Tecniche di biologia

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1 Tecniche di biologia

2 Negli anni 70, la scoperta degli enzimi di restrizione, della trasformazione batterica e dell elettroforesi su gel di agarosio ha avviato lo sviluppo della biologia molecolare e dell ingegneria genetica Tecniche di base per l analisi dei geni: restrizione tagli specifici sul DNA e riunione di molecole diverse clonaggio molecolare studio di singoli geni isolati concetto di trasformazione e metodi di trasformazione elettroforesi su gel analisi ad alta risoluzione del DNA blotting ed applicazioni rilevamento di sequenze omologhe purificazione del DNA

3 Enzimi per la manipolazione di acidi nucleici DNA polimerasi DNA o RNA-dipendenti Ligasi Nucleasi

4 Anni 70: scoperta degli enzimi di restrizione diventa possibile tagliare il DNA in siti specifici e riunire molecole di DNA di diversa origine

5 Gli enzimi di restrizione sono endonucleasi che riconoscono e tagliano il DNA a livello di una specifica sequenza nucleotidica. Il sito riconosciuto è generalmente formato da una sequenza di 4-8 bp. Enzimi diversi riconoscono sequenze nucleotidiche diverse: ogni enzima ha perciò una sua caratteristica specificità Gli enzimi di restrizione sono isolati dai batteri, dove costituiscono un sistema di difesa naturale che distrugge eventuali molecole di DNA estraneo e quindi protegge da infezioni virali. 1978, premio Nobel a W. Arber, D. Nathan & H. O Smith, per la scoperta degli enzimi di restrizione

6 Esistono 3 classi di enzimi di restrizione; gli enzimi di tipo 2 sono i più usati in ingegneria genetica: riconoscono brevi sequenze palindromiche (es GGTACC; GGTNACC) producendo estremità coesive (sticky) o piatte (blunt) TAGLIO SIMMETRICO ASIMMETRICO La sigla degli enzimi deriva dal nome di genere, specie e ceppo del microorganismo di origine

7 Applicazioni degli enzimi di restrizione 1) Mappe di restrizione 2) Creazione di molecole di DNA ricombinante e clonaggio 3) Analisi di RFLP

8 1) Mappe di restrizione 1)DNA digerito con più tipi di endonucleasi di restrizione, (digestioni singole e multiple) 2) i frammenti risultanti separati ed analizzati mediante elettroforesi. La mappa è prima forma di caratterizzazione di una molecola di DNA

9 2) Molecole di DNA ricombinante Le estremità coesive generate dagli enzimi di restrizione sono molto utili per le tecniche di manipolazione genetica. DNA di origine diversa sono legati grazie alla complementarità tra le estremità generate dallo stesso enzima di restrizione; le estremità sporgenti dei frammenti si associano mediante legami idrogeno; l enzima DNA ligasi salda le estremità, generando una molecola di DNA chimerica o ricombinante

10 3) RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism Il polimorfismo genetico consiste in differenze di sequenza a livello di cromosomi omologhi: differenze nucleotidiche, anche minime, possono generare o eliminare specifici siti di restrizione. La digestione di segmenti corrispondenti di cromosomi omologhi produce differenti quadri di restrizione chiamati RFLP. Wild-type allele AGATCT TCTAGA Restriction site Mutant allele AGAGCT TCTCGA Not a restriction site

11 Gli RFLP sono marcatori utili per - rilevare differenze tra genomi (studi filogenetici e di popolazione) - diagnosi di malattie ereditarie. Un particolare RFLP può essere associato alla forma difettosa di un gene, tanto da caratterizzare gli individui affetti dalla patologia. Attualmente, gli RFLP sono usati nella diagnosi di malattie con base genetica (fibrosi cistica, distrofia muscolare di Duchenne, fenilchetonuria, emofilia, etc.). Allele I Allele II Analisi su gel w x Taglio C C G G G G C C z A C G G T G C C Frammenti più lunghi 1 2 z y Taglio C C G G G G C C y Taglio C C G G DNA prelevato dai cromosomi G G C C Frammenti più corti + x w y y

