PNH EPN Emoglobinuria Parossistica Notturna

Roma, 27 settembre 2018 Club del Globulo Rosso PNH EPN Emoglobinuria Parossistica Notturna Rosario Notaro Cancer Genetics and Gene Transfer Core Research Laboratory - ISPRO Florence

Conflitti d Interesse Rosario Notaro: Nessun conflitto d interesse

Emoglobinuria Parossistica Notturna L EPN è una rara malattia clonale acquisita del sangue caratterizzata dalla triade clinica: Emolisi cronica intravascolare: con crisi Trombosi: venose, addominali, spesso multiple Citopenie (Insufficienza midollare): comune, a volte grave WBC /µl Plts /µl

Emolisi e insufficienza midollare in EPN Emolisi EPN EPN/Aplasia (PNH/AA syndrome) Citopenie Aplasia

Test di Ham nell EPN Siero Siero In. Siero + acido + acido + acido Controllo Globuli Rossi di un Paziente EPN

Proteine assenti sulle cellule ematiche EPN CD55 CD24 CD58* B cells CD58* CD59 CD48 PrPC CD73 AChE JMH Ag Dombroch Hematopoietic HG Ag RBC T cells CD55 Stem Cell CD59 Tutte queste Proteine CD55 CDw52 CD58* CDw108 CD59 ADP-RT CD109 CD90 CD59, CD90, CD109 PrPC CD16* Platelets GP500 sono legate con Gova/b NK cells CD55 CD58* l ancora GPI CD59 CD14 CD16 CD24 CD48 CD66b CD66c CD87 PMN Monocytes CD109 CD157 CD14 CD55 LAPNB1 PrPC CD58* CD59 p50-80 GPI-80 CD48 CDw52 ADP-RT CD87 CD109 NA1/N CD157 Group 8 A2 PrPC GPI-80 CD16* CD55 CD59 PrPC CDw108 CD55 CD58* CD59 CD48 CDw52 PrPc CD16* CD58* CD48 CD87 PrPc CD73 CD109

Paziente EPN Normale Diagnosi di EPN Citofluorimetria per marcatori GPI-linked sulle cellule del sangue Neutrofili Monociti Globuli rossi 91% 51% 93% CD66b FITC CD14 FITC CD59 FITC

Patogenesi Molecolare dell EPN - mutazioni somatiche nel gene X-legato PIGA - X chr. PIGA nucleo Etn-P PIG-A Inositol-P Ancora GPI GlcN glycan ER protein + GPI Cellula Cellula mutata normale in PIGA Staminale EPN normale

Emoglobinuria Parossistica Notturna Patogenesi Emolisi Intravascolare Trombosi Insufficienza midollare

Antigen-Antibody Via Classica Il Sistema Complementare in EPN Microorganisms Via Lecitin e Constitutive/ Microorganisms Via Alternativa Inibitori del Complemento Membrana Solubili C1 Inh C4bp Factor I C3 C5 Loop di amplificazion e CR1 CD55 CD46 Factor H Factor I Complesso di Attacco alla Membrana CD59 Clusterin Protein S Modificato da Brown et al, Nat Clin Pract Nephrol 2007

Il Controllo del Complemento nei soggetti sani Alternative pathway Lectin pathway C3 C5 C5b-C9 CD55 Classical pathway Eritrocita normale

Il Controllo del Complemento nei Pazienti EPN Alternative pathway Lectin pathway C3 C5 C5b-C9 Classical pathway Eritrocita EPN

Conseguenze dell emolisi intravascolare Emolisi Intravascolare Deplezione Ossido nitrico distonia muscolatura liscia Dolori addominali Astenia Disfagia Disfunzione erettile (Insufficienza renale) (Ipertensione polmonare) Emoglobinemia Elevato LDH Emoglobinuria Emosiderinuria ANEMIA (bassa Hgb) Perdita di Ferro Elevati Reticolociti

La Trombosi è Frequente nell EPN ricorrente, grave, spesso mortale Distretto cerebrale, addominale e polmonare in > 50% dei pazienti Hall et al, Blood, 2003

Coagulazione, Complemento ed EPN Associazione a Delinquere? Coagulazione Complemento Modified from Markiewski et al, Trends Immunol 2007

Espansione Paradossa del Clone EPN (Teoria della Fuga) Tempo Cellule PIGA+ Cellule PIGA- Cellule PIGA+ danneggiate Agente Nocivo Rotoli & Luzzatto, 1989

Modello per la Patogenesi dell EPN e dell AA: L ancora GPI è il bersaglio dei linfociti autoreattivi T anti-gpi TCR CD1d Staminale normale (GPI+) Staminale EPN (GPI-) Karadimitris et al, Blood 2000; Gargiulo et al, Blood 2007; Gargiulo et al, Blood 2013; Gargiulo et al, Blood 2017;

Espansione Paradossa del Clone EPN Il caso di Alessia, dalla Teoria alla Pratica 20 19 18 17 16 15 14 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 76% 59% Hb (g/dl) Plts *10 4 /µl LDH *UNL Retics *10 5 /µl N *10 3 /µl prbc units Eculizumab 95% N GPI-neg 0 2 4 6 8 10 12 2 years months

