Altri Contributi. AO Spedali Civili, Brescia 2Dipartimento Ostetrico Ginecologico, 1 Divisione Ginecologia - Centro di Ginecologia Endocrinologica,

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1 Altri Contributi Diagnosi e terapia precoce cambiano la storia naturale della malattia, bloccando l espressione del fenotipo in pazienti con gravi alterazioni del gene della 21-α-idrossilasi Giovanna Bugari 1, Alessandro Gambera 2, Roberta Franceschini 1, Guido Galleri 2, Paola Rossana Martini 3, Maria Gervasi 1, Pasquale Scagliola 2, Luigi Caimi 1, Carmelo Iacobello 1, Diego Di Lorenzo 1 1Dipartimento di Diagnostica di laboratorio, 3 Laboratorio - Ormonologia e Tossicologia - Biotecnologie, AO Spedali Civili, Brescia 2Dipartimento Ostetrico Ginecologico, 1 Divisione Ginecologia - Centro di Ginecologia Endocrinologica, AO Spedali Civili - Università degli Studi, Brescia 3Dipartimento di Medicina, Clinica Medica II - Servizio di Endocrinologia, AO Spedali Civili Università degli Studi, Brescia RIASSUNTO ll deficit dell enzima 21α-idrossilasi è la più frequente causa di iperplasia surrenalica congenita. Il gene responsabile CYP21 è localizzato sul cromosoma 6. L alterata attività dell enzima trascritto determina una deviazione dei precursori steroidei della via dei mineral-corticoidi e dei gluco-corticoidi verso la via degli androgeni. Le manifestazioni fenotipiche possono essere lievi (acne, irsutismo, oligomenorrea, infertilità) o gravi (clitoridomegalia, virilizzazione, irsutismo, obesità, amenorrea). La severità dell espressione fenotipica dipende dal danno genetico e dalla funzionalità dell enzima, correlata ai livelli di 17α-idrossiprogesterone. Scopo del lavoro è valutare se in donne affette, diagnosi e trattamento precoce possono modificare l espressione del fenotipo. Otto pazienti con deficit sono state suddivise in due gruppi: gruppo 1 (n=5) donne con fenotipo severo, in cui il deficit è stato diagnosticato a anni, con indagine endocrina e genetica; gruppo 2 (n=3) adolescenti con diagnosi endocrina in età prepuberale/puberale, trattate con desametazone fino a 19 anni. Al termine del trattamento nessuna di queste mostrava segni androgenici, obesità o irregolarità mestruale, nonostante le gravi mutazioni del gene riscontrate all indagine genetica. In conclusione l espressione del fenotipo è correlata alla quantità ed al tempo di esposizione agli androgeni. La diagnosi e terapia precoce possono modificare la storia naturale della malattia. Parole Chiave: Iperplasia surrenalica congenita, Fenotipo, Gene CYP21, 17α- idrossiprogesterone SUMMARY Precocious diagnosis and treatment changes the natural history of the illness, blocking the expression of the phenotype, in patients with severe alterations of the 21α-hydroxylase gene. 21α-hydroxylase deficiency is the most common cause of congenital adrenal hyperplasia and is found in 5% of hyperandrogenic women. Responsible gene (CYP21) is located on chromosome 6, near HLA region. Reduced enzymatic activity diverts precursors of mineral-corticoid (progesterone) and gluco-corticoid (17-hydroxyprogesterone, 17-OHP) toward androgenic way (androstenedione, testosterone). Phenotype manifests in women with mild (acne, hirsutism, oligoamenorrhea, infertility) or severe androgenic signs (clitoris hypertrophy, virilization, hirsutism, obesity, amenorrhea). Severity of the phenotype depends on the genic damage and degree of expression of a functional enzyme, usually reflected by 17OHP levels. Aim of this study is to evaluate the impact of a precocious diagnosis and treatment upon the phenotype expression in affected