12 Esempio di esame diagnostico basato su un polimorfismo genetico. 0.2 kb 1.2 kb introne Mst II Gene per la β-globina (mancante in HbS) Tipo di emoglobina A S Sequenza amminoacidica e nucleotidica nel gene per la β-globina -Pro- Glu - Glu CCT-GAG-GAG Sito per MstII -Pro- Val - Glu CCT-GTG-GAG Sito non riconosciuto da MstII 1.4 kb 1.2 kb 0.2 kb Elettroforesi dei prodotti di restrizione A S A/S Il cambiamento di una sola base (AÆT), nel gene per la β-globina, determina una sostituzione amminoacidica nella proteina codificata (GluÆVal), che altera le proprietà strutturali dell emoglobina, generando l anemia falciforme. Il cambiamento nucleotidico, rispetto alla sequenza wild type, comporta la perdita del sito riconosciuto dall enzima MstII. Questo polimorfismo ha un utilità diagnostica e può essere rilevato analizzando il pattern di restrizione ottenuto trattando la regione genomica, precedentemente amplificata per PCR, con l enzima MstII: nel genotipo omozigote wild type, la digestione produrrà due frammenti (A), nel mutato un unico frammento (S), nell eterozigote portatore tre frammenti (A/S).

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14 Genotipizzazione mediante analisi RFLP

15 L analisi di RFLP di regioni genomiche con ripetizioni tandem (microsatelliti) fornisce l impronta genetica e permette di risalire a parentele

16 DNA-Finger print Analisi di restrizione di zone di DNA genomico polimorfiche applicazioni forensi 1. PCR della regione polimorfica o digestione diretta del DNA genomico estratto 2. Separazione frammenti 3. Evidenziazione dei frammenti con sonde marcate

17 Clonaggio molecolare Il clonaggio molecolare consente l amplificazione e lo studio di uno specifico frammento di DNA sfruttando un sistema cellulare Il segmento di DNA di interesse viene inserito in una molecola di DNA in grado di replicarsi autonomamente (: un cosiddetto veicolo o vettore ). Il risultante vettore chimerico ( DNA ricombinante ) è introdotto in un organismo ospite, in genere un batterio, che viene fatto riprodurre in modo da generare una popolazione numerosa: tutti i membri della popolazione conterranno molte copie del DNA ricombinante, ottenendo così quantità elevate del DNA di interesse, inserito inizialmente.

18 E.coli Schema di clonaggio molecolare Plasmide Plasmide con DNA ricombinante 1 Si isola il DNA da due fonti diverse Batterio ricombinante 2 Si tagliano entrambi i DNA con un enzima di restrizione Gene V Estremità coesive Gene V DNA Cellula umana 3Si mescolano le molecole di DNA che si uniscono mediante appaiamento di basi azotate Clone batterico in possesso di molte copie del gene umano 4Si aggiunge DNA-ligasi per attaccare il DNA con legami covalenti 5Si inserisce il plasmide in un batterio tramite trasformazione 6Si clona il batterio 1) isolamento e preparazione del DNA da clonare (es tagliando con opportuni enzimi di restrizione) 2) scelta e preparazione del vettore 3) ligazione: il frammento è inserito nel vettore, ad es. un plasmide batterico 4) i vettori ricombinanti sono introdotti mediante trasformazione nel microorganismo ospite 5) riproduzione del clone trasformato e conseguente amplificazione del numero di copie del DNA di interesse 6) analisi del DNA clonato (es mediante sequenziamento)

19 Come si fa ad introdurre DNA estraneo in una cellula ospite? Il DNA è una molecola carica che attraversa difficilmente parete e membrane cellulari metodi di trasformazione Una volta entrato, affinchè sia mantenuto nell ospite e trasmesso alle successive generazioni, il DNA esogeno deve essere integrato in ununità di replicazione funzionante vettore di clonaggio La trasformazione ha un efficienza <100%: è necessario poter distinguere le cellule trasformate da quelle non trasformate marcatori di selezione.

