Aggiornamenti tecnici sui metodi per identificazione di allergeni negli alimenti

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1 SEMINARIO ALLERGIE ALIMENTARI E CELIACHIA Genova 9 luglio 2012 Aggiornamenti tecnici sui metodi per identificazione di allergeni negli alimenti Angelo Ferrari angelo.ferrari@izsto.it S.C. Territoriale Liguria Lucia Decastelli lucia.decastelli@izsto.it S.C. Controllo Alimenti e Igiene delle Produzioni 1

2 LEGISLAZIONE Direttiva 2000/13/CE D.Lgs. n. 109 del 27/01/1992 Direttiva 2003/89/CE D.Lgs. n. 114 del 08/02/2006 E sancito l obbligo per i produttori di dichiarare in etichetta tutti gli ingredienti elesostanzedaloroderivate(tabella1)abolendolaregoladel25%prevista dalla vecchia Direttiva 2000/13/CE (D. Lgs. N. 109 del 27/01/1992 a livello nazionale), secondo la quale era possibile non indicare i componenti degli ingredienti composti che rappresentavano meno del 25% del prodotto finito e la possibilità di indicare uno degli ingredienti solo con il nome della categoria di appartenenza.

3 segue LEGISLAZIONE Direttiva 2006/142/CE Integrazione della lista degli allergeni con lupino e prodotti a base di lupino e con i molluschi e prodotti a base di molluschi Direttiva 2007/68/CE a) sciroppi di glucosio a base di grano, incluso destrosio; b) maltodestrine a base di grano; c) sciroppi di glucosio a base d'orzo; d) cereali utilizzati per la fabbricazione di distillati o di alcol etilico di origine agricola per liquori ed altre bevande alcoliche Esclusione dal regime degli allergeni (obbligo di dichiarazione in etichetta) di alcuni ingredienti o sostanze alimentari derivati dagli ingredienti di cui all'allegato III bis della direttiva 2000/13/CE, in quanto gli studi effettuati e validati dall EFSA ne hanno evidenziato la non tossicità

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5 Novità nel regolamento (UE) n. 1169/2011 del Ampliamento della normativa allergeni anche a settori diversi dall industria alimentare Coinvolgimento della ristorazione collettiva. 5

6 Novità nel regolamento (UE) n. 1169/2011 del Resta il problema indefinito delle tracce Senza limiti di legge si mantiene la situazione di incertezza a livello sia delle aziende sia dei consumatori 6

7 Allegato II 7

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9 Microfluidica Test colorimetrici Microarrays SPR (BIAcore) CE HPLC PCR clamping Beacons High tech Low tech

10 RIVELAZIONE DI ALLERGENI Rivelazione diretta di proteine allergeniche (Immunobiochimici) Rivelazione di SEQUENZE SPECIFICHE DI DNA (marcatori di alimenti allergenici)

11 ELISA :vantaggi UNI EN 15633/2009 > utilizzo : tecnica sandwich con rivelazione diretta Semplicità d uso,alta sensibilità e rapidità

12 ELISA :criticità Estrazione: falsi positivi e falsi negativi Carenza di materiali di riferimento idonei Specificità degli Anticorpi: reazioni crociate Limiti di rilevazione (LOD e LOQ): ricerca di livelli sempre più bassi

13 DETERMINAZIONE DEL DNA NEGLI ALIMENTI Estrazione del DNA Amplificazione del DNA PCR singola Multiplex PCR DNA a singola/doppia elica Analisi del DNA

14 PCR :vantaggi UNIEN /2009 Specificità reazione Strumento valido per ingredienti nascosti Maggiore robustezza : DNA più termoresistente

15 PCR :criticità Estrazione: falsi positivi e falsi negativi Carenza di materiali di riferimento idonei Scarsa riproducibilità inter-kit

16 Allergeni nascosti: rivelazione simultanea di nocciola (Cor a1) e archide (Ara h2) in prodotti alimentari Sample Product Breakfast cereals Breakfast cereals with chocolate and hazelnut Müesli snack with milk chocolate Müesli snack with cocoa Snack with cereals and cocoa Cocoaand vanillawafer Hazelnut wafer Biscuit topped with cocoa cream and milk chocolate Milk chocolate Chocolate for topping Chocolate cream with hazelnut Amplificazione del DNA su alimenti che dichiarano o non dichiarano nocciola e/o arachide come possibile contaminante o ingrediente 50 B bp Limite di rivelazione : 50pg of DNA. Ara Cor

17 Rivelazione di olio di nocciola in olio di oliva con microarray a PNA The vast majority of frauds uncovered (in Italy) in the food-andbeverage sector involve this product The New Yorker, 13/8/2007 hazelnut peanut almond 5% olio di nocciola in olio di oliva SPECIFICO SENSIBILE