women. Among hyperandrogenic patients admitted to Department of Gynecolgical Endocrinology, 8 were found to have non-classical 21-hydroxylase deficiency. All patients showed high 17-OHP and androgen levels, impaired ACTH test and significant mutations in the CYP21 gene at the genetic analysis. Five patients received the diagnosis between years and showed a severe phenotype. Three girls were diagnosed between 9-11 years of age and treated with low-dose-desametasone until 19 years. At the end of the treatment, none showed androgenic signs, obesity or menstrual irregularity despite severe mutations of the gene. In conclusion, phenotype expression is correlated to the quantity and the time of exposure to high androgen levels. A precocious diagnosis and treatment (pre/puberal) is able to completely block its expression. Key Words: Congenital adrenal hyperplasia, Phenotype, CYP21 gene, 17α-hydroxy-progesterone INTRODUZIONE Le sindromi adrenogenitali (deficit 21-α-idrossilasi, 3βidrossisteroidodeidrogenasi, 17α-idrossilasi), sono un gruppo di patologie determinate da alterazioni degli enzimi della steroidogenesi ovarica e/o surrenalica, che si tra- smettono con modalità autosomica recessiva e colpiscono entrambi i sessi 1,2. Il deficit dell enzima 21-α-idrossilasi rappresenta il 95% dei casi delle iperplasie surrenaliche congenite. Complessivamente si riscontra in circa il 5% delle donne iperandrogeniche. Nella popolazione generale si stima che l incidenza dei portatori di alterazioni del 42 LigandAssay 11 (1) 2006

2 gene per la 21-α-idrossilasi sia di 1:70 in Italia e 1:333 nei paesi mediterranei. Il 50% dei portatori avrebbe e trasmetterebbe mutazioni genetiche gravi dell enzima. Il gene responsabile, CYP21, è localizzato insieme allo pseudogene, CYP21P, sul cromosoma 6, vicino alla regione del complesso maggiore di istocompatibilità. La diagnosi molecolare è resa difficile dall elevatissima omologia (98%) tra il gene funzionale (CYP21) e lo pseudogene. Numerose mutazioni del gene possono determinare la trascrizione di un enzima con ridotta funzionalità che, a livello surrenalico, determina una deviazione dei precursori steroidei della via dei mineral-corticoidi (progesterone) e dei gluco-corticoidi (17-α-idrossiprogesterone: 17-OHP) verso la via degli androgeni (androstenedione: A e testosterone totale: T). Classicamente, in letteratura è riportato che i quadri più severi (pseudoermafroditismo, crisi addisoniane con perdita di sali e virilizzazione) si associano a difetti omozigoti del gene (forma classica). I quadri più lievi (acne, irsutismo, alterazioni del ciclo mestruale ed infertilità) invece sarebbero correlati a difetti del gene di tipo eterozigote (forma non-classica o late-onset) che si manifestano a partire dalla pubertà. In realtà, le manifestazioni cliniche sono molto variabili e non sempre inquadrabili nelle due forme, soprattutto alla luce delle indagini genetiche degli ultimi anni. Le manifestazioni variano da semplici problemi dermatologici (acne o irsutismo) persistenti in età adulta, fino lievi anomalie congenite dell apparato uro-genitale (fusione delle labbra, ipospadia) riscontrabili alla nascita, variamente associate ad alterazioni metaboliche presenti già in età pediatrica. Quindi, clinicamente si possono distinguere fenotipi gravi (clitoridomegalia, virilizzazione, obesità, irsutismo severo, amenorrea, ecc.) associati a mutazioni geniche che alterano significativamente il grado d espressione e la funzionalità dell enzima, e fenotipi lievi (acne, irsutismo, oligomenorrea, infertilità). In età neonatale e pediatrica i livelli di 