20 TRASFORMAZIONE La trasformazione consiste nel trasferimento di DNA esogeno all interno di una cellula ospite. Sono state sviluppate diverse tecniche che permettono di trasformare cellule sia batteriche che eucariotiche, incluse di mammifero. -a)trattamento con una combinazione di cationi bivalenti e successivo shock termico. -b) Elettroporazione -c) Gene gun -Infezione con virus i cui genomi sono stati modificati in modo da contenere il DNA esogeno (metodo usato per eucarioti e batteri). - Microiniezione (cellule di mammifero).

21 L ospite per il clonaggio varia secondo le esigenze E. coli B. subtilis S. cerevisiae

22 Si prepara un terreno di coltura selettivo in cui solo i batteri/microorganismi trasformati sono in grado di crescere Condizioni di sterilità Incubazione delle piastre alla T ottimale per la crescita del microorganismo

23 ELETTROFORESI SU GEL L elettroforesi su gel consente di separare ed analizzare molecole di DNA di dimensioni diverse. Molecole cariche, come acidi nucleici e proteine, possono essere separate mediante elettroforesi: migrazione in un campo elettrico. Essendo cariche negativamente, le molecole di DNA migrano verso il polo positivo. In una matrice porosa la velocità di migrazione del DNA è inversamente proporzionale al LOG 10 della sua lunghezza. Al termine dell elettroforesi, DNA di lunghezza diversa sono risolti in bande distinte.

24 Fasi di preparazione di un gel per elettroforesi

25 Dopo la corsa, il gel è posto su una lampada di luce UV per visualizzare il pattern di migrazione del DNA

26 In un gel di elettroforesi, il DNA si può visualizzare con coloranti fluorescenti, come il bromuro di etidio, un potente agente intercalante del DNA. Il bromuro di etidio emette una luce rosa-arancio quando è intercalato nel DNA e sottoposto a radiazione UV

27 All interno del gel la velocità di migrazione del DNA è influenzata dalla dimensione della molecola e dallo stato strutturale

28 Su gel di agarosio analisi di DNA e RNA

29 Applicazioni della gel elettroforesi: indagine sui tratti morfologici tipici dell apoptosi

30 Schwartz & Cantor, 1984 La gel-elettroforesi in campo pulsato (PFGE) permette di separare molecole di DNA molto lunghe, fino a 10000Kb (10Mb) Matrice di agarosio La direzione del campo elettrico è invertita di 180 (FIGE) o variata con contorno bloccato (CHEF) a intervalli di tempo definiti (0,5-2 min) Consente analisi di cromosomi interi

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33 Southern, 1975 Tecniche di ibridazione Southern Blotting permette individuare frammenti di DNA specifici in una popolazione eterogenea si basa su:1) la produzione di una replica del gel su membrana; 2) la complementarità tra DNA sonda e DNA fissato su membrana

34 La sonda è un segmento di DNAss marcato Sonda radioattiva (DNA) DNA a filamento singolo Durante la fase di ibridazione riconosce e lega il DNA bersaglio presente sulla membrana Mediante l appaiamento delle basi azotate si individua il gene prescelto Analoghi al southern blotting, in quanto basati sul trasferimento di molecole da gel di elettroforesi a membrana (e successiva ibridazione ) sono: -Northern blotting trasferim. di RNA; rilevamento per ibridazione con sonde di DNAss -Western blotting trasferim. di proteine separate mediante PAGE; rilevamento con anticorpi marcati -South-Western blotting trasferim. di proteine; rilevamento con sonde di DNAds; consente l identificazione di proteine in grado di legare DNA Sul principio dell ibridazione si basano anche tecniche come le ibridazioni in situ (su cellule o tessuti integri) e i chip a DNA (microarray)

