N. CORTESI 1,P.FUSARI 1,C.GIGLIOTTI 2

Transcript

1 Indagine quadriennale sulla contaminazione da Idrocarburi Policiclici Aromatici in oli di oliva e valutazione del contenuto del benzo(a)pirene come indicatore della loro presenza N. CORTESI 1,P.FUSARI 1,C.GIGLIOTTI 2 1) STAZIONE SPERIMENTALE PER LE INDUSTRIE DEGLI OLI E DEI GRASSI - MILANO 2) DIPARTIMENTO DI SCIENZE BIOMEDICHE E BIOTECNOLOGIE - UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI BRESCIA La sperimentazione qui presentata vuole rispondere adeguatamente alla Raccomandazione della Commissione del 4 febbraio 2005 della Comunità Europea riguardante la contaminazione da IPA in oli alimentari. In suddetta Raccomandazione si chiede di dimostrare l esistenza, attraverso supporti tecnico-scientifici, di una possibile correlazione tra il contenuto del benzo(a)pirene e il contenuto totale di tutti gli altri IPA. Sulla base di un approccio statistico l obiettivo che ci siamo prefissati è stato quello di confermare il benzo(a)pirene, attuale marker di contaminazione, come indicatore della contaminazione generale da IPA. I risultati presentati sono stati ottenuti attraverso lo studio dei dati ricavati dall analisi degli IPA in oli di oliva vergini e raffinati presenti sul mercato italiano negli anni A FOUR YEAR RESEARCH ON POLYCYCLIC AROMATIC HYDROCARBONSIN OLIVE OIL AND EVALUATION OF BENZO(A)PYRENE CONTENT ASMARKER OF THEIR PRESENCE This project aims to adequately respond to CE recommendation (February 4 th, 2005) regarding PAH contamination in food and at providing technical and scientific support to focus the correlation between benzo(a)pyrene, existing marker, and other polyciclic aromatic hydrocarbons to make an appropriate risk assesment. On the basis of a statistic approach, the objective is to contribute at regarding benzo(a)pyrene the appropriate marker of PAH recommended general contamination. The results have been focused on the IPA content of virgin and refined olive oils, present on the Italian market in the years. INTRODUZIONE Gli idrocarburi policiclici aromatici (IPA), composti derivanti dalla fusione di anelli benzenici a diversa conformazione sterica, sono contaminanti ubiquitari, distribuiti in tutti i comparti ambientali. La maggior parte contiene solo carbonio e idrogeno, ma vi sono anche composti sostituiti quali nitro e ossigeno derivati, la cui pericolosità è stata dimostrata essere ancora più elevata dei composti precursori [1]. Tutti i processi spontanei di combustione, alcune attività industriali, la combustione dei rifiuti agricoli e forestali e i gas di scarico dei veicoli, generano IPA che si riversano soprattutto nell atmosfera. Ne risulta una contaminazione ambientale estremamente estesa che interessa in particolare i vegetali a causa anche delle precipitazioni atmosferiche. La contaminazione da IPA nella filiera alimentare è abbastanza diffusa, a causa della loro possibile presenza nella materia prima a cui si può aggiungere un ulteriore contaminazione dovuta ai trattamenti termici severi a cui vengono sottoposte determinate tipologie di alimenti. Nell ambito della sicurezza alimentare, dalla numerosa letteratura presente, appare evidente il crescente interesse mostrato dagli studiosi all approfondimento delle conoscenze relative agli IPA e, in particolare, alla possibilità di utilizzare il benzo(a)pirene [B(a)P] come indicatore del contenuto totale di IPA e del rischio cancerogeno per l intera classe. La normativa in vigore [2] fissa, per gli oli e i grassi ad uso alimentare, un limite solo per il contenuto di benzo(a)pirene ( 2 ng/g) ma la concomitante presenza degli IPA pesanti sempre riscontrata dagli studi finora effettuati ha indotto recentemente la Commissione della Comunità Europea [3], a rivolgere ai ricercatori l invito