17-OHP sarebbero predittivi del fenotipo. Normalmente, anche nelle pazienti che giungono all osservazione in età adulta, l espressione fenotipica è proporzionale ai livelli di 17-OHP. I fenotipi più gravi sono trattati farmacologicamente in base al grado d iperandrogenismo, con cortisonici ad alta dose, eventualmente associabili a miscele di antiandrogeni (flutamide, finasteride, ciproterone acetato, spironolattone). I fenotipi lievi possono invece giovarsi di terapie con contraccettivi ormonali di III generazione, associabili ad antiandrogeni. Lo scopo di questo studio è di valutare l impatto della diagnosi precoce e del trattamento dall età prepuberale sull espressione del fenotipo della malattia, in donne con deficit non classico dell enzima 21α-idrossilasi. MATERIALI E METODI Pazienti Tra le pazienti ricoverate per iperandrogenismo al centro di Ginecologia Endocrinologica, ad 8 è stata fatta diagnosi endocrina di deficit della21-α-idrossilasi. La diagnosi è stata posta in base agli elevati livelli di 17-OHP ed androgeni sia basali, che dopo test all ACTH. In 5 pazienti il deficit è stato diagnosticato tra i 19 e 29 anni d età e,dopo la diagnosi ormonale, è stata eseguita la ricerca delle mutazioni genetiche. Nelle altre 3 pazienti, la diagnosi è stata fatta in età prepuberale/puberale (9-12 anni d età). Queste pazienti dalla diagnosi sono state trattate con desametasone a basse dosi (0,125-0,25 mg/die) fino ai 19 anni. Alla sospensione della terapia (2005) dopo assenza di trattamento farmacologico da almeno 3 mesi, sono stati ripetuti i dosaggi ormonali ed è stata eseguita l indagine genetica. Il gruppo di controllo era rappresentato da 10 donne sane in età fertile, con età media 23,2 + 2,1 anni, che avevano cicli mestruali regolari ed ovulatori della durata media di giorni, ed assenza di sintomi androgenici. Tutti i dosaggi ormonali sono stati eseguiti in fase follicolare precoce di un ciclo mestruale. Dosaggi ormonali Le determinazioni sono state eseguite con le seguenti metodologie: - LH, FSH, 17βestradiolo (E2) e T: dosaggi in chemiluminescenza su analizzatore automatico Vitros EcI (Johnson-Johnson Clinical Diagnostics, Milano) - SHBG: dosaggio in chemiluminescenza su analizzatore automatico Immulite 2000 (Diagnostic Product Corporation, Los Angeles - USA; rappresentante italiano Medical Systems, Genova) - 17-OHP: dosaggio radioimmunologico con separazione della frazione libera da quella legata mediante provette sensibilizzate (ALIFAX S.p.A, Padova Italia) - A e 3α-androstanediolo glucuronide (3α-diolG): dosaggi radioimmunologici con separazione della frazione libera da quella legata con uso del doppio anticorpo per l A, e mediante provette sensibilizzate per il 3αdiolG (Diagnostics Systems Laboratories, Inc. Webster, Texas, USA, rappresentante italiano Chematil SRL, Angri, SA) - ft: calcolato mediante equazione di Vermeulen 3 Analisi genetica Il DNA genomico è stato estratto da 200 µl di sangue in EDTA utilizzando il kit: QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen SpA, Milano). I primers per le reazioni di amplificazione del gene 21-α-idrossilasi sono della MWG Biotech (M. Medical SRL Cornaredo, Milano). La rivelazione delle piccole mutazioni è stata eseguita in dhplc in accordo con il metodo di Oriola 4, tramite amplificazione selettiva del gene CYP21 che esclude l amplificazione dello pseudogene (CYP21P). Poi sono state eseguite le amplificazioni delle sequenze specifiche, contenenti mutazioni note, con i primers mostrati in Tabella 1 e le regioni di appaiamento riportate in Figura 1. Le reazioni di PCR sono state eseguite in un volume di 50 µl contenenti: 100 ng di templato (DNA genomico), 200 µm di ogni deossinucleotide trifosfato, 10 mm di Tris-HCl (ph 8,3), 50 mm KCl, 2 mm MgCl2, 1,5 U di AmpliTaq Gold (Applied Biosystems, rappresentante italiano Applera LigandAssay 11 (1)