35 Il western blotting differisce dal southern per due aspetti principali: 1. Il trasferimento di proteine avviene per passaggio di corrente elettrica (e non per capillarità) 2. Il rilevamento si basa sul legame di anticorpi e non sull ibridazione tra acidi nucleici ss

36 Applicazioni del Southern blotting Medicina legale: DNA fingerprint (RFLP rivelati mediante sonde) Gli RFLP di particolari marcatori sono evidenziati e confrontati mediante southern blotting Sangue dell imputato Sangue rinvenuto sui vestiti dell imputato Sangue della vittima

37 Purificazione del DNA Purificazione del DNA genomico 1. Lisi cellulare con metodi vari secondo il tipo cellulare 2. Rimozione dei frammenti cellulari mediante centrifugazione 3. La parte solubile è trattata con solventi organici (fenolo e cloroformio) per denaturare e allontanare le proteine 4. Precipitazione e concentrazione degli acidi nucleici rimasti nella fase acquosa (etanolo o PEG) 5. Rimozione dell RNA: trattamento con enzima RNAsi 6. (Centrifugazione in gradiente di densità per separare diversi tipi di DNA) Kit commerciali rapidi ed efficaci Resa di DNA genomico μg per mg di tessuto, 5-15 μg da 300 μl di sangue intero.

38 Vettori I vettori assicurano la propagazione e replicazione del DNA esogeno nell ospite. I vettori sono molecole di DNA costruite combinando e modificando sequenze naturali. 1)Vettori di clonaggio amplificazione del DNA inserito 2) Vettori di espressione traduzione in proteina del DNA inserito Le caratteristiche di un vettore di clonaggio sono: -capacità autoreplicativa nell organismo ospite -presenza di un gene marker per la selezione dei trasformanti (es gene di resistenza ad un antibiotico) -presenza di una regione polylinker contenente siti riconosciuti da diversi enzimi di restrizione, utilizzabili per l inserimento del frammento di interesse - presenza di un gene marker per la selezione dei vettori ricombinanti (: la sequenza di tale gene è sovrapposta al polylinker, peciò l inserimento del frammento clonato la interrompe con conseguente perdita della funzione corrispondente).

39 Esistono vari vettori di origine diversa; la scelta del vettore dipende dall applicazione e dalla dimensione del frammento da clonare VETTORE OSPITE TIPO DI CLONAGGIO, applicazioni Dimensione MAX dell inserto Plasmide batteri, lieviti genomico, cdna Manipolazione generale kb Batteriofago λ batteri genomico, cdna 20 kb e M13 Librerie, mutagenesi e sequenziamento Cosmidi batteri Genomico librerie 45 kb BAC batteri genomico librerie kb YAC Lieviti genomico librerie kb

40 I plasmidi sono molecole di DNA circolari extra-cromosomali. Naturalmente diffusi in procarioti e alcuni eucarioti (lievito). Conferiscono un fenotipo caratteristico: es resistenza ad antibiotici o metalli pesanti. Basso N copie 1-2/cellula (stringente) alto N copie /cellula (rilassato) Dimensione standard 1-20kb TEM 2000

41 Esempio di vettore plasmidico regione di inserimento del DNA di interesse Gene marker per selezionare trasformanti: resistenza ad antibiotico (ampicillina) origine di replicazione

42 Esempio di vettore di espressione plasmidico

43 LIBRERIE di DNA Le librerie sono insiemi di molecole di DNA ricombinanti: raccolte di frammenti di DNA provenienti da un certo organismo o tessuto La libreria è costruita clonando in opportuni vettori i vari frammenti di DNA ottenuti dalla fonte (tessuto o coltura cellulare); il vettore puo essere plasmidico, fagico, cosmidico. Plasmide ricombinante Genoma tagliato con l enzima di restrizione DNA fagico ricombinante oppure Clone batterico Libreria plasmidica Clone fagico Libreria fagica