a presentare entro il 2007 dati che avvalorino, attraverso evidente e robusta consistenza, l ipotesi di poter considerare il contenuto in B(a)P rappresentativo anche della contaminazione degli IPA classificati dallo IARC come possibili o probabili cancerogeni per l uomo (settore di classificazione B 2 ), in taluni prodotti alimentari. Lo scopo primario di tale invito è sicuramente indirizzato alla costituzione di più banche dati che portino alla mappatura della reale contaminazione da IPA nei diversi Paesi europei e alla risoluzione delle problematiche analitiche legate all analisi degli IPA. Tali problematiche sono attualmente in fase di risoluzione con la messa a punto di nuovi metodi analitici più affidabili e riproducibili, almeno per quanto riguarda gli oli alimentari ad uso più comune. La realizzazione di un consistente data base, relativo al contenuto di IPA in oli di oliva vergini e raffinati, in oli di sansa di oliva e in oli di semi provenienti dal commercio e relativi al quadriennio , ci consente di rispondere alla raccomandazione della Commissione della Comunità Europea. Più in dettaglio, con questo studio si intende effettuare inizialmente, un indagine conoscitiva sul contenuto di IPA in campioni di oli di differente tipologia presenti su tutto il territorio nazionale al fine di disporre di una panoramica sulla situazione della contaminazione da IPA negli oli commerciali e successivamente, mediante appropriate tecniche statistiche, veri- Correspondence: Dr. Nicola Cortesi, Stazione Sperimentale Oli e Grassi, Via Giuseppe Colombo, 79, Milano, tel LA RIVISTA ITALIANA DELLE SOSTANZE GRASSE - VOL. LXXXIII - LUGLIO/AGOSTO

2 ficare la reale presenza di una relazione tra contenuto di B(a)P e contenuto di IPA, per confermare o meno la possibilità di utilizzare il B(a)P come indicatore della presenza degli altri IPA. La sperimentazione presenta i risultati ottenuti su oli extravergini di oliva, oli di oliva e oli di sansa di oliva, al momento questi ultimi i più discussi a livello di affidabilità analitica. I dati riguardanti le altre tipologie di oli vegetali considerate (olio di girasole, olio di mais, olio di vinaccioli, olio di palma e olio di cocco), attualmente in fase di elaborazione, faranno parte di un successivo lavoro. presenti sul mercato negli anni , ed è quindi antecedente alla raccomandazione stessa. I set di dati per l analisi informativa di distribuzione sono relativi a 236 campioni di oli di oliva extravergini e a 200 campioni di oli di oliva, mentre per l analisi delle correlazioni i set di dati, in relazione al contenuto in IPA, sono relativi a 55 campioni di oli di oliva extravergini e a 87 campioni di oli di oliva. L analisi degli oli di sansa di oliva costituisce un set di dati di 56 campioni; per l analisi delle correlazioni, il set di dati è relativo a 22 campioni. MATERIALI E METODI Il database utilizzato raccoglie i dati ottenuti da campioni pervenuti al nostro laboratorio negli anni , analizzati applicando la metodica sviluppata da Cortesi e Fusari [4] e sottoposta a procedura di validazione mediante analisi interlaboratorio, effettuata dai membri della Commissione Tecnica Governativa. I risultati di tale validazione hanno dimostrato che la metodica rientra nei criteri di accettabilità relativi alle prestazioni per i metodi di analisi del benzo(a)pirene richieste dalla Direttiva 2005/10/CE della Commissione della Comunità Europea [5]. In totale si sono analizzati 495 campioni di olio così suddivisi: 236 oli di oliva extravergine, 200 oli di oliva, 23 oli di sansa grezzi, 56 oli di sansa di oliva. Nell affrontare la richiesta della Commissione, la domanda a cui si deve rispondere è essenzialmente se le eventuali correlazioni trovate fra le serie di dati a nostra disposizione si debbano