3 Tabella1 Primers utilizzati per la rivelazione di piccole mutazioni del gene CYP21 F1 P AAGCTGACTCTGGATGCAGGA-3 P TCCAGAGCAGGGAGTAGTCTC-3 P30L P5 5 - GCTCCGGAGCCTCCACCTCG-3 P6 5 - TTGGAGTTCAGCACCAC-3 I2 P7 5 - CAGGCTGGTCTTAAATTC-3 P8 5 - GGTAGTTCTTAGACACCAGCTTG-3 del8bp P9 5 - AGCCCCCAACTCCTCCTGCA-3 P TGTGGGCTTTCCAGAGC-3 F2 P3 5 - TTGTCCTTGGGAGACTACTCC-3 P4 5 - ACCTCTCGCACCCCAGTATGACT-3 I172N P11 5 -TCTCTCTCCTCACCTGCAGCATCG-3 P2 CLUSTER-E6 P6CLF P6CLR 5 -GCATCTCCACGATGTGA-3 5 -CTTCCCACAGCTGCATTCTC GAGGCCGTCCACGTACAG-3 V281L P281F 5 -ACTCTGTACTCCTCTCCCCA-3 P281R 5 -TGGGAAGGAGGCCTTTTGCTT-3 F306+T P306F 5 -CAGTGGACCTCCTGATCG-3 P306R 5 -ACAGTGCTCAGAGCTGAGTG-3 Q318X P12 5 -ACCGGCCACTCAGGCTCACTGGG-3 P13 5 -GCCCAGTTCGTGGTCTAGC-3 R356W P14 5 -CAGCGACTGCAGGAGGAGCTA-3 P15 5 -GCTCGGGCTTTCCTCACTCAT-3 P453S P TGTGGTGGAGGCTGGTCCCCG-3 P AGGGCAGGGCGTCCCCGGAGC-3 Figura 1 Rappresentazione schematica del gene CYP21 e regioni di amplificazione con i primers utilizzati. Italia, Monza), e 25 pmol di ogni primer. La rivelazione delle mutazioni nei frammenti amplificati è stata eseguita tramite il sistema Transgenomic WAVE System, fornito di una colonna preriscaldata, C18 a fase inversa, basata su particelle non porose polistirene/divinilbenzene (DNASep TM ; Transgenomics, rappresentante italiano Tansgenomic Ltd, Misano Gera d Adda, BG ) 5-6. Gli eteroduplex dei frammenti amplificati sono stati ottenuti denaturando i prodotti di PCR a 94 C per 10 minuti e raffreddando gradualmente fino a 56 C per 60 minuti. Questi sono poi stati iniettati (8 µl) sulla colonna dalla quale gli eteroduplex e gli omoduplex sono stati eluiti con un gradiente lineare formato da un tampone A contenente 0,1 mol/l trietilamina acetato (ph 7,0); un tampone B contenente 0,1 mol/l trietilamina acetato (ph 7,0) e 250 ml/l di acetonitrile ad un flusso costante di 0.9 ml/min. Il DNA è stato rilevato monitorando l assorbanza a 260 nm. Per ogni frammento, la concentrazione iniziale e finale di tampone B è stata aggiustata per ottenere un tempo di ritenzione tra i 3 ed i 5 minuti. La colonna è stata quindi lavata con 100% di tampone B per 30 secondi ed equilibrata alle condizioni iniziali per 1 minuto. Le caratteristiche di melting dei frammenti di DNA sono state rivelate tramite l uso del software Wavemaker TM. Il dhplc non rivela mutanti omozigoti in una singola corsa, perchè un eventuale profilo di eluizione alterato è attribuibile al melting differenziale degli eteroduplex. Quindi per rilevare mutazioni omozigoti, gli amplificati dal DNA di un paziente devono essere mischiati con un eguale quantità di un DNA con sequenza normale verificata, denaturati, riappaiati ed analizzati per la formazione di eteroduplex. In questo caso, la comparsa di un profilo alterato indica la presenza di un mutante omozigote. Per la rivelazione di grandi delezioni e riarrangiamenti sono stati utilizzati i metodi di Tukel 7 e Southern Blot standard. E stata eseguita la PCR e la digestione semiquantitativa:100 ng di DNA genomico sono stati denaturati a 98 C per 10 minuti e poi trasferiti in una soluzione contenente: 400 µm di NTPs, 0,3 µm primers, 0,75 U Taq polimerasi (Expand Long Template PCR System, Roche Diagnostici, Milano), e 1 µl tampone (Expand Long Template PCR System Buffer 3, Roche) in un volume finale di 25 µl. Il programma di PCR è stato il seguente: 94 C per 1 minuto, seguito da 10 cicli di 1 minuto a 95 C, 30 secondi a 58 C e 3 minuti a 68 C, e 25 cicli di 1 minuto a 95 C, 30 secondi a 56 C, e 3 minuti a 68 C, con un estensione finale di 10 minuti a 68 C. Inoltre 5 µl del prodotto di PCR è stato applicato e fatti migrare su un gel di agarosio al 1% per verificare l amplificazione. Tre unità 44 LigandAssay 11 (1) 2006

