stati catabolici

75 Indicazioni per la richiesta Nei pazienti emodializzati quale fattore di adeguatezza terapeutica Nei pazienti con mieloma multiplo per la stadiazione della malattia Nei pazienti candidati alla terapia sostitutiva con albumina umana per il calcolo della dose di albumina da somministrare e per il monitoraggio della terapia marcatore di danno renale acuto Scarsamente sostenute da evidenze, ma utilizzate nella pratica clinica: valutazione della funzionalità epatica, valutazione della perdita proteica

76 Alfa1-globuline Valori di riferimento: 0,2-0,4 g/dl Tale frazione elettroforetica esprime principalmente il comportamento dell α1-glicoproteina, dell α1-fetoproteina, dell α1-lipoproteina Gravidanza Malattie infettive Malattie infiammatorie croniche Infarto del miocardio Neoplasie Carenza congenita di α1-antitripsina Sclerodermia Sindrome nefrosica

77 Alfa1-antitripsina (AAT) Valori di riferimento: 0,8-2 g/l Importante inibitore delle proteasi e delle elastasi dei neutrofili nell infiammazione e nella necrosi dei tessuti Banda α g/l Glicoproteina monomerica Sintetizzata dal fegato Inibitore delle elastasi dei neutrofili Aumento: sindrome nefrotica, epatopatie terminali, pancreatiti acute, fase acuta dell infiammazione Diminuzione: difetti congeniti, trattamento con steroidi anabolizzanti, estrogeni o gravidanza

78 Il deficit di Alfa1-antitripsina (AATD) è un disordine autosomico recessivo, che aumenta il rischio di sviluppare alcune patologie tra le quali: BPCO, enfisema cirrosi, carcinoma epatico La patogenesi dell AATD è direttamente correlata alle mutazioni del gene SERPINA1, che è altamente polimorfico. Sono state infatti identificate più di 120 varianti genetiche strettamente associate a specifici livelli plasmatici della proteina che vengono così ereditati in maniera codominante.

79 le varianti di AAT sono state classificate in tre gruppi principali: varianti normali (caratterizzate da concentrazioni plasmatiche di AAT entro i valori di riferimento della popolazione generale) varianti deficitarie (caratterizzate da ridotte concentrazioni plasmatiche ed associate ad un aumentato rischio di sviluppo di patologie polmonari ed epatiche) varianti Null (indicate come Q0, caratterizzate da concentrazioni plasmatiche non rilevabili ed associate ad un forte rischio di enfisema).

80 Deficit di Alfa1-antitripsina OMOZIGOSI per l allele Z (diminuzione del 15%) Si può manifestare con: Epatite neonatale Epatite cronica con negatività dei marker Cirrosi epatica nell adulto Enfisema polmonare nella seconda-terza decade di età ETEROZIGOSI (diminuzione del 60%) Si può manifestare con suscettibilità a malattie polmonari

81 Il deficit di AAT: un esempio di diagnostica integrata BIO&BIO Il parametro più importante per la verifica di AATD, ed in particolare della presenza del rischio di un danno polmonare, è la misura della concentrazione plasmatica della proteina (esame quantitativo) Tuttavia la caratterizzazione precisa degli alleli deficitari di cui i pazienti AATD sono portatori (esame qualitativo) può facilitare la valutazione del rischio di patologia epatica

82 Indicazioni per la richiesta I casi in cui sia ragionevole il sospetto di deficit di AAT, e quindi l esecuzione di esami quantitativi e qualitativi sono i seguenti: Enfisema precoce (prima dei 45 anni di età) Enfisema in assenza di fattori di rischio riconosciuti (fumo, esposizione occupazionale a polveri) Enfisema con prominente iperdiafania radiologica alle basi Epatopatia altrimenti inspiegabile, in età pediatrica e nell adulto Panniculite necrotizzante Vasculite C-ANCA Storia familiare di almeno uno tra: enfisema, bronchiectasie, epatopatia non altrimenti spiegabile Bronchiectasie senza eziologia evidente Familiari di primo grado di un paziente con AATD accertato