44 Esistono 2 tipi principali di librerie 1) Libreria di DNA genomico - Raccoglie tutti i geni espressi e non, esoni-introni, promotori e seq. intergeniche di un genoma - organismo-specifica trascrizione 2) Librerie di cdna -Raccoglie solo sequenze codificanti espresse da quel particolare tessuto in particolari condizioni -Tessuto/stadio-specifica - L mrna di un certo tessuto è convertito in DNA e clonato Splicing dell mrna Purificazione dell mrna e retrotrascrizone Demolizione dell RNA Sintesi di DNA ds

45 I genomi sono insiemi di molecole di DNA enormi: le genoteche ne consentono analisi sistematica e più semplice

46 Screening di librerie La ricerca del clone di interesse può basarsi sulla conoscenza di Sequenza di DNA del clone screening mediante ibridazione di sonde oligonucleotiche Sequenza proteica del clone screening immunologico Funzione biochimica della proteina screening funzionale Capacità dinterazione con altre proteine screening per interazione

47 Screening basato su ibridazione di sonde oligonucleotidiche Si usa sonda di DNA marcata complementare a parte della sequenza ricercata Presuppone conoscenza minima circa la seq che si cerca Il metodo va bene per screening di colonie (librerie plasmidiche e cosmidiche) e di placche di lisi (librerie fagiche) La marcatura radioattiva assicura la massima sensibilità

48 Analisi di genomi Mappatura Sequenziamento Analisi dei cambiamenti dell espressione genica (microarray) RNAi e KO genico

49 Le mappature consentono di organizzare i genomi in schemi più semplici, adatti allo studio. Esistono diversi metodi e tipi di mappatura: Mappe di restrizione Mappe citologiche Mappe genetiche Mappe fisiche

50 Mappa citologica E lo schema di bandeggio caratteristico che si ottiene trattando con coloranti specifici (es Giemsa: bande G) i cromosomi metafasici. Sulla mappa citologica la posizione dei geni può essere localizzata mediante FISH (fluorescence in situ hybridization) mappa citogenetica G-band and in situ hybridization analysis of a pleomorphic adenoma (case 3) with a t(5;8)(p13;q12 13). (a) Representative karyotype of the case; (b) FISH analysis with painting probes for chromosome 5 (green) and chromosome 8 (red), confirming the translocation (Carmo et al., 2008)

51 La FISH consente diagnosi di varie patologie genetiche Le sonde FISH sono ibridate su cromosomi metafasici umani Campione osservato con microscopion a fluorescenza: rivela fluorescenza della sonda

52 FISH: con sonde diverse si analizzano simultaneamente varie aspetti genetici es diagnosi prenatale del sesso, trisomie, traslocazioni, etc.

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55 Mappa genetica E una rappresentazione della distanza tra due elementi di DNA basata sulla frequenza di ricombinazione osservata tra di essi. (Distanze espresse in CMorgan) Poco adatta per lo studio del genoma umano. Approssimativa. Mappa fisica Mappatura di marcatori genetici ottenuta analizzando direttamente il genoma con diverse tecniche basate su restrizione, ibridazione e PCR. (distanze espresse in bp)

56 Sequenziamento del DNA Alla fine degli anni 70 sono stati elaborati due metodi alternativi per il sequenziamento manuale del DNA Maxam e Gilbert, 1977: metodo chimico Il DNA è tagliato chimicamente in corrispondenza di basi specifiche: i prodotti di taglio sono analizzati su gel elettroforesi Sanger, 1977: metodo terminazione di sintesi enzimatica Il Dna da sequenziare è replicato a partire da un primer innesco con una polimerasi; il filamento neosintetizzato è radiomarcato e la reazione è interrotta per incorporazione di dideosii -nucleotidi (ciascuno aggiunto alle 4 diverse mix di reazione) analisi di elettroforesi autoradiografia (1980: Nobel per la chimica a Gilbert e Sanger)

