Metodi analitici per la ricerca dei virus enterici negli alimenti Elisabetta Suffredini Istituto Superiore di Sanità Dipartimento di Sanità Pubblica Veterinaria e Sicurezza Alimentare Tor Vergata 15.04.2014 Roma - La Sapienza 17-01 01-2008 2008 DSPVSA Istituto Superiore di Sanità - Roma 1
Virus enterici trasmessi da alimenti Virus che causano gastroenteriti: t Rotavirus, Adenovirus tipo 40 e 41 e i Calicivirus (NoV e SaV) Virus dell epatite entericamente trasmessa: HAV e HEV Virus che si replicano nell intestino umano, ma che causano malattia dopo essere migrati in altri organi, come il sistema nervoso centrale o il fegato: Enterovirus Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA 2
VIRUS - caratteristiche r Oltre 120 tipi di virus enterici Irregolarmente sferici, diametro variabile da 25 nm (Picornavirus) rus) a 75 nm (Rotavirus) Singola catena ad RNA, doppia catena ad RNA (Rotavirus), doppia catena DNA (Adenovirus) Specificità d ospite Infettività variabile (dose infettante generalmente 10-100 unità virali; eliminati con le feci in grande quantità (10 8-10 10 /g) Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA 3
Regolamento (CE) 2073/2005 consideranda N 22: I criteri microbiologici fissati nel presente regolamento devono poter essere riveduti e modificati, se necessario, per tenere conto dell evoluzione nei settori della sicurezza alimentare e della microbiologia o og degli alimenti, ossia dei progressi scientifici, tecnologici e metodologici, dei cambiamenti nei livelli di prevalenza e contaminazione e nella percentuale di consumatori sensibili, nonché degli eventuali risultati che emergono dalla valutazione dei rischi. Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA 4
N 23: Regolamento (CE) 2073/2005 consideranda In particolare, è opportuno che i criteri per i virus patogeni nei molluschi bivalvi vivi siano fissati quando i metodi d analisi i sono stati sufficientemente i messi a punto. Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA 5
Metodi di ricerca dei virus Microscopia i elettronica Saggi immunoenzimatici (ELISA) Colture cellulari Metodi molecolari Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA 6
Metodi di ricerca dei virus HEV Microscopia M croscop a elettronica ttron ca HAV AdV RV AV Istituto Superiore di Sanità - Roma NoV DSPVSA 7
Metodi di ricerca dei virus metodica LOD caratteristiche EM/IEM 10 6-7 individuazione di tutti i ceppi virali scarsa praticità ità / economicità ità scarsa sensibilità ELISA 10 4-6 individuazione solo di alcuni ceppi virali praticità scarsa sensibilità (RT)-PCR 10 2-4 individuazione id i solo di alcuni ceppi virali rt-(rt)-pcr 10 0-1 sensibilità colture 10 0 non disponibili tutti i virus cellulari scarsa praticità Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA 8
Metodi di ricerca dei virus ELISA / sist. st. immunoenzimatici nz mat Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA 9
Metodi di ricerca dei virus metodica LOD caratteristiche EM/IEM 10 6-7 individuazione di tutti i ceppi virali scarsa praticità ità / economicità ità scarsa sensibilità ELISA 10 4-6 individuazione solo di alcuni ceppi virali praticità scarsa sensibilità (RT)-PCR 10 2-4 individuazione id i solo di alcuni ceppi virali rt-(rt)-pcr 10 0-1 sensibilità colture 10 0 non disponibili tutti i virus cellulari scarsa praticità Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA10
Metodi di ricerca dei virus (RT)-PCR convenzionale nz ona o real-time tm Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA11
Metodi di ricerca dei virus (RT)-PCR convenzionale nz ona o real-time tm Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA12
Metodi di ricerca dei virus metodica LOD caratteristiche EM/IEM 10 6-7 individuazione di tutti i ceppi virali scarsa praticità ità / economicità ità scarsa sensibilità ELISA 10 4-6 individuazione solo di alcuni ceppi virali praticità scarsa sensibilità (RT)-PCR 10 2-4 individuazione id i solo di alcuni ceppi virali rt-(rt)-pcr 10 0-1 sensibilità colture 10 0 non disponibili tutti i virus cellulari scarsa praticità Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA13
Metodi di ricerca dei virus Colture o tur c cellulari u ar AdV HAV Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA14