18 S N Test colorimetrici S N + Questa molecola può essere aggiunta alle soluzioni contenenti il DNA ed il PNA 3,3'- Dietiltiadicarbocianina (Dye) La molecola si lega a doppie eliche PNA-DNA (ma non al PNA da solo né al DNA da solo) cambiando colore DNA arachide + PNA DNA non di arachide + PNA J.O. Smith, D.A. Olson, B.A. Armitage. J. Am. Chem. Soc., 1999, 121, T. Tedeschi, S. Sforza, S. Ye, R. Corradini, A. Dossena, M. Komiyama, R. Marchelli, J. Biochem. Biophys. Meth., 2007, 70,

19 Test spettroscopici 1) Presence of the specific DNA sequence + + Amplified DNA PNA DNA-PNA duplex Dye Chiral dye aggregate CD signal at nm No amplified DNA or aspecific DNA 2) Absence of the specific DNA sequence + PNA Unbound PNA + Dye Achiral dye aggregate No CD signal at nm

20 HO Fluoroforo O Fari molecolari (BEACON) OH Spegnitore di fluorescenza N N N O O O NH O N H H N O PNA N H O N H O NH 2 O O NH Fluoroforo - + DNA Spegnitore

21 ATTIVITA DI CONTROLLO Regione Piemonte PIANI DI CONTROLLO UFFICIALE CAMPIONI INVIATI A SEGUITO DI SEGNALAZIONE DI SINTOMATOLOGIA CLINICA ALLERTE

22 Metodi analitici REG-2076/05 Dal 01/01/2010

23 CAMPIONI ESEGUITI A SEGUITO DI SEGNALAZIONE 4 CAMPIONI 2 GELATI DI SOIA PROSCIUTTO COTTO GELATO DI RISO SONO RISULTATI POSITIVI PER LA PRESENZA DI PROTEINE DEL LATTE

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27 Campionamento Campionamento ufficiale (4 o 5 aliquote) Prelievo eseguito dai Servizi Veterinari Regionali Campioni non conformi: segnalazione e possibilità richiesta analisi di revisione

28 METODI Ricerca di ovoproteine e β-lattoglobulina Metodo qualitativo 1 g di alimento + 20 ml buffer di estrazione Passaggio in Stomaker 10 a 60 C e filtrazione su membrana nitrocellulosa Kit ELISA per ovoproteine Limite di rilevabilità 0,6 mg/kg Kit ELISA per β-lattoglobulina Limite di rilevabilità 0,4 mg/kg

29 METODI Ricerca di lattosio Metodo qualitativo 5 g di campione ml finali di acqua deionizzata 15 a 70 C e filtrazione su membrana di nitrocellulosa Lettura spettrofotometrica a 340 nm di una cinetica enzimatica Limite di rilevabilità 7mg lattosio/l

30 RICERCA DI CROSTACEI IN CONSERVE E PREPARAZIONI A BASE DI PESCE Metodo qualitativo Pesare 0.5 g di campione da sottoporre a estrazione del DNA mediante kit specifico Il kit in real-time PCR amplifica un frammento di DNA presente esclusivamente nei crostacei. L amplicone ottenuto viene rilevato mediante ibridazione con una sonda legata ad un fluorocromo (Taqman ). Limite di rilevabilità 1 copia genomica di DNA di crostaceo (pari a circa 2.5 pg di DNA di crostaceo)

31 RICERCA DI MOLLUSCHI IN CONSERVE E PREPARAZIONI A BASE DI PESCE Metodo qualitativo Pesare 0.5 g di campione da sottoporre a estrazione del DNA mediante kit specifico Il kit in real-time PCR amplifica tre frammenti di DNA specifici per bivalvi, cefalopodi e gastropodi. I frammenti di DNA ottenuti vengono rilevati mediante SYBR green I. Limite di rilevabilità 1 copia genomica di DNA di mollusco (pari a circa 1.6 pg di DNA di mollusco)

32 CRITICITA Difficoltà di estrazione delle proteine da alcune matrici (es. cioccolato, carni di pollame) Difficoltà di reperimento di campioni prelevabili per il piano (dichiarazione salva OSA in etichetta può contenere tracce di..