83 Alfa1-fetoproteina Valori di riferimento: <5 mg/l Sintetizzata dal fegato È presente nei tessuti e nel plasma del feto, la sua concentrazione cala dopo la nascita in gravidanza Usata per il monitoraggio delle terapie anti-neoplastiche

84 Aumento di Alfa1-fetoproteina Nel liquido amniotico e nel siero materno: Anencefalia Spina bifida Epatocarcinoma Teratoma testicolare Diminuzione di Alfa1-fetoproteina Successo terapeutico antineoplastico Trisomia del cromosoma 21 (Sindrome di Down)

85 Alfa2-globuline Valori di riferimento: 0,4-0,8 g/dl Tale frazione elettroforetica esprime principalmente il comportamento dell α2-macroglobulina, dell aptoglobina, dell antitrombina III, protrombina, ceruloplasmina, colinesterasi, pre-β-lipoproteine Infezioni acute batteriche Traumi Interventi chirurgici Infarto del miocardio Neoplasie Epatopatie croniche Diabete mellito Sindrome di Down Epatite virale Collagenopatie Pancreatite

86 Alfa-2-macroglobulina (AMG) Valori di riferimento: 1,5-4 g/l È un potente inibitore delle proteasi (come la tripsina, la callicreina plasmatica, la trombina, la plasmina) e quindi, rappresenta un importante punto di collegamento tra le svariate attività enzimatiche che interessano i sistemi della coagulazione e quelli fibrinolitici. Costituisce circa 1/3 delle alfa 2 globuline Sindrome nefrosica, per ritenzione selettiva legata alle dimensioni molecolari Gravidanza (circa del 20% in più) Età senile Fase acuta dell infiammazione Pancreatiti Carcinoma della prostata, perché si lega al PSA

87 Aptoglobina glicoproteina sintetizzata nel fegato composta da 4 catene polipeptidiche: 2 catene leggere alfa e 2 catene pesanti beta svolge una azione antiossidante e di scavenger per l emoglobina libera, rilasciata in seguito al normale turnover eritrocitario o in seguito a processi emolitici Banda α g/l Dimero dell emoglobina libera Aumento: stati infiammatori, infezioni e disordini autoimmuni per stimolo delle citochine proinfiammatorie Diminuzione: in caso di aumentato turnover dell emoglobina

88 Indicazioni per la richiesta Diagnosi differenziale delle anemie (emolitiche vs non emolitiche) la misura di APT è considerata un indice affidabile di emolisi intravascolare

89 Ceruloplasmina (CER) Valori di riferimento: 0,2-0,4 g/l viene prodotta nel fegato È dotata di modesta attività ossidasica verso alcune sostanze di natura aminica e fenolica Veicola il rame, legando fino a otto atomi di rame per molecola, controllandone l omeostasi epatica agisce sulla regolazione dello stato ionico del ferro e di altri ioni metallici, e attraverso la sua attività ferroossidasica ossida il ferro++ a ferro+++ esercita un azione antiossidante inibendo l ossidazione catalizzata dagli ioni metallici sui lipidi di membrana.

90 Le diminuzioni della concentrazione ematica di CER clinicamente significative sono causate da difetto di sintesi ereditario, peraltro molto raro o da deficit secondari, quali quelli riscontrati nella Malattia di Wilson, nella Sindrome di Menkes e nelle diete povere di rame. la sintesi della proteina è estrogeno-dipendente e quindi concentrazioni elevate della proteina si trovano in gravidanza e in corso di somministrazione di estrogeni in menopausa Morbo di Wilson (CER <50 mg/l ) Gravidanza Assunzione di anticoncezionali Infezioni acute Neoplasie (leucemie)