57 Sequenziamento automatico Il metodo di Sanger è rimasto alla base dei protocolli di sequenziamento automatico Enzima DNA stampo dntp ddntp marcati con 4 diversi fluorofori reazione Separazione dei frammenti su singolo capillare di gel abbinato ad un rilevatore di fluorescenza Analisi computerizzata dell elettroferogramma Con un primer si sequenzia regione di bp Processo automatizzato

58 Il sequenziamento del DNA è usato per rilevare mutazioni puntiformi Diagnosi molecolare

59 Sequenziamento di interi genomi 1) Frammentazione del genoma e clonaggio in vettori 2) Sequenziamento mediante uno dei seguenti approcci: a) chromosome walking: identificazione di nuovi cloni sovrapposti per ibridazione di cloni già sequenziati b) Shot-gun totale: genoma ricostruito assemblando sequenze sovrapposte di piccoli frammenti casuali c) Shot-gun gerarchico: il genoma è tagliato in grossi frammenti sovrapposti, che vengono ulteriormente tagliati e sequenziati (+ adatto a genomi di grossa taglia)

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61 Progetto Genoma Umano Inziato nel 1990 e portato avanti da HGP (consorzio di enti di ricerca pubblici) e Celera genomics (industria biotecnologica) Obiettivi: sequenziare intero genoma, creare banca dati e identificare geni Sequenziamento concluso nel 2003 I dati ottenuti stanno fornendo informazioni su sviluppo, evoluzione e molte malattie. I benefici che possono derivare dalla conoscenza del genoma umano riguardano essenzialmente la ricerca di base. L enorme numero di dati raccolti è depositato in un archivio accessibile in rete ai ricercatori di tutto il mondo. Il genoma umano comprende circa geni (codificanti per proteine, trna e rrna) ma la capacità codificante arriva a proteine grazie splicing alternativo. C è poi un enorme quantità di DNA non codificante (circa il 97% del totale) che comprende seq. regolatrici (promotori, enhancer) e introni e DNA intergenico (il cosiddetto junk DNA o DNA spazzatura )

62 Oltre a quello umano, sono stati sequenziati o in via di sequenziamneto anche genomi di altre specie, soprattutto procarioti. Ogni singolo genoma è interessante di per sé, ma è utile in particolare ai fini dell analisi comparativa con il genoma umano.

63 I problemi legati all immagazzinamento e all analisi dell enorme mole di dati relativi alle sequenze hanno portato alla nascita della BIOINFORMATICA La bioinformatica sviluppa algoritmi e metodi statistici per trovare/stabilire relazioni tra i dati, fornisce strumenti per analizzare e gestire i dati (seq di DNA e aminoacidiche, domini proteici, etc) Databases, siti, risorse e programmi online

64 Il sequenziamento è solo una prima tappa dello studio dei genomi: le sequenze ottenute devono essere studiate ed interpretate Come si identificano i geni? Scansione di sequenza per ricercare ORF Confronto di sequenza con banca dati di cdna (Expressed Sequence Tag) Come si caratterizza la funzione di un gene? Mediante analisi bioinformatica ricerca di omologia di sequenza in banca dati Mediante analisi sperimentale knock out (KO) (o silenziamento) genico tramite ricombinazione omologa ed analisi fenotipica del mutante

65 Analisi di knock out (KO genico) Consente di individuare la funzione di un gene Mediante ricombinazione omologa il gene target viene sostituito da una cassetta contenente un gene marker selezionabile Studi soprattutto su lievito ed eucarioti inferiori, minore applicabilità per organismi superiori

66 RNA antisenso e interferenza da RNA (RNAi) silenziamento genico Principio comune alle due tecniche: la presenza di RNA complementare all mrna endogeno destabilizza specificamente l mrna target Antisense RNA :Trasformazione di cellule con vettore di espressione inducibile per un RNAss antisenso silenziamento gene target per degradazione del corrispondente mrna complementare