imputare a fattori causali specifici o solamente a fattori casuali, e se sia possibile pervenire a conclusioni valide che possano essere estese ad altre realtà produttive di oli di oliva (comunitarie ed extracomunitarie). A tal fine, tutti i dati analitici ottenuti sono stati sottoposti alle seguenti valutazioni statistiche: analisi descrittiva, analisi delle correlazione, verifica della significatività della correlazione, analisi di regressione, calcolo dell intervallo di confidenza. Per effettuare l elaborazione statistica i campioni sono stati suddivisi in gruppi corrispondenti alle categorie commerciali indagate: olio di oliva extravergine, olio di oliva e olio di sansa di oliva. In base al contenuto in IPA, il database relativo ai singoli oli è stato creato in modo omogeneo mediante il protocollo seguente: per una valutazione globale della situazione sul mercato italiano negli ultimi 4 anni, sono stati presi in considerazione sia oli con contenuto in benzo(a)pirene maggiore o uguale al valore di LOD pari a 0,2 ng/g, sia oli con contenuto in benzo(a)pirene maggiore o uguale al valore di LOQ pari a 0,5 ng/g; per l indagine di correlazione fra il benzo(a)pirene e gli idrocarburi policiclici aromatici indicati nella raccomandazione della Commissione della Comunità Europea, e cioè benzo(a)antracene, benzo(b)fluorantene, benzo(k)fluorantene, benzo(g,h,i)perilene, crisene, dibenzo(a,h)antracene e indeno(1,2,3-c,d)pirene, sono stati presi in considerazione solo oli con contenuto in benzo(a)pirene LOQ; relativamente a benzo(j)fluorantene, ciclopenta(c,d)pirene, dibenzo(a,e)pirene, dibenzo(a,h)pirene, dibenzo(a,i)pirene, dibenzo(a,l)pirene e 5-metilcrisene contemplati anch essi nella raccomandazione, i dati relativi a questi IPA non vengono inclusi nella presentazione poiché il database qui utilizzato è relativo a campioni RISULTATI E DISCUSSIONE Dall analisi dei dati riportati nelle Tabelle I e II appare subito evidente che la contaminazione da IPA per gli oli extravergini di oliva e per quelli di oliva, presenti sul mercato italiano negli anni , è del tutto rassicurante: in base all attuale limite di legge (benzo(a)pirene 2 ng/g) la percentuale di oli che rientra in tali limiti di legge è superiore al 95 % e di questi una rilevante percentuale è addirittura inferiore al limite di quantificazione del metodo (LOQ = 0,5 ng/g). La stessa tendenza si osserva per gli altri IPA esaminati (Figure 1 e 2). In altri termini la distribuzione di frequenza del contenuto in IPA offre una lettura rapida della tendenza centrale della serie di dati e contemporaneamente una misura della loro dispersione. Gli istogrammi forniscono una lettura immediata della percentuale di frequenza del contenuto dei differenti IPA negli oli esaminati, danno una indicazione più rapida e intuitiva della congiunta variabilità degli stessi e rendono più veloce il confronto con il limite legale del BaP. Dagli istogrammi si evidenzia come sia negli oli vergini sia negli oli di oliva, per diversi campioni il benzo(a)antracene e il crisene superino il limite di legge di 2 ng/g in maggior misura rispetto agli altri IPA e che il crisene mostra addirittura una inversione dei rapporti di frequenza tra le prime due classi ( LOQ e 2ng/g). Tale allontanamento dalla tendenza generale degli altri IPA è da attribuire alla loro struttura chimica: essi rientrano, infatti, nella classe degli IPA leggeri, la cui distribuzione non appare sempre così strettamente legata come quella rilevata per gli IPA pesanti. Questo riscontro diventerebbe ancora più evidente se si estendesse tale analisi a tutta la classe degli IPA leggeri. La conclusione su tale indagine, rassicurante dal punto di vista della sicurezza alimentare, è avvalorata anche dalla metodologia analitica utilizzata, caratterizzata