91 Beta-globuline Valori di riferimento: 0,6-1 g/dl Tale frazione elettroforetica esprime principalmente il comportamento della transferrina, C3, proteina C reattiva, β2-microglobulina, β-lipoproteine, Ig Talora è possibile osservare uno sdoppiamento in frazioni β1 e β2 β1: transferrina, comlpemento e Ig β2: microglobuline, lipoproteine e IgM Gravidanza Cirrosi epatica Sindrome nefrosica A-beta-lipoproteinemia congenita Atransferrinemia congenita Enteropatie essudative

92 Transferrina (Tf) Valori di riferimento: 3-3,5 g/l è una glicoproteina di 80 kda sintetizzata nel fegato e ha un emivita di 8-10 giorni. è composta di una singola catena polipeptidica che forma due lobi ognuno dei quali dispone di un sito di legame specifico per uno ione ferrico (Fe3+) La sintesi della Tf, e quindi la sua concentrazione plasmatica, sono modulate principalmente dallo stato metabolico del ferro e sono inversamente proporzionali alla quantità di ferro disponibile nell organismo. È deputata al trasporto del ferro nel plasma ai siti di deposito (fegato e cellule reticolo-endoteliali). Quando l elettroforesi viene realizzata in un tampone contenente ioni Ca++ è possibile osservare uno sdoppiamento in frazioni β1 e β2 β1: transferrina

93 La concentrazione plasmatica della Tf e la saturazione della transferrina (TS), da essa derivata, sono parametri usati nella valutazione dello stato marziale. il parametro consigliato da utilizzare nella pratica clinica è la TS piuttosto che la semplice concentrazione plasmatica di Tf. La TS è uno storico marcatore utilizzato nella diagnosi e nel monitoraggio sia dello stato di carenza marziale Sindromi protidodisperdenti Anemie (per neoplasia): poiché il complessofe-transferrina viene captato dal sistema reticolo-endoteliale Epatopatie: per diminuzione della sintesi epatica Stati ferrocarenziali Gravidanza Terapia estro-progestinica

94 β-2-microglobulina (B2M) è una proteina di basso peso molecolare (12 kda) appartiene al sistema maggiore di istocompatibilità di classe I (MHC I o antigene di classe I), costituito da glicoproteine espresse sulla superficie di gran parte delle cellule nucleate I linfociti B presentano elevati livelli di MHC I Banda β g/l

95 la forma solubile della molecola, presente in circolo, rappresenta il turnover delle cellule che esprimono MHC I. La B2M passa il filtro glomerulare ed è riassorbita per oltre il 99% dal tubulo contorto prossimale. Pertanto, nel soggetto sano la proteina è presente nell urina in tracce. <1% nelle urine rispetto a quella plasmatica La concentrazione plasmatica di B2M dipende sia dal turnover dei linfociti B che dalla velocità di filtrazione glomerulare, poiché il catabolismo della proteina è quasi interamente renale.

96 Aumento: insufficienza renale, infiammazione o neoplasia B2M riflette ad un tempo la massa tumorale e la funzionalità renale!!!! Indicazioni per la richiesta valutazione iniziale del paziente con gammapatia monoclonale a rischio intermedio o elevato di progressione per mieloma multiplo stadiazione del mieloma multiplo indice prognostico nei pazienti con linfoma La determinazione della B2M nell urina è fortemente sconsigliata a causa della rapida degradazione della proteina a ph acido sia in vivo (in vescica) che in vitro (nel contenitore di raccolta)

97 Frazione C3 del Complemento Valori di riferimento: 3-3,5 g/l Quando l elettroforesi viene realizzata in un tampone contenente ioni Ca++ È possibile osservare uno sdoppiamento in frazioni β1 e β2 β2: C3 Con il termine di Complemento si comprendono un insieme di proteine, alcune delle quali con attività enzimatica, che insieme agli Anticorpi svolgono un ruolo di primaria importanza nei meccanismi di difesa dell immunità umorale. Malattie autoimmuni Anemia emolitica, perché si determina consumo del complemento Epatiti Blocco del suo catabolismo in cirrosi biliare primitiva, Colestasi grave Fase acuta (dopo 5-6 giorni)