Metodi di ricerca dei virus metodica LOD caratteristiche EM/IEM 10 6-7 individuazione di tutti i ceppi virali scarsa praticità / economicità scarsa sensibilità ELISA 10 4-6 individuazione solo di alcuni ceppi virali elevata praticità scarsa sensibilità (RT)-PCR 10 2-4 individuazione solo di alcuni ceppi virali rt-(rt)-pcr 10 0-1 elevata sensibilità colture 10 0 non disponibili per tutti i virus cellulari scarsa praticità iià verifica infettività Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA15
Metodi di ricerca dei virus Microscopia i elettronica Sensibilità Saggi immunoenzimatici (ELISA) Matrice Colture cellulari Virus difficilmente o affatto coltivabili Metodi molecolari METODO DI ELEZIONE Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA16
Metodi: Metodi: CEN/TC275/WG6/TAG4 2004: istituzione del gruppo CEN/TC275/WG6/TAG4 Horizontal method for detection of Norovirus and Hepatitis A virus in food by RT-PCR (ISO 15216-1 1 e 15216-2) Definizione metodi di riferimento per NV (GGI e GGII) e HAV: Superfici Frutta e vegetali Acqua Molluschi bivalvi Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA17
Applicazione della PCR su matrici alimentari Natura complessa e non omogenea del campione Basso numero di virus presenti Concentrazione del virus (matrice-dipendente) Estrazione e purificazione i NA (rimozione i inibenti) ib (Retrotrascrizione t i e) PCR (sensibilità & specificità) ità) Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA18
PCR su matrici alimentari: trattamento del campione Natura complessa e non omogenea del campione Basso numero di microrganismi presenti Concentrazione del virus (matrice-dipendente) > differenza con le altre analisi molecolari > differenza con le altre analisi microbiologiche colturali Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA19
PCR su matrici alimentari: trattamento del campione > Soft fruits & vegetables: riduzione i piccoli pezzi, lavaggio con tampone (controllo del ph), centrifugazione, PEG, centrifugazione > Acqua in bottiglia: filtrazione, lavaggio filtro e contenitore (controllo ph), centrifugazione i > MBV: dissezione tessuto, omogenizzazione, digestione, centrifugazione Fino al 70% del tempo analitico nella preparazione del campione > organizzazione & automazione Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA20
PCR su matrici alimentari: trattamento del campione recupero HAV NoV GI NoV GII lab L2 L3 L4 L5 L6 S1 S2 L2 L3 L4 L5 L6 S1 S2 L2 L3 L4 L5 L6 S1 S2 1 - + - - + - + - - - - + + - - - + - + + + 2 - + - - + - - - - - - - + - - - - - + + - 3 - + - - + + + - - - - + + + - - + - + + + 4 - - - - + + + - - - - + + - - - - - + + - 5 - + - - + - - - - - - - - - - - + - + + - 6 - + - - + - - - - - - - + - - - - - + + - 7 - + - - + - - - - - - + + - - - + - + + - 8 - + - - + - + - - - - + + - - - + - + + + ref - + - - + + + - - - - + + + - - + - + + + Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA21
PCR su matrici alimentari: trattamento del campione Utilizzo di un controllo di processo (virus) Calcolo del recupero dalla matrice, valutazione dell efficacia del processo di estrazione e concentrazione del virus Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA22
PCR su matrici alimentari: estrazione degli AN Varietà delle matrici Volumi Target (DNA/RNA) Automazione Estrazione e purificazione AN (rimozione inibenti) Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA23
PCR su matrici alimentari: estrazione degli AN Frutta e vegetali: Molluschi: fenoli glicogeno g polisaccaridi polisaccaridi pectina alghe polifenoli xylano Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA24
PCR su matrici alimentari: estrazione degli AN > Sistema di estrazione: guanidina tiocianato + silice, Vol estraibile/vol eluizione HAV NoV GI NoV GII ext L2 L3 L4 L5 L6 S1 S2 L2 L3 L4 L5 L6 S1 S2 L2 L3 L4 L5 L6 S1 S2 1 64% 44% 131% 101% 102% 7% 35% 120% 123% 74% 74% 53% 29% 84% 11% 6% 1% 1% 0% 9% 1% Avg : 51% (range <1-131) 84% 32% 42% 68% 37% 91% 97% 9% 7% 13% 7% 15% 18% 16% 5% 2% 7% 2% 2% 0% 11% NT NT NT NT NT NT Avg : 69% (range 44-99) Avg : 79% (range 10-149) NT 69% 77% 77% 82% 83% 78% 86% 107% 104% 88% 115% 116% 72% 66% 2 96% 61% 90% 56% 66% 48% 84% 88% 68% 49% 61% 93% 60% 76% 89% 45% 99% 44% 56% 59% 56% 3 4 100% 149% 105% 97% 87% 63% 83% 145% 139% 141% 120% 128% 17% 50% 104% 101% 89% 99% 117% 40% 50% 81% 70% 76% 87% 73% 10% 87% 98% 100% 66% 53% 10% 80% 100% 29% 40% 27% 29% 87% 27% 62% Avg : 101% (range 50-165) 147% 163% 165% 112% 68% 80% 105% 88% 129% 118% 153% 94% 81% 66% 91% 87% 107% 90% 94% 109% 125% 86% 53% 109% 50% 83% 111% 86% 81% 153% 77% 99% 101% 94% 105% 82% 71% 90% 132% 100% 130% 108% ref 96% 105% 106% 102% 110% 82% 52% 87% 97% 103% 105% 106% 121% 102% 102% 112% 108% 115% 103% 104% 63% Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA25