da una notevole semplificazione della preparazione del campione, validata per accuratezza, precisione e recupero, risultato maggiore del 90 % per tutti gli IPA considerati [4]. Una trattazione a parte merita l olio di sansa di oliva in cui gli IPA e i loro derivati di trasformazione ossidativa creano discrepanze analitiche di non facile risoluzione, soprattutto a causa di una notevole disomogeneità del loro profilo: si sono analizzati sia campioni che non presentano grosse difficoltà di interpretazione analitica sia campioni con tracciati cromatografici di estrema complessità. Il problema analitico fondamentale risiede nel fatto che non è possibile stabilire un olio di sansa tipo : la provenienza, le pratiche agronomiche e le modalità di raffinazione incidono in maniera rilevante sul profilo cromatografico, nel quale sono rilevabili interferenze dovute a composti la cui struttura è tuttora ignota ma caratterizzati da uno spettro di assorbimento UV spesso molto simile a quello di IPA noti. 152 LA RIVISTA ITALIANA DELLE SOSTANZE GRASSE - VOL. LXXXIII - LUGLIO/AGOSTO 2006

3 Tabella I - Distribuzione % del contenuto in IPA di 236 campioni di oli extra vergini di oliva presenti sul mercato italiano negli anni B(a)A Crisene B(a)P B(e)P B(b)F B(k)F DB(a,h)A B(g,h,i)Per Ind(1,2, 3c,d)Pir LOQ 49,2 10,2 76,3 64,0 73,7 84,3 95,8 61,0 81,8 > LOQ 2 ng/g 39,4 63,6 22,9 27,1 17,8 8,5 4,2 30,1 12,7 2 ng/g (limite legge B(a)P) 88,6 73,7 99,2 91,1 91,5 92,8 100,0 91,1 94,5 > 2 ng/g 11,4 26,3 5,9 7,2 7,2 5,5 0,0 6,4 4,2 B(a)A = benzo(a)antracene; B(a)P = benzo(a)pirene; B(b)F = benzo(b)fluorantene; B(k)F = benzo(k)fluorantene; DB(a,h)A = dibenzo(a,h)antracene; B(g,h,i)Per = benzo(g,h,i)perilene; Ind(1,2,3-c,d)Pir = indeno(1,2,3-c,d)pirene Tabella II - Distribuzione % del contenuto in IPA di 200 campioni di oli di oliva presenti sul mercato italiano negli anni B(a)A Crisene B(a)P B(e)P B(b)F B(k)F DB(a,h)A B(g,h,i)Per Ind(1,2, 3c,d)Pir LOQ 48,7 23,4 67,7 57,4 69,1 81,8 99,3 58,8 85,5 > LOQ 2 ng/g 34,6 51,3 29,0 32,3 28,6 16,0 0,7 38,6 13,3 2 ng/g (limite legge B(a)P) 83,3 74,7 96,7 89,7 97,7 97,8 100,0 97,4 98,8 > 2 ng/g 15,2 25,3 3,4 10,8 1,5 1,5 0,0 2,6 0,7 Per le sigle vedere nota Tabella I Tabella III - Distribuzione % del contenuto in IPA in 56 campioni di oli di sansa di oliva presenti sul mercato italiano negli anni B(a)A Crisene B(a)P B(e)P B(b)F B(k)F DB(a,h)A B(g,h,i)Per Ind(1,2, 3c,d)Pir LOQ 32,1 48,2 54,0 17,9 25,0 50,0 96,4 53,6 63,2 > LOQ 2 ng/g 50,0 25,0 34,0 64,3 55,4 30,4 3,6 32,1 32,0 2 ng/g (limite legge B(a)P) 82,1 73,2 88,0 82,2 80,4 80,4 100,0 85,7 95,2 > 2 ng/g 8,9 16,1 4,0 8,9 10,7 8, ,4 4,8 Per le sigle vedere nota Tabella I Durante i 4 anni di sperimentazione l analisi degli oli di sansa grezzi non ha mostrato, come atteso, una netta tendenza verso un decremento del contenuto in IPA-P (IPA- Pesanti) e in IPA-DM (IPA-Decreto Ministeriale [6]), come si può evidenziare dall andamento (Figura 3) relativo agli oli di sansa grezzi analizzati nel periodo (18 campioni) e da quello di oli più recenti (anno 2005; 5 campioni). Il contenuto riguardante la somma degli IPA-P è compreso tra 12 ng/g e 530 ng/g, il contenuto relativo al somma degli IPA-DM, calcolato sugli stessi campioni, oscilla tra 57 ng/g e 1380 ng/g: anche in questo caso è evidente l influenza di benzo(a)antracene e crisene sull incremento del loro contenuto. Gli oli di sansa grezzi analizzati più recentemente (anno 2005) mostrano valori dispersi che rientrano negli intervalli sopra considerati senza un valore medio che induca ad avvalorare l ipotesi di un decremento dovuto a sostanziali modifiche apportate ai processi di essiccamento per minimizzare la formazione di IPA. La distribuzione % del contenuto dei singoli IPA è presentata nella Tabella III e nella Figura 4. L andamento non si discosta in maniera significativa da quello degli oli extravergini e degli oli di oliva: anche in questo tipo di campioni benzo(a)antracene e soprattutto crisene si discostano maggiormente dagli IPA pesanti. Figura 1 - Distribuzione del contenuto in IPA di 236 oli extravergini di oliva presenti sul mercato italiano negli anni Figura 2 - Distribuzione del contenuto in IPA di 200 campioni di oli di oliva presenti sul mercato italiano negli anni LA RIVISTA ITALIANA DELLE SOSTANZE GRASSE - VOL. LXXXIII - LUGLIO/AGOSTO