33 LIMITI DELLE METODICHE possibili errori di interpretazione causati da: cross reattività effetto matrice eventuale necessità di una fase preliminare di purificazione e di arricchimento del campione Metodiche senza certificati di validazione (AFNOR - AOAC) Necessità di validazione in-house. Materiali di riferimento certificati e circuiti interlaboratorio non disponibili per molluschi e crostacei

34 Problematiche Allerte rifiutate per metodica non accreditata Richiesta di quantificazione da parte degli studi legali Non conformità rilevata solo con metodica di scrennig

35 SERVIZI VETERINARI β-lattoglobuline TOTALE ANALISI: % ALTRI PRODOTTI 50 % PREPARAZIONI DI CARNE 44 % PRODOTTI A BASE DI CARNE 34 campioni NON CONFORMI 3,8% 18 preparazioni di carne 13 prodotti a base di carne 3 altri prodotti

36 SERVIZI VETERINARI ovoproteine TOTALE ANALISI: % ALTRI PRODOTTI 53 % PREPARAZIONI DI CARNE 40 % PRODOTTI A BASE DI CARNE 32 campioni NON CONFORMI 3,8% 27 preparazioni di carne 4 prodotti a base di carne 1 altri prodotti

37 SERVIZI VETERINARI crostacei e molluschi TOTALE ANALISI: % CROSTACEI 69 % CROSTACEI 2 campioni NON CONFORMI 1 crostacei 1 molluschi

38 ISTITUTO ZOOPROFILATTICO SPERIMENTALE DEL PIEMONTE LIGURIA E VALLE D AOSTA Il trend Lattosio = 4,1 % 1,73% 0,8% β- lattoglobuline = 4,67 % 7,14% 2,5% Ovoproteine = 5,26 % 4,26% 4% Crostacei = 0 % 1,35% Molluschi = 0 % 1,66%

39 TOTALE ANALISI: 357 SERVIZI VETERINARI % 15% 35% 14% 35% 15% DNA Crostaceo 14% DNA mollusco 35% β-lattoglobuline 35% ovoproteine 1% lattosio (IZS Lazio e Toscana)

40 SERVIZI VETERINARI TIPO CAMPIONE TOTALE ANALISI: 357 3% NON CONFORMI ALIMENTI PRIMA INFANZIA PREP. GASTRONOMICHE READY TO EAT PRODOTTI DELLA PESCA PREPARATI PRODOTTI E CONSERVE DI CROSTACEI/MOLLUSCHI PRODOTTI E CONSERVE PESCI 97% CONFORMI SALSE PREPARATE E CONDIMENTI CARNI FRESCHE E FRATT. POLLAME CARNI FRESCHE E FRATTAGLIE PASTICCERIA E BISCOTTERIA PREP. GASTRONOMICHE BASE DI CARNE PREPARAZIONI DI CARNE PRODOTTI A BASE DI CARNE ALIMENTI PRIMA INFANZIA

41 SERVIZI VETERINARI SUDDIVISIONE NON CONFORMI prep carne pollame impasto per agnolotti salsiccia Ovoproteine (n 9 campioni) wurstel β-lattoglobuline (n 2 campioni) hamburger polpetta hamburger

42 TOTALE ANALISI: 64 SIAN % 13% 73% 73% β-lattoglobuline 13% ovoproteine 14% lattosio (IZS Lazio e Toscana)

43 TOTALE ANALISI: 64 3% NON CONFORMI SIAN TIPO CAMPIONE PASTICCERIA E BISCOTTERIA PRODOTTI A BASE DI CEREALI SOFFIATI O TOSTATI ALIMENTI PRIMA INFANZIA 97% CONFORMI CREME E PASTICCERIA FRESCA ARTIGIANALE PRODOTTI DI PANETTERIA SOIA BEVANDE NON CONFORMI per β-lattoglobuline 1 campione di Biscotto 1 campione di Alimenti prima infanzia ALIMENTI DIETETICI A FINI SPECIALI LATTE E CREMA DI LATTE FRESCHI O CONSERVATI PREPARAZIONI ALIMENTARI DIVERSE PREP. GASTRONOMICHE READY TO EAT PASTE ALIMENTARI CREME E PASTICCERIA INDUSTRIALE

44 Campioni non conformi Possibilità di richiesta dell analisi di revisione Attivazione dello stato di allerta (Intesa Stato Regioni n. 204/CSR del 13/11/ Linee guida per la gestione operativa degli stati di allerta Allegato D Criteri per notifica rischio) Applicazione dell art. 54 del Reg. CE/882/04 - prescrizioni - sanzioni amministrative (DLvo 109/92 modificato dal DLvo 181/2003 ) - penali? ipotesi di reato caratterizzate da responsabilità a titolo di colpa, artt. 589 e 590 c.p., poste a tutela della integrità della salute e della vita delle persone) art. 5 L. 283/62 lettera d) presenza di sostanze comunque nocive - limitazioni dell attività Controlli supplementari (con applicazione del DLgs 194/2008)