4 di TaqI (MBI Fermentas, M. Medical SRL Cornaredo, Milano)) e 2,3 µl di tampone sono stati aggiunti al volume finale e incubati per 3 ore at 65 C. Dopo digestione i campioni sono stati applicatie fatti migrare su un gel di agarosio al 0,8% e visualizzati tramite bromuro di etidio sotto luce UV. L analisi per Southern Blot è stata eseguita in accordo con procedure standard 8 : 10 µg di DNA genomico sono stati digeriti per 16 ore a 65 C con l enzima di restrizione Taq1, migrati elettroforeticamente su un gel di agarosio al 0,8% e trasferiti su membrana. La sonda per il blot è stata generata per PCR usando il plasmide ph21b come templato in presenza di (d)-utp marcato con digossigenina (Roche Diagnostici, Milano). Il DNA plasmidico è stato denaturato a 98 C per 10 minuti e la sintesi eseguita in presenza di 200 mm datp, dctp, e dgtp ognuno e 67 mm dutp marcato con digossigenina, 0,3 µm primers; 2.5 U Taq polimerasi (Invitrogen, SRL, San Giuliano Milanese, Milano) e tampone PCR. Sono stati aggiunti 2,5 mm MgCl2 ad un volume finale di 50 µl. Programma di PCR: 94 C per 5 minuti, seguiti da 30 cicli di 30 secondi a 95 C, 30 secondi a 60 C, e 30 secondi a 72 C, con un estensione finale a 72 C con 7 minuti dell ultimo ciclo. Le sequenze dei primers: CYP21 probe diretto, 5-ACCCGATCATTCCCCAGA-3; e CYP21 probe inverso, 5-CCTGCACAGCCTGACACA-3. Per l analisi di sequenza le varianti del gene CYP21A con profilo alterato in dhplc, sono state sequenziale, per sequenziamento diretto, in ambedue le direzioni con gli stessi primers di amplificazione. ANALISI STATISTICA Tutti i dati sono presentati come media e deviazione standard del campione. Per la valutazione delle differenze tra i profili endocrini delle pazienti con deficit della 21-αidrossilasi e dei controlli è stato utilizzato il test t di Student per dati non appaiati, considerando entrambe le code della gaussiana. Valori di p<0,05 sono stati considerati significativi. Per l analisi statistica è stato utilizzato il programma SPSS 13.0 della SPSS Inc. Corp. USA. RISULTATI La Tabella 1 riporta i primers utilizzati per la identificazione delle piccole mutazioni del gene della 21-α-idrossilasi. In Figura 1 viene rappresentato schematicamente il gene CYP21 con gli esoni, gli introni e le regioni di amplificazione. Nella Tabella 2 viene confrontato il quadro ormonale basale delle pazienti affette dal deficit con quello di un gruppo omogeneo di donne sane. Gli esami ormonali sono stati eseguiti, in entrambi i gruppi, in fase follicolare precoce (6 a -7 a giornata) di un ciclo mestruale spontaneo o indotto con medrossiprogesterone acetato alla dose di 10 mg/die per 5 giorni. L età media delle donne del gruppo di controllo era di 23,2 + 2,1 anni (intervallo anni), mentre quella delle pazienti alla verifica del quadro ormonale e dell assetto genetico, era 23,4 + 5,0 anni (intervallo anni). Le pazienti affette dal deficit mostravano livelli di LH significativamente superiori rispetto ai controlli, con un rapporto LH/FSH invertito, come si verifica nella condizione di sindrome dell Ovaio Policistico. I livelli di E2 risultavano più bassi rispetto alle donne sane (p=0,048), mentre quelli del 17- OHP e degli androgeni (A, T) si presentavano notevolmente aumentati (p<0.05). La SHBG in termini di valore assoluto risultava più bassa, pur non raggiungendo la significatività statistica per la ridotta numerosità del campione. Nelle pazienti con deficit enzimatico, anche la quota libera del testosterone risultava significativamente aumentata, così come i livelli di 3α-diolG (p<0.005). Tra le donne affette dal deficit enzimatico, si sono delineati due gruppi di pazienti. Il gruppo 1, formato da 5 pazienti, in cui la diagnosi è stata posta tra i 19 ed i 29 anni, che erano giunte all osservazione per alterazioni importanti del ciclo mestruale (amenorrea secondaria) o manifestazioni androgeniche, e che esprimevano un fenotipo severo della malattia (clitoridomegalia, irsutismo severo, virilizzazione, obesità e sterilità). Nel gruppo 2, invece, sono riunite le 3 ragazze in cui la diagnosi endocrina era stata posta in età prepuberale/puberale (9-12 anni), e che erano state trattate precocemente con il cortisonico a basse dosi. A 19 anni di età, dopo sospensione della terapia per 3 mesi, sono stati ripetuti gli esami ormonali, sia basali che dopo ACTH, ed è stata eseguita l analisi genetica. Al raccordo anamnestico e all esame obiettivo, questo secondo gruppo di pazienti non presentava alcun segno o sintomo attribuibile alla malattia. La Tabella 3 riporta il fenotipo delle pazienti in studio, con i relativi quadri ormonali e la caratterizzazione genetica. Come atteso, i livelli di 17-OHP, A e T risultano elevati al prelievo basale, ed aumentano notevolmente dopo la somministrazione dell ACTH, sia nel gruppo 1 che nel gruppo 2. In tutte le pazienti sono state riscontrate mutazioni genetiche significative (puntiformi, delezioni e riarrangiamenti) a carico del gene CYP21. DISCUSSIONE Il presente studio mostra il quadro endocrino e clinico caratteristico delle donne affette da deficit non classico della 21-α-idrossilasi. La storia naturale di questa forma della malattia, a differenza di quella classica, prevede l assenza di chiari segni e sintomi alla nascita e fino al periodo puberale. Infatti, nell età infantile vi è un silenzio endocrino, caratterizzato da minima steroidogenesi ovarica (gonadostato) e surrenalica, con conseguenti livelli ormonali circolanti appena rilevabili. Con l adrenarca (7-9 anni), l attivazione della zona reticolare del surrene, induce l aumento degli androgeni surrenalici (A, DEAS, e T) ed inizia la fase puberale che porta alla maturazione dell asse gonadico e della struttura organica, tipica dell età riproduttiva. Alla fine della pubertà, segnata dal menarca, iniziano a comparire le prime manifestazioni del deficit enzimatico quali l oligo-amenorrea persistente per anni, l acne ingravescente e l irsutismo 9. Per tale motivo questa forma del deficit surrenalico, spesso non diagnosticata, veniva denominata late-onset, cioè ad insorgenza tardiva. Nelle donne affette da deficit non classico della 21α-idrossilasi LigandAssay 11 (1)

5 Tabella 2 Profili endocrini delle pazienti con deficit della 21-alfa-idrossilasi e controlli Ormone Unità di misura 21-α-idrossilasi (n=8) Controlli (n =10) p* LH miu/ml 9,0 + 2,2 5,9 + 1,5 0,003 FSH miu/ml 4,0 + 1,1 4,9 + 1,8 NS E2 pg/ml 41,4 + 17,1 58,9 + 17,3 0, OHP ng/ml 9,3 + 8,9 1,2 + 0,3 0,022 A ng/ml 4,5 + 2,3 2,3 + 0,7 0,011 T ng/ml 1,2 + 0,8 0,4 + 0,2 0,007 ft pg/ml 22,1 + 15,4 4,1 + 1,9 0,002 SHBG nmoli/l 45,1 + 39,7 59,9 + 17,3 NS 3α-diolG ng/ml 5,9 + 3,5 1,8 + 0,9 0,002 *Test t di Student: significatività p< 0.05 Tabella 3 Fenotipo dei due gruppi di pazienti con deficit della 21-α-idrossilasi, quadro ormonale basale e dopo test ACTH e caratterizzazione genetica. Fenotipo