4 Più in dettaglio rispetto a quanto già detto, per poter rispondere in maniera adeguata alla raccomandazione della Commissione sulla rappresentatività del benzo(a)pirene come marcatore della contaminazione da IPA, l ipotesi che si deve verificare per considerare vero tale assunto è se esiste correlazione tra il contenuto in benzo(a)pirene e il contenuto dei differenti IPA, sia considerati singolarmente sia nel loro complesso, attraverso metodi di statistica inferenziale e successivamente valutare la significatività di tale correlazione, per poter validare i risultati dei dati campionari ed estenderli alla popolazione dalla quale il campione è stato tratto. Primo passo logico è stato la costruzione di un diagramma a dispersione per ogni singolo IPA rispetto al benzo(a)pirene per tutte le tipologie di oli in esame: sull asse delle ascisse è sempre stato messo il benzo(a)pirene in quanto considerato la variabile predittore del contenuto degli altri IPA considerati. Per tale indagine sono stati logicamente presi in considerazione solo gli oli con contenuto in benzo(a)pirene al valore LOQ della metodica. Per gli oli extravergini (Figura 5) e quelli di oliva (Figura 6), i diagrammi a dispersione, sia fra benzo(a)pirene e ogni singolo IPA considerato, sia fra benzo(a)pirene e somma degli stessi, mostrano chiaramente che una linea retta può adeguatamente descrivere la tendenza fra le variabili. Il passaggio successivo è stato quindi il calcolo del coefficiente di correlazione di Pearson (Tabelle IV e V) che permette di determinare la loro covarianza. I coefficienti di correlazione indicano un elevata e positiva correlazione tra le variabili sia per gli oli extravergini sia per quelli di oliva. Per quanto concerne gli oli di sansa di oliva, malgrado derivino da sansa grezzi a diversa contaminazione e soprattutto soggetti a trattamenti di raffinazione più o meno drastici che tendono ad abbassare il livello di IPA al valore limite di legge del benzo(a)pirene, ugualmente il coefficiente di correlazione di Pearson, sia per tutte le coppie considerate sia per il benzo(a)pirene rispetto alla somma di tutti gli IPA, non si discosta dai valori osservati per gli oli extravergini e gli oli di oliva (Tabella VI). Nonostante il set di dati dei nostri campioni presenti un contenuto in benzo(a)pirene per la massima parte compreso tra 0,5 e 1 ng/g (Tabella VII), si conferma l esistenza della correlazione tra il contenuto in benzo(a)pirene ed il contenuto di IPA-DM. Appare comunque evidente, come è anche chiaramente emerso dall analisi interlaboratorio effettuata dalla Commissione Tecnica Governativa nel luglio 2005 che, nonostante i valori di precisione valutati attraverso HORRAT r e HORRAT R rientrino nei limiti minimi posti dalla Direttiva Europea 2005/10/CE [5], esiste la presenza di problematiche analitiche nella quantificazione del benzo(a)pirene in questo tipo di matrice. La conferma di tale tesi è avvalorata dal valore di RSD R % ricavato dall elaborazione statistica dei dati ottenuti dall analisi interlaboratorio di cui sopra. Per testare la significatività della correlazione, riferendoci ai soli dati ottenuti per gli oli extravergini, gli unici la cui contaminazione da IPA non è alterata dal