45 CONCLUSIONI Non conformità rilevate soprattutto in aziende di piccole dimensioni Indispensabile un piano di autocontrollo adeguato Le informazioni al consumatore devono essere trasparenti (presa di coscienza dell OSA) Utile attivare piani di monitoraggio regionali Le positività riscontrate durante il controllo ufficiale devono avere un seguito Fondamentale che tutte le Regioni attivino piani di monitoraggio o sorveglianza

46 CONCLUSIONI Importante testare nuove metodiche e rivelare possibili cross-reazioni Necessità di validare le metodiche di screening (Reg. CE 882/04) Sviluppo e validazione di metodi di conferma (spettrometria di massa, pcr)

47 ATTIVITA DI RICERCA Approvazione di progetto di Ricerca Finalizzata Ministeriale 2008 dal titolo: Messa a punto di dispositivi nanotecnologici (biosensori) per il rilevamento di allergeni in alimenti di origine animale e vegetale

48 RICERCA FINALIZZATA 2008 Riunione di apertura 14 dicembre 2010 Chi siamo Azienda Ospedaliera Maggiore della Carità Novara - Rete allergologica Regione Piemonte Consiglio Nazionale delle Ricerche - ISPA Istituto Superiore di Sanità Sperimentale del Lazio e della Toscana Sperimentale del Mezzogiorno Liguria e Valle d'aosta Sperimentale della Lombardia e dell'emilia-romagna Sperimentale della Sardegna, Sperimentale della Sicilia Sperimentale delle Venezie Sperimentale dell'umbria e delle Marche Politecnico di Torino Università Piemonte Orientale - Dip Scienze Chimiche, Alimentari, Farmaceutiche e Farmacologiche

49 RICERCA FINALIZZATA 2008 Riunione di apertura 14 dicembre 2010 Obiettivo generale Migliorare e uniformare sul territorio nazionale l applicazione di metodi analitici per la determinazione di allergeni alimentari Mettere a punto e disporre di metodi analitici innovativi di screening e metodi di conferma

50 RICERCA FINALIZZATA 2008 Riunione di apertura 14 dicembre 2010 Obiettivi specifici Valutare le performance di metodi analitici (commerciali o homemade) per la determinazione di allergeni Ottenendo dati circa sensibilità, specificità, LOD, LOQ, di metodi quali ELISA, PCR, Consolidare utilizzo di protocolli standardizzati e condivisi per il controllo ufficiale sul territorio nazionale (metodi con performance sovrapponibili, garantendo risultati comparabili ) Verificare l applicazione di metodi quantitativi o semiquantitativi Indagando sulla possibilità di definire un livello accettabile Mettere a punto nuovi metodi (cantilever) Definendo il grado di denaturazione di alcune proteine; identificando Ac da utilizzare anche contro marker di altre proteine allergizzanti

51 Nano-biosensori meccanici CANTILEVERS Sono costituiti da travi fissate ad una estremità PRINCIPIO: sfruttano i cambiamenti delle loro proprietà meccaniche (risonanza delle leve) dovuti alla presenza/assenza di determinate molecole Sensore statico dinamico si muove per reazione se intercetta la molecola a cui è sensibile, non per la modifica del peso la leva si muove comunque, ciò che varia è la frequenza di risonanza che è inversamente proporzionale alla massa/peso, se intercetta qualcosa diventa quindi più lenta.

52 Metodo innovativo CANTILEVERS metodo meccanico e non chimico per sondare interazioni di tipo molecolare Applicazioni: Vantaggi: la presenza di un batterio o di un antigene fa cambiare la frequenza di risonanza il sensore comunica mediante un segnale laser, registrando la modifica della sua riflessione analisi più precise campioni più piccoli rileva sostanze presenti in quantità minime

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54 Ministero della Salute DIPARTIMENTO PER LA SANITA PUBBLICA VETERINARIA, LA NUTRIZIONE E LA SICUREZZA DEGLI ALIMENTI DIREZIONE GENERALE DELLA SICUREZZA DEGLI ALIMENTI E DELLA NUTRIZIONE Direttore Dott. Silvio Borrello Documento di indirizzo e stato dell arte ALLERGIE ALIMENTARI E SICUREZZA DEL CONSUMATORE

55 Linee guida..considera ALLERGIA ALIMENTARE: aspetti clinici,diagnostici ed epidemiologici Metodiche per determinazione di allergeni in alimenti Metodi immunochimici e criticità Metodi di biologia molecolare e criticità Metodi cromatografici e criticità Criteri di validazione ed accettabilità delle metodiche analitiche Criticità : raccolta dati,mancanza di limiti di legge per i diversi allergeni nell alimento in relazione alla soglia di tolleranza individuale

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