Emoglobinuria Parossistica Notturna (EPN) Gestione Clinica

Emoglobinuria Notturna Parossistica Opzioni Terapeutiche nel XX secolo Trattamenti di Supporto Acido Folico Ferro Transfusioni di eritrociti Profilassi anti-coagulante (Trombolisi) Trattamenti Patogenetici Trapianto Allogenico di CSE Immuno-soppressione (ALG/CSA) (androgeno)

Sopravvivenza (%) Sopravvivenza dei Pazienti EPN 100 80 Popolazione di controllo 60 40 EPN (n 424; De Latour 2008: 1970-2000) 20 EPN (n 80; Hillmen 1995: 1950-1980) 0 0 10 20 Anni dalla diagnosi 30 40 Mortalità a causa di: Trombosi Insufficienza Midollare (SMD/leucemia?)

Emoglobinuria Notturna Parossistica Opzioni Terapeutiche nel XXI secolo Trattamenti di Supporto Acido Folico Ferro Transfusioni di eritrociti Profilassi anti-coagulante (Trombolisi) Trattamenti Patogenetici Trapianto Allogenico di CSE Immuno-soppressione (ALG/CSA) (androgeno) Inibizione del complemento

Emoglobinuria Parossistica Notturna Blocco del Complement - eculizumab -

Eculizumab Anticorpo monoclonale umanizzato anti-c5 Variable heavy chain Human framework regions Variable light chain Human constant light chain Ck Murine complementarity determining regions Human constant heavy chain IgG2 CH1 and hinge CH2 CH3 Human constant heavy chain IgG4 CH2 and CH3 Rother et al, Nature Biotech 2007

CR1 CD55 CD46 CD59 Factor H Factor I C4bp Regolazione della Cascata del Complemento nel Paziente EPN Trattato con Eculizumab Inibitori del Complemento Alternative pathway Eculizumab Lectin pathway C3 C5 C5b-C9 Classical pathway

Emoglobinuria Parossistica Notturna Un caso clinico

Paziente inizia EPN l eculizumab pesantemente e la trasfuso storia cambia e con trombosi ricorrenti 13 Trasfusioni RBC 12 2 U/mese 11 Hb (g/dl) Eculizumab (900 mg/14 days) 10 9 8 7 6 Trombosi ricorrenti (Budd Chiari) Hb (g/dl) LDH (*UNL) 5 4 3 2 1 LDH (*UNL) 0-2 -1 pre-ecu 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 anni dall inizio dell eculizumab Non più trasfusioni, non più trombosi (nonostante lo stop della terapia anticoaugulante)

Il trattamento con eculizumab in EPN blocca l emolisi intravascolare e i sintomi correlati abroga o riduce il fabbisogno trasfusionale riduce il rischio trombotico è sicuro, nonostante il rischio di infezioni da batteri capsulati è sicuro anche in gravidanza Dolore Addominale Spossatezza Disfagia Disfunzione Erettile Anemia Trasfusioni Emoglobinemia Trombosi Però, non guarisce, e non è disponibile in tutto il mondo

Gestione Clinica del Paziente con EPN Risposta ematologica all eculizumab Hgb 11 35.3% >50% 5,6% 50% 10,1% 8 Hgb < 11 49.0% n= 51 Normalizzazione del LDH in quasi tutti i pazienti 20-30% dei pazienti cintinua a trasfondere 50% dei pazienti non raggiunge 11 g/dl di emoglobina La reticolocitosi persiste in quasi tutti i pazienti Risitano, Notaro et al, Blood 2009

Gestione Clinica del Paziente con EPN cause di ridotta risposta ematologica all eculizumab Ridotta produzione di globuli rossi 1) Insufficienza midollare 2) Carenza di ferro o di vitamine 3) Inadeguata produzione di eritropoietina Persistente emolisi intravascolare 1) Mancata inibizione del complemento (varianti genetiche del C5) 2) Aberrante distruzione del farmaco ( breakthrough ) 3) Aumentata attivazione acuta e/o cronica del complemento Emolisi extravascolare de novo 1) Opsonizzazione dei globuli rossi EPN a causa della deposizione di C3

LDH U/L Fuga dal Blocco del Complemento Il caso del Signor Mario: Riduzione dell intervallo 1600 1200 800 400 0 14 giorni 1114 giorni giorni 11 giorni Eculizumab Eculizumab Eculizumab Eculizumab

Gestione Clinica del Paziente con EPN cause di ridotta risposta ematologica all eculizumab Ridotta produzione di globuli rossi 1) Insufficienza midollare 2) Carenza di ferro o di vitamine 3) Inadeguata produzione di eritropoietina Persistente emolisi intravascolare 1) Mancata inibizione del complemento (varianti genetiche del C5) 2) Aberrante distruzione del farmaco ( breakthrough ) 3) Aumentata attivazione acuta e/o cronica del complemento Emolisi extravascolare de novo 1) Opsonizzazione dei globuli rossi EPN a causa della deposizione del C3