Ormone Basale Dopo test ACTH Mutazioni puntiformi Delezioni e riarrangiamenti (1) P30L eteroz + I2 eteroz nessuna (2) V281L omoz. duplicazione CYP21,eteroz SEVERO a, gruppo 1 (n=5) 17-OHP (ng/ml) A (ng/ml) T (ng/ml) 6,1 + 7,3 4,5 + 3,1 1,06 + 0,46 14,5 + 13,0 6,7 + 3,9 1,38 + 0,58 (3) sost G>C eteroz +EXO7 (268T) + nt 1647 delezione CYP21, eteroz (4) nessuna delezione CYP21, eteroz (5) nessuna delezione CYP21 eteroz (1) I2 eteroz., V281L eteroz. sost G>C nt806 EXO 7 (S268Y) eteroz grande Conversione genica, eteroz ASSENTE, gruppo 2 (n=3) 17-OHP (ng/ml) A (ng/ml) T (ng/ml) 11,5 + 12,7 3,7 + 0,4 0,63 + 0,15 15,6 + 16,1 5,9 + 1,8 1,13 + 0,35 (2) sost G>C nt806 EXO 7 (S268Y) eteroz delezione CYP21, eteroz (3) sost G>C nt806 EXO 7 (S268Y) eteroz delezione CYP21, eteroz a Ipertrofia clitoridea, irsutismo severo, obesità, amenorrea, virilizzazione 46 LigandAssay 11 (1) 2006

6 sono stati descritti casi di adrenarca anticipato o esagerato 10. Dal punto di vista endocrino, le pazienti con deficit della 21-α-idrossilasi, in età adolescenziale e giovanile, mostrano un alterato assetto gonadotropinico (rapporto LH/FSH>2) ed elevati livelli di androgeni rispetto alle normali donne in età fertile. Questa condizione è simile a quella che si riscontra nella Sindrome dell Ovaio Policistico con cui, soprattutto la forma lieve del deficit non classico, può confondersi. La suddetta endocrinopatia invece può essere associata al deficit della 21-α-idrossilasi, in forma secondaria. Recenti studi riportano che circa il 40% delle pazienti con deficit non classico hanno le ovaie policistiche 11. La Sindrome dell Ovaio Policistico è l endocrinopatia femminile più frequente, colpisce circa il 10 % delle donne in età fertile, ed è caratterizzata da anovulazione cronica, insulino-resistenza 12 e iperandrogenismo ovarico, talvolta associato ad una iperattività surrenalica (forme a compartecipazione surrenalica). Le manifestazioni cliniche possono essere le stesse dei fenotipi lievi dei deficit enzimatici surrenalici (oligomenorrea, acne, irsutismo) 13, pertanto la diagnosi differenziale non è sempre agevole. In tale ambito, l indagine genetica potrebbe risultare utile per distinguere queste forme di policistosi ovarica a compartecipazione surrenalica, da quelle di lieve deficit della 21-αidrossilasi. Nelle pazienti del presente studio la diagnosi differenziale tra le due endocrinopatie era facilitata dai livelli di androgeni molto elevati e, soprattutto, dai valori di 17-OHP basali (Tab. 2). Infatti, vengono considerati normali per il 6 giorno del ciclo mestruale valori di 17-OHP <2.0 ng/ml. Un dosaggio superiore deve far sospettare un difetto enzimatico surrenalico e le pazienti devono essere sottoposte a test di stimolo con ACTH. Le pazienti in studio, senza terapia, avevano valori basali medi di 17-OHP di 9,3 + 8,9 ng/ml con valori compresi tra 2,9 e 20 ng/ml. L A nelle pazienti affette dal deficit presentava mediamente valori doppi rispetto ai controlli, il T presentava valori tripli e la frazione libera (ft) superiore di 4-5 volte anche per la contemporanea riduzione delle proteine vettrici (SHBG). L azione di questi androgeni sui tessuti bersaglio risultava particolarmente marcata, come testimoniato dai livelli significativamente aumentati di 3α-diolG, metabolita del diidrotestosterone, e marcatore dell attività periferica degli androgeni stessi. Infatti, i valori di 3α-diolG erano in media 2-3 volte superiori rispetto ai controlli. Le pazienti affette dal deficit, che avevano ricevuto la diagnosi in età adolescenziale-adulta, tra i 19 ed i 29 anni (gruppo 1), esposte a