processo tecnologico di Figura 3 - Andamento del contenuto in IPA-P e in IPA-DM in oli di sansa grezzi durante gli anni Figura 5 - Diagramma a dispersione relativo al contenuto in B(a)P e alla somma di IPA-DM di 55 campioni di olio extra vergine di oliva presenti sul mercato italiano analizzati nel corso degli anni Figura 4 - Distribuzione % del contenuto in IPA in 56 campioni di oli di sansa di oliva negli anni Figura 6 - Diagramma a dispersione relativo al contenuto di B(a)P e alla somma di IPA-P relativo a 87 campioni di olio di oliva presenti sul mercato italiano analizzati nel corso degli anni LA RIVISTA ITALIANA DELLE SOSTANZE GRASSE - VOL. LXXXIII - LUGLIO/AGOSTO 2006

5 Tabella IV - Coefficienti di correlazione della relazione che lega il benzo(a)pirene agli altri idrocarburi policiclici aromatici (IPA). Il database è costituito da 55 campioni di oli di oliva extra vergini caratterizzati da un contenuto in benzo(a)pirene superiore al limite di quantificazione del metodo (LOQ = 0,5 ng/g) IPA r Benzo(a)pirene/benzo(a)antracene 0,97 Benzo(a)pirene/crisene 0,94 Benzo(a)pirene/benzo(b)fluorantene 0,98 Benzo(a)pirene/benzo(k)fluorantene 0,99 Benzo(a)pirene/dibenzo(a,h)antracene 0,85 Benzo(a)pirene/benzo(g,h,i)perilene 0,96 Benzo(a)pirene/benzo(e)pirene 0,92 Benzo(a)pirene/indeno(1,2,3-c,d)pirene 0,93 Benzo(a)pirene/somma IPA-P 1,00 Benzo(a)pirene/somma IPA-DM 0,99 Tabella V - Coefficienti di correlazione della relazione che lega il benzo(a)pirene agli altri idrocarburi policiclici aromatici (IPA). Il database è costituito da 87 campioni di oli di oliva caratterizzati da un contenuto in benzo(a)pirene superiore al limite di quantificazione del metodo (LOQ = 0,5 ng/g) IPA r Benzo(a)pirene/benzo(a)antracene 0,74 Benzo(a)pirene/crisene 0,60 Benzo(a)pirene/benzo(b)fluorantene 0,95 Benzo(a)pirene/benzo(k)fluorantene 0,86 Benzo(a)pirene/dibenzo(a,h)antracene 0,65 Benzo(a)pirene/benzo(g,h,i)perilene 0,90 Benzo(a)pirene/benzo(e)pirene 0,94 Benzo(a)pirene/indeno(1,2,3-c,d)pirene 0,83 Benzo(a)pirene/somma IPA-P 0,97 Benzo(a)pirene/somma IPA-DM 0,86 Tabella VI - Coefficienti di correlazione della relazione che lega il benzo(a)pirene agli altri idrocarburi policiclici aromatici (IPA). Il database è costituito da 22 campioni di oli di sansa di oliva caratterizzati da un contenuto in benzo(a)pirene superiore al limite di quantificazione del metodo (LOQ = 0,5 ng/g) IPA r Benzo(a)pirene/benzo(a)antracene 0,87 Benzo(a)pirene/crisene 0,84 Benzo(a)pirene/benzo(b)fluorantene 0,87 Benzo(a)pirene/benzo(k)fluorantene 0,83 Benzo(a)pirene/dibenzo(a,h)antracene 0,88 Benzo(a)pirene/benzo(g,h,i)perilene 0,63 Benzo(a)pirene/benzo(e)pirene 0,88 Benzo(a)pirene/indeno(1,2,3-c,d)pirene 0,61 Benzo(a)pirene/somma IPA-P 0,91 Benzo(a)pirene/somma IPA-DM 0,89 raffinazione, i valori di r ottenuti, per 53 gradi di libertà, assumendo che le variabili seguano una distribuzione normale bivariata, danno tutti un valore di P compreso tra 0,001 e 0,01 per un test a una coda e tra 0,002 e 0,02 per un test a due code, conseguentemente la probabilità di estrarre un campione con 53 gradi di libertà, con un valore di r = 0,85 (e a maggior ragione > 0,85), da una popolazione a rho = 0 Tabella VII - Dati relativi al contenuto in benzo(a)pirene e alla somma degli IPA-P e degli IPA-DM di oli di sansa di oliva presenti sul mercato italiano anni Benzo(a)pirene IPA-P IPA-DM 0,5 2,2 3,5 0,5 2,9 4,2 0,5 2,5 3,8 0,5 2,9 3,9 0,5 3,5 4,1 0,5 2,9 5,2 0,6 3,0 5,6 0,6 3,3 4,9 0,6 3,5 4,9 0,6 2,3 3,4 0,6 7,3 18,1 0,7 3,6 6,4 0,7 3,7 6,0 0,7 3,2 4,7 0,8 3,2 5,5 0,9 3,4 4,7 1,0 2,8 4,9 1,5 9,5 27,5 1,5 8,4 26,4 1,9 14,3 70,3 2,2 27,8 81,0 2,2 22,3 75,5 (nostra ipotesi nulla H 0 ), è fra 0,2 % e 2 %. Questo risultato rappresenta una marcata evidenza dell esistenza di una correlazione