67 RNAi: Trasformazione con vettore di espressione per un piccolo RNAds corrispondente ad un tratto codificante di gene target silenziamento gene target per degradazione del corrispondente mrna RISC= RNA-induced silencing complex Tecnica con vaste possibilità applicative nello studio di geni di mammiferi

68 Silenziamento di gene codificante per proteina necessaria a d allineare cromosomi in metafase

69 Dal genoma, lo studio si è spostato su: Trascrittoma (contenuto di mrna di una cellula in particolari condizioni) Proteoma (l insieme di proteine prodotte da una cellula) Metaboloma (insieme dei metaboliti prsenti in una cellula, che cambia in funzione del suo stato fisiologico)

70 PCR ed applicazioni Amplificazione di DNA in vitro La PCR (Polymerase Chain Reaction) ha rivoluzionato la biologia molecolare e trovato vasta applicazione in aree di ricerca disparate ideata e messa a punto da Kary Mullis nel 1983 (Nobel per la chimica nel 1993).

71 È un metodo attraverso cui una sequenza di DNA può essere amplificata esponenzialmente in vitro in modo specifico. Consente di superare uno dei maggiori problemi che si incontrano nell analisi dei geni: bersagli rari all interno di complessi e vasti genomi. Molecola iniziale di DNA La PCR offre la possibilità di produrre un enorme numero di copie di DNA senza ricorrere al clonaggio Numero di molecole di DNA

72 Ingredienti e condizioni di PCR - oligonucleotidi innesco (~20 bp) complementari alle regioni fiancheggianti la zona da amplificare: primer per la polimerasi -Enzima DNA-polimerasi 5 3 (termostabile) -dntp -DNA stampo. sia puro che sottoforma di campioni biologici (fettine istologiche, capelli, colonie batteriche, ecc). La quantità iniziale di DNA richiesta per la PCR è minima, in teoria, anche una singola molecola è sufficiente - Condizioni saline (MgCl 2 cofattore) e di ph adeguate

73 -Alternanza di fasi a diversa temperatura 1) denaturazione del DNA stampo 2) appaiamento dei primer 3) estensione dei primer da parte della polimerasi = 1 ciclo di PCR ad ogni ciclo il DNA bersaglio raddoppia cicli di amplificazione Accumulo esponenziale dei frammenti di amplificazione Legge esponenziale x(2 n ) x= n molecole DNA stampo iniziale; n= n di cicli

74 Enzyme primers Template DNA dntp Buffer Il profilo termico è impostato in un thermal cycler Pcr.exe Il prodotto di reazione è controllato per elettroforesi

75 Applicazioni della PCR Le applicazioni sono molteplici in campi diversi: genetica molecolare, medicina, archeologia, medicina forense, analisi di popolazioni, studi di filogenesi, etc. Diagnosi di malattie genetiche (mutazioni per delezioni/inserzioni o puntiformi) Analisi di medicina forense (es DNA finger-print) Clonaggio dei prodotti di PCR Rilevare infezioni batteriche o virali Analisi dell espressione genica (RT-PCR) Studi di evoluzione molecolare (filogenesi)

76 Esempio di diagnosi di malattia genetica dovuta a delezione genica: la sindrome di Waardenburg Primer 1 Delezione 18bp Elettroforesi dei prodotti di PCR 156 bp Gene umano Pax3 PCR su DNA genomico estratto selvatico mutante Primer 2 La sindrome è autosomica dominante ed è caratterizzata da sordità e pigmentazione anomala. Alcuni tipi di sindrome sono causati da mutazioni per delezione sul gene Pax-3. I primer sono disegnati sui lati del sito di delezione: la PCR produce un unico amplicone più lungo nel wt, due ampliconi di cui uno più corto nel mutante eterozigote 138 bp