così elevati livelli di androgeni per un tempo prolungato, giungevano all osservazione con il fenotipo caratteristico della malattia (Tab. 3). Infatti, clinicamente queste pazienti si presentavano con alterazioni del ciclo mestruale (oligomenorrea, amenorrea), sovrappeso/obesità, ipertrofia del clitoride, irsutismo severo e virilizzazione, all anamnesi riferiti dalle pazienti come progressivamente ingravescenti dal menarca. In queste donne il test di stimolazione surrenalica con ACTH confermava la diagnosi posta, evidenziando notevoli incrementi del 17-OHP, dell A e del T. Il 17-OHP, nella biosintesi degli steroidi surrenalici, è il precursore che si accumula a monte, per la ridotta attività dell enzima 21-α-idrossilasi, e devia verso la via di sintesi degli androgeni. L indagine genetica ha evidenziato la presenza di mutazioni puntiformi e delezioni sul gene CYP21, determinando la trascrizione dell enzima con ridotta funzionalità. Le pazienti a cui la diagnosi è stata posta in età prepuberale/puberale, tra i 9 e i 12 anni (gruppo 2), e che sono state adeguatamente e preventivamente trattate fino ai 19 anni, non presentavano le manifestazioni fenotipiche della malattia. Dopo la sospensione della terapia ed un adeguato periodo in assenza di trattamento, l assetto ormonale di controllo mostrava elevati livelli di 17-OHP (2-10 volte la norma) ed androgeni (2-3 volte la norma), che aumentavano notevolmente dopo test di stimolo. L analisi genetica confermava la presenza di gravi alterazioni che determinavano un anomala trascrizione dell enzima. Dal punto di vista funzionale, questo secondo gruppo di pazienti presentava alterazioni endocrine e genetiche confrontabili, se non superiori, a quelle del gruppo con fenotipo severo. Dal punto di vista clinico invece tali pazienti non esprimevano il fenotipo della malattia. Infatti, al follow-up a 3 mesi, si presentavano normopeso, con cicli mestruali regolari ovulatori e assenza di sintomi androgenici. Queste pazienti attualmente ricevono una terapia di mantenimento a base di estro-progestinici, più o meno associati ad antiandrogeni. In conclusione, questo studio dimostra che nel deficit non classico della 21-α-idrossilasi, l espressione del fenotipo è correlata alla quantità ed al tempo di esposizione agli alti livelli di androgeni. Infatti, nella storia naturale tipica della malattia, le pazienti del gruppo 2 avrebbero dovuto mostrare un fenotipo severo, ma una diagnosi precoce ed il trattamento preventivo e prolungato, dall età prepuberale/puberale, sono stati in grado di bloccare completamente l espressione del fenotipo. L analisi genetica oggi può definire più precisamente la diagnosi e la possibilità di trasmissione alla prole, permette di eseguire l eventuale diagnosi prenatale, ma anche di orientare il clinico verso la scelta di terapie più o meno aggressive. Inoltre, può porre l indicazione al trattamento in età prepuberale, cioè in fase presintomatica della malattia, per modificarne la storia naturale e prevenire lo sviluppo del fenotipo. BIBLIOGRAFIA 1. Perrin C, White e Phyllis W. Speiser Congenital Adrenal Hyperplasia due to 21-Hydroxylase Deficiency. Endocr Rev 2000; 21: Merke DP, Bornsyein SR Congenital adrenal hyperplasia. Lancet 2005; 365: Vermeulen A, Verdonck L, e Kaufman JM A critical evaluation of simple methods for the estimation of free testosterone in serum. The J.of Clin.Endoc.& Metab. 1999; 84: Oriola J, Plensa I, Machuca I, et al. Rapid screening method for detecting in the 21-hydroxylase gene. Clin. Chem. 1997; 43: LigandAssay 11 (1)

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