all interno della popolazione da cui i campioni sono stati ottenuti. Anche utilizzando un t-test modificato, il valore t ottenuto con 53 gradi di libertà (test t a 2 code) indica che la probabilità di ottenere questo campione da una popolazione a correlazione 0 è tra 0,01 e 0,002. I valori dei coefficienti di correlazione ottenuti per gli oli di oliva sono relativamente più bassi per le coppie benzo(a)pirene-benzo(a)antracene e benzo(a)pirene-crisene. Questo può essere attribuito al processo di raffinazione che altera gli equilibri naturali, soprattutto per queste coppie di variabili. Per gli altri IPA i coefficienti di correlazione si allineano con quelli degli oli extravergini. Sia per gli oli extravergini sia per quelli di oliva va sottolineato che il valore del coefficiente di correlazione tra il benzo(a)pirene e la somma degli IPA-DM è minore di quello riscontrato tra il benzo(a)pirene e la somma degli IPA-P, per l influenza, come già osservato precedentemente, del benzo(a)antracene e del crisene che presentano una maggior dispersione rispetto agli IPA pesanti. La correlazione indica la forza dell associazione fra le variabili esaminate, ma per poter considerare il benzo(a)pirene predittore del contenuto degli altri IPA (siano essi gli IPA-P o gli IPA-DM) è necessario l utilizzo di un test statistico quale la regressione lineare ordinaria ai minimi quadrati che permette di predire il contenuto della somma di IPA-P e della somma di IPA-DM dal contenuto della variabile predittore benzo(a)pirene, e l errore standard della predizione cioè la stima puntuale della deviazione standard dei residui. Le equazioni delle regressione IPA-DM-benzo(a)pirene e IPA-P-benzo(a)pirene ottenute sono: per gli oli extravergini di oliva IPA-DM (ng/g) = 4,18 + 5,81 B(a)P (ng/g) ; errore standard (Sy/x) = 4,0015 LA RIVISTA ITALIANA DELLE SOSTANZE GRASSE - VOL. LXXXIII - LUGLIO/AGOSTO

6 IPA-P (ng/g) = 1,56 + 3,55 B(a)P (ng/g) ; errore standard (Sy/x) = 2,9179 e per gli oli di oliva IPA-DM (ng/g) = 3,25 + 6,41 B(a)P (ng/g) ; errore standard (Sy/x) = 5,4632 IPA-P (ng/g) = 0,74 + 3,47 B(a)P (ng/g) ; errore standard (Sy/x) = 1,3241 Dalla comparazione delle equazioni ottenute per gli IPA- DM e per gli IPA-P appare chiara l influenza del benzo(a)antracene e del crisene sul valore dell intercetta. I test di significatività per l intercetta e la pendenza sono significativamente diversi da 0 per entrambi i dati campionari. Dimostrata la validità dell ipotesi, viene calcolato l intervallo di confidenza della retta di regressione per α pari a 0,05 all interno del quale la relazione tra benzo(a)pirene e gli altri IPA è rispettata, attraverso la formula: Y* ± t n 2, α = 0,05 Sy/x dove: Y* = contenuto in ng/g della somma IPA-DM (o IPA- P) ottenuto dall equazione della regressione t n-2, α = 0,05 = valore critico t (a due code) per n-2 gradi di libertà e α = 0,05 Sy/x n = errore standard della regressione = numero dei dati campionari Relativamente agli oli di sansa di oliva, i campioni analizzati hanno permesso di valutare la significatività della correlazione, ma in funzione del contenuto in benzo(a)pirene che nel 77,3 % dei campioni è fra 0,5 e 1,0 ng/g e in considerazione del fatto che il dato analitico per questo tipo di matrice, come è emerso anche dai risultati del circuito interlaboratorio, soffre di uno scarto tipo relativo (RSD) molto più elevato rispetto alle altre matrici esaminate, al presente i risultati che si possono trarre analizzando i dati raccolti in Tabella VII sono: per un contenuto di benzo(a)pirene compreso fra 0,5 e 1,0 ng/g il contenuto della somma degli IPA-P è compreso tra 2,2 e 7,3 ng/g, con un valore medio di 3,3 ng/g e uno scarto tipo (s) pari a 1,12 ng/g; il contenuto della somma degli IPA-DM è compreso tra 3,4 e18,1 ng/g, con