98 Il complemento Il complemento è costituito da una ventina di proteine circolanti capaci di interagire con le membrane biologiche e con specifici recettori situati sulla superficie di diversi tipi cellulari, hanno la capacità di opsonizzare i patogeni e di indurre una serie di reazioni infiammatorie che aiutano a combattere le infezioni. Ci sono tre distinte vie attraverso cui il complemento può essere attivato sulla superficie dei patogeni: la via classica, la via MB-lectin (mannan-binding lectin) e la via alternativa. Le tre vie convergono in una via finale comune che porta alla attivazione del complesso di attacco alla membrana o MAC (membrane attack complex) costituita da una struttura multiproteica lipofila a forma di poro che provoca la lisi cellulare.

99 Variazioni del C3 Aumenti del C3 Diminuzione del C3 Reazioni della fase acuta Deficit genetico Ostruzione biliare e cirrosi Glomerulonefrite poststreptococcica biliare Glomerulosclerosi focale Malattie del collagene (30% dei pazienti) Anemie autoimmuni Epatite Batteriemie

100 Proteina C-reattiva Banda γ <0.005 g/l In condizioni normali è assente Monitoraggio infiammazione acuta Aumenta dopo circa 2 ore dallo stimolo infiammatorio fino a raggiungere un picco massimo alle 48 ore

101 Gamma-globuline Valori di riferimento: 0,9-1,4 g/dl Comprendono le Immunoglobiline (G, M, A, D, E) È un gruppo di proteine eterogenee che migrano principalmente nella zona γ Costituiscono gli anticorpi umorali in grado di facilitare la distruzione degli antigeni estranei all organismo da parte del sistema immunitario Sono sintetizzate e secrete dalle plasmacellule (derivanti dai linfo B) Poichè la frazione IgG, in condizioni normali, è prevalente sulle altre, la banda delle γ- globuline è rappresentata soprattutto dalle IgG

102 Un aumento delle γ-globuline può essere distinto nei quadri della gammopatia policlonale o monoclonale Policlonale: con aumento di molte classi di immunoglobuline Epatopatie croniche (epatite cronica, cirrosi epatica) Infezioni congenite Infezioni batteriche acute e croniche Parassitosi Monoclonale: con aumento di un unico tipo di immunoglobulina Malnutrizione Ustioni Terapia immunosoppressiva Sindrome nefrosica

103 Gammapatia policlonale La stimolazione di numerosi cloni di plasmacellule da parte di antigeni o virus epatotropi induce l incremento di diverse classi di Immunoglobuline All elettroforesi le gammapatie policlonali sono caratterizzate da un incremento diffuso ed eterogeneo della frazione γ a globuline In alcuni casi nelle malattie infettive si può avere aumento isolato di una classe di immunoglobuline, che non è diagnostico ma può contribuire alla diagnosi differenziale IgM: fase precoce di infezione IgG: contatto con un antigene già noto IgA: danno epatico (alcool, contraccettivi orali)

104 Gammapatia monoclonale a globuline Derivano da proliferazione clonale maligna o potenzialmente maligna (mentre i policlonali da processi infiammatori) Sono caratterizzate da: 1. Iperproliferazione di un clone di cellule della linea linfocitaria B, in assenza di uno stimolo antigenico dimostrabile 2. Sintesi di immunoglobuline omogenee per struttura e caratteristiche antigeniche 3. Deficit a carico delle immunoglobuline normali Elettroforesi: Picco monoclonale a banda stretta

105 Ipogammaglobulinemia La concentrazione delle immunoglobuline aumenta progressivamente fin dalla nascita. La diminuzione della sintesi di immunoglobuline è clinicamente associata ad una ridotta resistenza alle infezioni. Si distinguono deficit immunitari: primitivi (globali o parziali) secondari (a infezioni, neoplasie, trattamento con farmaci, ) a globuline Elettroforesi: È facilmente riconoscibile quando riguarda le tre classi; il contrario se l immunodeficienza è selettiva È quindi necessario integrare con altri esami, es: conteggio e classificazione in sottopopolazioni dei linfociti circolanti

