Perché studiare l mtdna???

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1 La genetica molecolare ha consentito un notevole avanzamento delle conoscenze nello studio delle differenze genetiche sia all interno che tra popolazioni naturali di vari individui Tradizionalmente le differenze genetiche tra individui di una specie non erano determinabili, eccetto il caso in cui esse determinavano differenze nel fenotipo, riducendo notevolmente il numero ed il tipo di studi a livello di popolazione che potevano essere effettuati. Infatti molte differenze genetiche tra individui di una stessa popolazione non determinano differenze fenotipiche. Lo studio molecolare ha rivelato che le popolazioni naturali posseggono una elevata variabilità genetica. Le sequenze delle proteine e soprattutto del DNA contengono informazioni sulle relazioni evolutive tra gli individui (intra/inter-specie). Questo tipo di variabilità genetica può essere utilizzata per studiare: la storia delle popolazioni le relazioni genealogiche tra individui Fig Perché studiare l mtdna???

2 La Genetica dell mtdna Elevato numero di copie (0,3%) Alto tasso di evoluzione (10/20 volte superiore all ndna) Il tasso di evoluzione di una sequenza nucleotidica è la stima del numero di mutazioni osservabili in una certa sequenza in un certo tempo (es. anni). Il tasso di evoluzione non indica quante mutazioni avvengono in una certa sequenza, ma indica le mutazioni che vengono conservate dopo l azione della deriva genetica e della selezione naturale, che elimina tutte le mutazioni eccessivamente dannose.

3 Eredità Materna ed Assenza di Ricombinazione Y chromosome autosomes mtdna

4 Genetica dell mtdna Eredità Materna ed Assenza di Ricombinazione Il differenziamento dell mtdna umano è avvenuto solo per accumulo sequenziale di mutazioni lungo le linee di radiazione materna Nel tempo questo processo di divergenza molecolare ha dato origine ad entità monofiletiche dette Aplogruppi

5 Che cosa è un Aplogruppo mitocondriale? Gruppo di mtdna che condividono varianti caratteristiche acquisiti per discesa da un antenato comune (femminile) A B B1

6 Aplogruppi tipici dei Nativi Americani +663 HaeIII A 9-bp deletion HaeIII B DdeI DdeI HaeIII X Others AluI DdeI AluI C AluI DdeI AluI D Torroni et al., Am J Hum Genet (1993)

7 Metodi di analisi della variabilità mitocondriale In passato il rilevamento era difficoltoso in quanto in assoluto il DNA mitocondriale è una frazione piccola del DNA cellulare Analisi molecolare tramite RFLP-PCR (restriction fragments lenght polymorphism PCR) che prevede di amplificare il DNA e tentare di tagliare i prodotti con un enzima di restrizioni e confrontare il pattern di bandeggio con quello atteso.

8 Technical Note 2.3 Figure T2.3 Genomes 3 ( Garland Science 2007)

9 Gli ENZIMI DI RESTRIZIONE riconoscono e tagliano specifiche sequenze di DNA rompendo i legami covalenti tra le basi azotate su entrambi i filamenti.

10 Figure 2.10 Genomes 3 ( Garland Science 2007)

11 DNA bersaglio Denaturazione Appaiamento 3 5 Estensione 5 P P REAZIONE STANDARD DELLA PCR Primo step nell analisi PCR-RFLP

12 Samples ( 9 ): 1,2,3,4,5,6,7,8,9 GoTaq X 1 X 40 H2O (bdw steril) (ph 4) Buffer (Pharmacia) (10X) 2,5 1X 200 X 1 X 40 dntp mix (1,25 mm eac 4 (200mMeach) 160 H2O (bdw) Primer For (10pmol/ml) 0,75 (7,5pmol0,3mM) 30 Buffer (10x) Primer Rev (10pmol/ml) 0,75 (7,5pmol0,3mM) 30 BSA (100x) 0,3 12 Taq (Pharmacia) ( 5000U/ml 0,13 (0,65 U) 5,2 Enzyme (10U/ml) 0,3 (3 U) 12 23, , cicle 95 C 5' Marker : AluI,a Aplogroup : H date Primer : 6892 for Primer : 7260 rev AMPLIFICATION Genomic DNA 5 ml(100ng)+mix 20 ml PCR program 95 C 60'' 35cicles 55 C 60'' 1cicle 72 C 10' 72 C 70''(+1sec/c.) forever4 C Restriction s SITES of AluI (AGCT) nps: 7025, Restriction s FRAGMENTS: +7025AluI,a :bp 205, 133, 30 Restriction s FRAGMENTS: AluI,a :bp 205, 163 Amplified DNA 20ml + Mix 10ml AluI,a (Haplogroup H ): 1, 3,4, AluI,a (Haplogroup?): 2, 5,6,7,9 Marker : AluI,a Fragment Length : 368 DIGESTION Enzyme: AluI Temperature 37 /Time 3h Agarose Gel Nausive2,5%+Seakem0,9% DNA 20 ml. Run at 60V for Time >2h Profilo di restrizione? Frammenti visibili su gel? Campioni con marcatore -7025AluI?