77 Analisi delle delezione del gene distrofina mediante PCR

78 PCR e/o analisi di southern sono alla base della diagnosi molecolare dell anemia falciforme

79 Test di paternità e di compatibilità genetica basati su PCR e lunghezza frammenti di siti polimorfici (STR, short tandem repeats: DNA microsatellite)

80 Colture cellulari primarie, secondarie ed immortalizzate Modificazioni genetiche su organismi animali

81 Come si genera una coltura di cellule animali? Si preleva piccolo frammento di tessuto (2mm 3 ) Digestione con proteasi per degradare matrice extracellulare e separare le cell. Trasferimento in nuove flask con fattori di crescita per stimolare proliferazione

82 Colture/linee cellulari primarie: le cellule ottenute da tessuto non si dividono o lo fanno per poche volte prima di andare incontro a senescenza e morire Linee cellulari secondarie: cellule ottenute da tessuto riescono a dare numerose generazioni (10-20 divisioni), prima di invecchiare e morire Linee cellulari trasformate: in seguito a cambiamenti genetici, spontanei o indotti (ad es mediante infezione virale), le cellule perdono il normale controllo su divisione e crescita cellulare cellule crescono indefinitamente: linee immortalizzate (es cell HeLa: cellule tumorali derivanti da paziente morta di cancro all utero nel 1951; cell. CHO da ovaio porcellino d india: Chinese Hamster Ovary)

83 Transfezione NB Per le cellule animali quindi, il termine trasformazione indica la perdita di controllo sulla proliferazione, mentre col termine transfezione si indica l inserimento di DNA esogeno. La transfezione può essere: -transiente (il DNA esogeno è mantenuto solo per periodo limitato, raccolta delle cellule per analisi dopo ore) -stabile (più difficile da ottenere; il DNA è integrato permanentemente nel genoma mediante ricombinazione non omologa, o conservato come elemento extracromosomico stabile, dotato di propria origine replicativa)

84 Modificazioni genetiche su organismi animali La capacità di modificare specifici caratteri di un intero organismo animale offre la possibilità di migliorare la comprensione di fenomeni biologici complessi, come lo sviluppo e l insorgenza di malattie. Le tecniche per ottenere organismi transgenici si basano su conoscenze di embriologia: gli interventi per introdurre il DNA esogeno riguardano fasi embrionali precoci. stadi iniziali di sviluppo embrionale impianto nell utero

85 INIEZIONE NEL PRONUCLEO Il DNA è iniettato nel pronucleo di uova di topo fecondate (si usa un micromanipolatore); coltivazione in vitro fino a stadio di morula e successivo impianto in utero. Svantaggi: Casualità integrazione; inadatto per knockout; possibilità di animali a mosaico

86 Trasfezione di cellule staminali embrionali (ES) Le ES sono isolate dalla blastocisti e possono essere mantenute in coltura per varie generazioni. Le ES possono essere trasfettate con vari metodi e sottoposte a selezione delle trasformate Le ES trasformate sono introdotte in una nuova blastocisti che viene impiantata nell utero. La progenie chimerica è incrociata con topi normali per avere eterozigoti, che sono poi incrociati tra loro per dare omozigoti

87 Uso di coloranti specifici per strutture/molecole cellulari

88 Uso di anticorpi per lo studio di strutture e proteine cellulari Anticorpi riconoscono e legano specifiche molecole La specificità di legame deli Ab usata per analizzare morfologia e localizzazione di strutture cellulari Ab coniugato a molecola fluorescente visione al microscopio ottico a fluorescenza : immunofluorescenza diretta o indiretta

89 In microscopia elettronica l Ab è coniugato a materiale elettrondenso (es particelle d oro)

90 Tecnica di preparazione di AB monoclonali iniezione di antigene nel topo prelievo di organi linfoidi (milza ) fusione di cellule linfoidi con cell tumorali (immortalizzazione) selezione dei cloni cellulari che producono anticorpi coltivazione delle cellule selezionate e purificazione degli anticorpi