un valore medio di 5,5 ng/g e s pari a 3,35 ng/g; per un contenuto di benzo(a)pirene compreso fra 1,1 e 2,2 ng/g il contenuto della somma IPA-P è compreso tra 8,4 e 27,8 ng/g, con un valore medio di 16,5 ng/g e s uguale a 8,38 ng/g; il contenuto della somma IPA-DM è compreso tra 26,4 e 81,0 ng/g, con un valore medio di 56,1 ng/g e s pari a 26,92 ng/g. La considerazione che si può trarre è che la maggior parte dei campioni di oli di sansa di oliva presenti sul mercato italiano, in funzione dei processi di raffinazione attuati che riducono la contaminazione da IPA generati nei processi di essiccamento delle sanse, presentano un contenuto in benzo(a)pirene 1,0 ng/g. Intorno a questo valore i valori del contenuto in IPA-P e in IPA-DM si aggirano attorno a valori medi con una dispersione accettabile dei singoli valori, mentre al di sopra di 1,0 ng/g, pur considerando l incertezza del dato analitico per questo tipo di matrice, per una più marcata presenza di interferenze, sembra esserci una relazione non lineare tra il contenuto in benzo(a)pirene e il contenuto in IPA-P e IPA-DM. CONCLUSIONI La sperimentazione qui presentata conferma l ipotesi della Tabella VIII - Fattore equivalente di tossicità relativa ai singoli IPA IPA TEF Classe Dibenzo(a,h)antracene 5,000 H Benzo(a)pirene 1,000 H Benzo(a)antracene 0,100 L Benzo(b)fluorantene 0,100 H Benzo(k)fluorantene 0,100 H Antracene 0,010 L Benzo(g,h,i)perilene 0,010 H Crisene 0,010 L Acenaftene 0,001 L Acenaftilene 0,001 L Fluorantene 0,001 L Fluorene 0,001 L Naftalene 0,001 L Fenantrene 0,001 L Pirene 0,001 L TEF = Fattore equivalente di tossicità relativa; H = IPA pesanti, L = IPA leggeri relazione tra il contenuto in benzo(a)pirene e la somma del contenuto degli IPA riportati nella Gazzetta ufficiale n. L 034 del 08/02/2005 e quindi la validità dell uso del benzo(a)pirene come indicatore della contaminazione generale da IPA. Dai dati sperimentali è emerso come la raffinazione non solo riduce la contaminazione da IPA ma ne modifica anche i rapporti, in particolare per gli IPA che presentano caratteristiche chimico/fisiche intermedie fra IPA leggeri e pesanti quali benzo(a)antracene e crisene. Considerando i fattori equivalenti di tossicità (Tabella VIII) relativi ai singoli IPA, si sottolinea che il dibenzo(a,h)antracene, per altro quello caratterizzato dal massimo livello di tossicità, è risultato nei set di dati di questa sperimentazione al di sotto dei limiti di quantificazione del metodo nel 95,8 % dei casi per gli oli extravergini e addirittura per il 99,3 % dei casi per gli oli di oliva. Per quanto concerne il benzo(a)pirene, composto a cui è stato attribuito un fattore TEF pari a 1.000, superiore quindi a quello di tutti gli altri IPA presi in esame, non solo il suo uso come marker è indicativo della contaminazione, ma diventa anche conseguentemente indicatore di sicurezza alimentare. BIBLIOGRAFIA [1] NISBET, LAGOY, Regulatory Toxicology and Pharmacology 16, (1992) [2] Regolamento CE n. 208/2005 del 4 febbraio 2005, pubblicato su Gazzetta Ufficiale della Comunità Europea dell 8 febbraio 2005 estratto n. L. 34/3 [3] Raccomandazione della Commissione del 4 febbraio 2005, pubblicato su Gazzetta Ufficiale della Comunità Europea dell 8 febbraio 2005 estratto n. L. 34/43 [4] N. CORTESI, P. FUSARI, Progressi nella determinazione degli Idrocarburi Policiclici Aromatici in matrici lipidiche. Riv. Ital. Sostanze Grasse 82 (4), (2005) [5] Direttiva 2005/10 CE del 4 febbraio 2005, pubblicato su Gazzetta Ufficiale della Comunità Europea dell 8 febbraio 2005 estratto n. L. 34/15 [6] Ordinanza Ministeriale del 18 settembre 2001, pubblicata su Gazzetta Ufficiale della Repubblica Italiana n. 225 del 27 settembre LA RIVISTA ITALIANA DELLE SOSTANZE GRASSE - VOL. LXXXIII - LUGLIO/AGOSTO 2006