13 Marker : AluI,a Aplogroup : H date AluI,a (Haplogroup H ): 1, 3,4, AluI,a (Haplogroup?): 2, 5,6,7,9 Samples ( 9 ): 1,2,3,4,5,6,7,8,9 Primer : 6892 for Primer : 7260 rev AMPLIFICATION GoTaq X 1 X 40 H2O (bdw steril) (ph 4) Buffer (Pharmacia) (10X) 2,5 1X 200 X 1 X 40 dntp mix (1,25 mm eac 4 (200mMeach) 160 H2O (bdw) Primer For (10pmol/ml) 0,75 (7,5pmol0,3mM) 30 Buffer (10x) Primer Rev (10pmol/ml) 0,75 (7,5pmol0,3mM) 30 BSA (100x) 0,3 12 Taq (Pharmacia) ( 5000U/ml 0,13 (0,65 U) 5,2 Enzyme (10U/ml) 0,3 (3 U) 12 23, , cicle 95 C 5' Genomic DNA 5 ml(100ng)+mix 20 ml PCR program 95 C 60'' 35cicles 55 C 60'' 1cicle 72 C 10' 72 C 70''(+1sec/c.) forever4 C Fragment Length : 368 Restriction s SITES of AluI (AGCT) nps: 7025, Restriction s FRAGMENTS: +7025AluI,a :bp 205, 133, 30 Restriction s FRAGMENTS: AluI,a :bp 205, 163 DIGESTION Enzyme: AluI Amplified DNA 20ml + Mix 10ml Temperature 37 /Time 3h Agarose Gel Nausive2,5%+Seakem0,9% DNA 20 ml. Run at 60V for Time >2h bp 150 bp 100 bp 50 bp

14 Metodi di analisi della variabilità mitocondriale In passato il rilevamento era difficoltoso in quanto in assoluto il DNA mitocondriale è una frazione piccola del DNA cellulare Analisi molecolare tramite RFLP-PCR (restriction fragments lenght polymorphism PCR) che prevede di amplificare il DNA e tentare di tagliare i prodotti con un enzima di restrizioni e confrontare il pattern di bandeggio con quello atteso. Sequenziamento della regione di controllo (soprattutto HVS-I)

15 Control Region Sequences Control Region ( ) HVS-I ( ) HVS-II ( ) Sequenziamento con primer interno (innesco) Human mtdna (16569 bp)

16 Metodi di analisi della variabilità mitocondriale In passato il rilevamento era difficoltoso in quanto in assoluto il DNA mitocondriale è una frazione piccola del DNA cellulare Analisi molecolare tramite RFLP-PCR (restriction fragments lenght polymorphism PCR) che prevede di amplificare il DNA e tentare di tagliare i prodotti con un enzima di restrizioni e confrontare il pattern di bandeggio con quello atteso. Sequenziamento della regione di controllo (soprattutto HVS-I) Sequenziamento dell intero genoma

17 Sequenziamento di interi genomi Le sequenze dei cromosomi/genomi interi vengono ricostruite a partire dalle sequenze di centinaia di migliaia di frammenti di DNA, normalmente di lunghezza compresa fra 700 e 900 bp Intero mtdna umano (16569) 11 ampliconi (1800 bp) parzialmente sovrapposti 3 sequenze (800 bp) per ogni amplicone usando primer interni Figura 4.5

18 GENOME SEQUENCING 33 overlapping sequence fragments covering the whole mitochondrial genome Electropherogram rcrs Contig Sequencer 4.7 ( )