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107 Proteine specifiche La misura di alcune proteine specifiche può fornire informazioni utili nella diagnosi e nel trattamento terapeutico Nome della proteina Funzione Scopo del dosaggio α1-antitripsina Inibitore delle proteasi Ridotta in caso di deficit dell α1antitripsina Ceruloplasmina Enzima ossidante Ridotta nel Morbo di Wilson Proteina C reattiva Coinvolta nella risposta immunitaria Aumenta nelle patologie acute, es. infezioni Aptoglobina Lega l emoglobina Ridotta in condizioni di emolisi β2-microglobulina Ferritina Subunità dell antigene HLA Aumenta su tutte le membrane cellulari in caso di disfunzione tubulare renale Lega il ferro nei tessuti Fornisce indicazioni sulla riserva di ferro corporeo Transferrina Trasporto di ferro Valutazione sullo stato del ferro e/o risposta ad un apporto nutrizionale Globulina che lega la tirosina (TBG) Globulina che lega l ormone sessuale (SHBG) Lega l ormone tiroideo Ricerca sulle malattie della tiroide Lega testosterone ed estradiolo Ricerca sull eccesso di androgeni e/o resistenza all insulina

108 IMMUNOELETTROFORESI E una metodica combinata che utilizza la migrazione elettroforetica delle proteine su di un particolare supporto, per ottenerne la separazione e, contemporaneamente ne valuta le caratteristiche antigeniche a mezzo di antisieri specifici. La metodica consente la tipizzazione immunochimica delle Ig, ossia la determinazione della classe della catena pesante e del tipo di catena leggera: utilizzando antisieri polivalenti per le Ig umane si avranno tre archi di precipitazione corrispondenti alle tre principali classi: IgG, IgA, IgM.

109 IMMUNOFISSAZIONE (IFE)» E la tecnica più sensibile» Sfrutta la combinazione tra elettroforesi proteica su agarosio e la reazione delle proteine separate con anticorpi monospecifici. Campioni di siero vengono seminati in più solchi lineari su supporti di agarosio e sottoposti ad elettroforesi. Per ogni solco viene seminato un antisierio specifico per le catene pesanti e leggere (γ,α,µ, κ,λ) Quando l antisiero incontra l antigene specifico determina un immunoprecipitato che rimane nel supporto di gel dopo lavaggio effettuato per allontanare le proteine non precipitate Una opportuna colorazione metterà in evidenza l eventuale componente M Analoga procedura potrà essere effettuata anche su campioni di urine per determinare la presenza di catene k o λ monoclonali

110 IMMUNOFISSAZIONE componente monoclonale

111 IMMUNOFISSAZIONE componente monoclonale

112 IMMUNOFISSAZIONE componente monoclonale

113 IMMUNOFISSAZIONE componente monoclonale di -po IgA con catene leggere di -po kappa.

114 IMMUNOSOTTRAZIONE (IS-CE) IgG IgA IgM κ λ L IS-CE consiste nel far reagire il siero con uno specifico an-corpo (an--igg, an--iga, an--igm, an- Kappa, an- Lambda) legato ad un supporto solido prima di avviare la procedura di elelroforesi capillare, in modo da immunofissare le componen- monoclonali prima dell elelroforesi. La sovrapposizione di ogni profilo an-siero con il profilo di riferimento (ELP) permele di visualizzare la scomparsa e/o la diminuzione del picco monoclonale sul profilo an-siero e di dedurne la gammopa-a corrispondente.

115 ANALISI DELLE COMPONENTI MONOCLONALI MEDIANTE ISE- CE componente monoclonale di tipo IgG con catene leggere di tipo kappa.

116 Vantaggi IS-CE: Automazione Rapidità dell indagine Riduzione degli errori da parte dell operatore Riduzione tempi di risposta Riduzione dei costi