Emoglobinuria Parossistica Notturna Emolisi Extravascolare - un cambio di quadro nell EPN -

CD59-PE CD59-PE CD59-PE CD59-PE Il blocco del C5 si associa al legame di C3 agli eritrociti EPN Paziente EPN non trattato C3-FITC Paziente EPN durante il trattamento con eculizumab Hgb 12 8.5 Hgb <10 Transfused 2% of PNH RBC C3-FITC 45% of PNH RBC C3-FITC 67% of PNH RBC C3-FITC Risitano, Notaro et al, Blood 2009

CD59-PE CD59-PE Il Trattamento con l Eculizumab è associato alla Deposizione di C3 sui Globuli Rossi EPN Paziente EPN non trattato Alternative pathway C3 C5 C3 C3-FITC Paziente EPN trattato con eculizumab Alternative pathway C3 Eculizumab C5 C3-FITC 45% of PNH RBC C3 Risitano, Notaro et al, Blood 2009

L espressione del Recettore 1 del Complemento (CR1) è associato ad una variante genetica detta polimorfismo HindIII Alta/Alta 1000 molecole per cellula Alta/Bassa 100< molecuole per cellula <600 Bassa/Bassa 100 molecole per cellula

Pazienti EPN in terapia con Eculizumab che non necessitano più di trasfusioni - genotipo CR1 - A/A A/B B/B P= 0.016 Rondelli et al, Haematologica 2013

Bisogni insoddisfatti nel trattamento attuale dell EPN Clinici Persistente emolisi intra-vascolare Crisi emolitiche intercorrenti ( breakthrough farmacocinetico) Saltuarie crisi emolitiche da infezioni/infiammazioni Emolisi extra-vascolare Pazienti ancora dipendenti dalle trasfusioni Pazienti con livelli di emoglobina non ottimali (<10 g/dl) Persistente reticolocitosi Sociali/individuali Dipendenza dall infusione ogni due settimane Costo del farmaco: >300.000 per anno

Nuove strategie terapeutiche di blocco del complemento: (non solo per EPN)

Nuovi inibitori del Complemento Antigen-Antibody Classical pathway Microorganisms Lectin pathway Constitutive/ Microorganisms Alternative pathway Complement Inhibitors Membrane Soluble Inibitori CFD Inibitori CFB sirna anti CFB MoAb AntiCFD MoAb AntiCFB Aptameri C1 Inh C4bp Factor I C3 CR1 Factor H Compstatine TT30 simil CR1 MoAb AntiC3 simil Fattore H C5 Amplification Loop Eculizumab CD55 CD46 Factor I Membrane Attack Complex Coversina MoAb AntiC5 long lasting MoAb AntiC5 sotto cute Peptidi ciclici sirna CD59 Clusterin Protein S

EPN e le altre Complementopatie

Complementopatie Condizioni patologiche in cui l attivazione del Complemento è il principale fattore patogenetico IL processo patologico può essere bloccato o rallentato dall inibizione del complemento L inibizione (o la regolazione) del complemento deve avvenire al livello appropriato per il meccanismo patogenetico proprio di ogni condizione

Eculizumab nel falcemico con reazione emolitica ritardata post-trasfusionale Boonyasampant et al, Transfusion, 2015

CRL, Florence Genetics and Gene Transfer Rosario Notaro Michela Sica, Irene Cosi, Caterina Nannelli, Maria De Angioletti Former lab members Luciana Gargiulo, Tommaso Rondelli, Margherita Berardi, Giulia Talini, Annamaria Pellecchia, Emanuele Di Lorenzo, Manuela Gencarelli, Irene Sineo Benedetta Peruzzi, Chiara Pescucci, IST, Genoa Human Genetics Sonia Lastraioli, Martina Serra, Fabrizio Loiacono, Patrizia Piccioli Federico II University - Naples Antonio Risitano, Giuseppina Ruggiero, Fiorella Alfinito, Patrizia Ricci Imperial College - London Anastassios Karadimitris New York University - New York David Araten Kanazawa University - Kanazawa Shinji Nakao Sapienza University - Rome Anna Paola Iori Ospedale Policlinico Milano Alberto Zanella, Wilma Barcellini AOU Careggi - Florence Roberto Caporale, Renato Alterini, Valentina Carrai, Barbara Scappini, Federica Barone University of Florence Alberto Bosi, Cristina Nativi Nursing Staff Careggi Hematology Lucio Luzzatto Muhimbili University Dar es Salaam (Tanzania)

There is a soul of goodness in things evil, would men observingly distil it out. William Shakespeare, King Henry V, IV, i There are more things in heaven and earth, Horatio, than are dreamt of in your philosophy. William Shakespeare, Hamlet, I, 5

A Unified Pathogenetic Model for PNH and AA GPI-targeted noxious agent Damaged Hematopoietic stem cells Hematopoietic stem cells PNH clone(s) (GPIdeficient) PIG-A mutation Aplastic Anaemia Pancytopenia Healthy Hematopoietic System PNH CD59(-) red cells Intravascular haemolysis Selective expansion of PNH clone(s) Abnormal platelets Thrombosis No clinical consequences