19 COMPARE (to the reference sequence rcrs)

20 Aplotipo del campione di interesse (compared to rcrs) C C METHODS

21 L0a L0f L0k L0d L1b L1c L5a L5b L2a L2b L2c L2d L6 L7 L4a L4g L3a L3b L3c L3d L3f L3h L3i L3x L3e M2 D4 D5 D6 M21 Q M1 A N9a N9b Y N21 S N2a W N1a N1b N1c I X R5 U2a U2b U2c U2d U2e U8a U8b K1 K2 U4 U9 U3 U7 U5 U1 U6 B4 B5 B6 R9b F R21 P J1 J2 T1 T2 HV1 HV0* HV0a V H1 H2 H3 H4 H5 R0a TIME (years) 200,000 L 150,000 L0 L1 L5 Note: Mutations have to be placed only on vertical lines Africa 100,000 L2 Africa L4 L3 50,000 25,000 0 D M N9 N2 N1 N U8 K R U B R9 J T HV0 HV H R0 Africa S Asia E Asia SE Asia Oceania E Asia SE Asia W Eurasia S Asia W Eurasia E Asia SE Asia Oceania Oceania rcrs W Eurasia METHODS

22 Terry Brown Genomi 3 Capitolo 19: Filogenetica molecolare Genomes, 2nd edition Chapter 16_Molecular Phylogenetics Copyright Garland Science 2007

23 Modelli Evolutivi e Filogenesi Molecolare La comparazione delle sequenze permette di determinare le affinità tra individui diversi. L obiettivo dell evoluzione molecolare è la stima del quadro di relazioni evolutive tra un gruppo di sequenze, definito albero filogenetico (o genico, su singolo gene). Un albero filogenico è un diagramma della storia evolutiva dedotta da un gruppo di sequenze attraverso l individuazione di sequenze progenitrici. Poichè le sequenze cambiano attraverso il tempo le differenze fra sequenze si accumulano con il passare del tempo. Fig. 19.1

24 Dal multiallineamento all analisi filogenetica Allineamento e acquisizione di dati comparativi Es. aplotipo Aplotipo: 4T, 9A, 16T Fig The dot matrix The correct alignment stands out because it forms a diagonal of continuous dots, broken at point mutations and shifting to a different diagonal at indels.

25 Dal multiallineamento all analisi filogenetica Allineamento e acquisizione di dati comparativi Es. aplotipo Aplotipo: 4T, 9A, 16T Conversione dei dati comparativi in un albero ossia costruzione dell albero Determinazione dell accuratezza dell albero (generalmente solo per comparazioni interspecie) Uso dell orologio molecolare per asssegnare una data ai rami (cladi)

26 Caratteristiche Alberi Filogenetici Un albero filogenetico è un grafo costituito da nodi e da rami, in cui ogni ramo mette in relazione solo due nodi (rappresentandone la distanza). Possibili percorsi evolutivi Si definisce TOPOLOGIA la struttura generale di un albero. Se ai rami non si da valenza di distanza evolutiva, ho un CLADOGRAMMA, altrimenti ho un FILOGRAMMA. I nodi esterni rappresentano le sequenze in esame, mentre i nodi interni rappresentano le sequenze ancestrali Alberi SENZA RADICE: non prevede significato evolutivo in termini temporali. Alberi CON RADICE: accetta come vera l ipotesi dell orologio molecolare e i nodi stanno in un preciso ordine temporale. Si ottiene includendo un outgroup Fig. 19.4

27 Outgroup un outgroup è una sequenza nota per essere meno strettamente imparentata con le sequenze in esame, utile come riferimento nella determinazione di relazioni evolutive. Dal punto di vista evoluzionistico l'outgroup (che sia una specie, una sequenza genica o una proteina) si è differenziato in tempi più antichi rispetto agli altri gruppi. Fig Due o + sequenze si dicono monofiletiche se derivano da una singola seq. ancestrale. Un gruppo di sequenze monofiletiche prende il nome di clade o aplogruppo. Se due sequenze derivano da due o + seq. ancestrali, il gruppo e` detto polifiletico.

28 Metodi basati sulla distanza Input: matrice di distanze Algorithms: UPGMA Unweighted pair-group method using arithmetic averages Neighbor-Joining Le distanze tra coppie di sequenze sono espresse soprattutto come numero di cambiamenti nucleotidici o amminoacidici Per avere un parametro ripetibile si calcola il Numero di Sostituzioni per Sito che può essere una sottostima della distanza vera perché le mutazioni possono anche essere REVERSIONI ed avvenire sullo stesso sito (sito con multiple hits). Numero di sostituzioni osservate nell allineamento Distanza = Lunghezza complessiva dell allineamento

29 20 nucleotides Figure Genomes 3 ( Garland Science 2007)

30 UPGMA Uno dei metodi piu' semplici, anche se non privo di errori, in particolare per quanto riguarda la topologia dell albero dovuti ad un non costante tasso di mutazione fra le specie Si crea una matrice di distanze evolutive fra le sequenze 1) Human 2) Chimpanzee 3) Gorilla 4) Orangutan 2) Chimpanzee ) Gorilla ) Orangutan Human Chimpanzee 3) Gorilla ( )/2 = ) Orangutan ( )/2 = u) (1,2) 3) Gorilla 4) Orangutan Human Chimpanzee Gorilla

31 UPGMA Orangutan v) ( (1,2),3) 4) Orangutan 4) Orangutan ( )/3 = Human Chimpanzee Gorilla Human Chimpanzee Gorilla Orangutan Gibbon Outgroup

32 Metodi basati sull analisi dello stato dei caratteri discreti Input: allineamento multiplo aplotipo Ogni sito è trattato separatamente Algorithms: Maximum likelihood Maximum parsimony

33 Massima Parsimonia (MP) Principio: trovare l albero che richiede il minor numero di sostituzioni che spieghino le differenze osservate tra le sequenze in analisi Non si lavora più con le distanze ma con le sequenze Presi in considerazione solo: siti informativi ci devono essere almeno due forme alleliche (meglio se rappresentata almeno 2 volte) c C C T T 1,1,2 2,2,1 2,2,2

34 Affidabilità delle Ipotesi Filogenetiche L analisi del Bootstrap è usato per valutare la significatività statistica di una filogenesi E usato per valutare gli effetti di errori di campionamento e la stabilità dei nodi dell albero Calcola quanto spesso una particolare topologia di raggruppamento appare nell albero quando i siti nucleotidici sono ricampionati molte volte (100<n<1000) anche rimpiazzandone casualmente alcuni con altri duplicati Fig albero consensus >95% notevole attendibilità <75% attendibilità non supportata

35 L orologio molecolare L evoluzione è inevitabilmente un processo di divergenza e il numero di mutazioni che si accumulano nel tempo è direttamente proporzionale al tempo intercorso dalla divergenza delle sequenze in analisi. (1965, Zuckerkandl e Pauling). Se questo è vero, data una distanza genetica calcolata osservando le divergenze, è possibile ottenere il tempo trascorso dal momento in cui due sequenze hanno cominciato a divergere, ossia datare i punti di ramificazione in un albero filogenetico. L orologio molecolare si basa sul presupposto che le mutazioni neutrali si accumulano a ritmo costante. Basta calcolare il numero medio di mutazioni in un ramo (rho estimate) per stimare la divergenza molecolare. Per convertire la divergenza molecolare in tempo Bisogna calibrare l orologio calcolando il tasso di mutazione. Bisogna avere un dato verificato di distanza temporale. ad es. Dati sui fossili per uomo-orango 13 milioni di anni. tasso di mut. = num. di sost. / tempo. Fig

36 Esempio mtdna umano tasso di mutazione = num. di sost. / tempo numero di sostituzioni Sostituzioni totali = 2529 (su tutta la reg. codificante 15446bp) Sost. per discendenza = 1264,5 Sost. per nucleotide (sito) = 0,082 tempo t = 6,5 milioni di anni uomo/ scimpanzé comune Chimp 6,5 Tasso di mutaz. = 1,26 x 10-8 sostituzioni (per sito)/ anno che equivale a 1 sostituz. ogni 5140 (Mishmar et al. 2003, PNAS) Tasso x15446(regione cod) reciporco (1/) 1.26E

37 Esempio mtdna umano Divergenza molecolare tempo Divergenza molecolare media di un ramo (rho estimate) numero medio di differenze tra un set di sequenze e il loro ultimo antenato comune Rho= 2 7 Tasso di mutazione: 1 sostituz. ogni 5140 (Mishmar et al. 2003) Eta` del ramo = 2 x 5140 = anni