PCR su matrici alimentari: estrazione degli AN Utilizzo di un controllo esterno di amplificazione (RNA di sintesi) Calcolo dell efficienza di amplificazione, valutazione dell efficacia del processo di estrazione degli acidi nucleici e rimozione degli inibenti Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA26
PCR su matrici alimentari: amplificazione Varianti genetiche Livelli di contaminazione Amplificazione (inclusività e sensibilità) Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA27
Metodi di PCR adottati per la determinazione i di virus enterici i nei molluschi PubMed review (2010): NoV 70 HAV 55 Enteric viruses 46 Enterovirus 36 Adenovirus 14 Rotavirus 14 Astrovirus 11 HEV 2 Aichivirus 1 > Scelta real-time > Definizioni regioni da amplificare Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA28
GIII GI GII Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA29
Retrotrascrizione e PCR: one-step TaqMan probes: FAM-TAMRA (NoV) GI - GII FAM-MGB (HAV) NoV 5 VPG ORF 1 ORF 2 ORF 3 AAA3 NV Proteine non strutturali (hel-prot-polimerasi) Proteina capsidica Proteina strutturale Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA30
PCR su matrici alimentari: amplificazione > primers/probe pubblicati > inclusività (sulle varianti) DSPVSA Istituto Superiore di Sanità - Roma 31
PCR su matrici alimentari: amplificazione > primers/probe pubblicati > inclusività (sulle varianti) > esclusività (altri virus incluso controllo di processo flora microbica) > LOD (kit per analisi clinica vs. analisi su alimenti) Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA32
PCR per la ricerca/quantizzazione di virus in matrici alimentari: workflow metodo analitico Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA33
NoV Controllo processo Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA34
Efficienza di estrazione: controllo di processo Caratteristiche: - Virus coltivabile - Caratteristiche strutturali simili al target - Non presente naturalmente nella matrice - Assenza di interferenza nelle PCR Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA
virus virus process control Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA36
Controllo di processo / recupero 5 l campione vs. 5 l virus CP Ct = Ct camp Ct virus CP R = 2 - Ct x d Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA
process control recupero dal campione Stima della quantità di virus nel campione Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA38
Efficienza di estrazione NA: controllo di inibizione Caratteristiche: -Sequenza target - Acidi nucleici di sintesi (puri) - Quantizzato/quantizzabile Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA
plasmide con inserto di sintesi promotore RNA polimerasi estrazione del plasmide con inserto trasformazione E. coli coltura Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA
sito di taglio enzimaico i linearizzazione del plasmide standard a RNA trascrizione in vitro seq a RNA digestione DNA quantizzazione spettrofotometrica Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA
virus virus process control Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA42
Controllo di inibizione / efficienza di PCR 5 l H 2 O vs. + 1 l RNA EC 1 l RNA-EC 5 l campione + 1 l RNA-EC Ct = Ct camp Ct stand E = 2 - Ct Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA
virus efficienza della PCR Stima della quantità di virus nel campione Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA44
Determinazione del target Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA
virus virus process control Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA46
virus virus virus process control numero di copie del target analizzato + efficienza della PCR + recupero dal campione Stima della quantità di virus nel campione Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA47
ASSESSMENT OF SHELLFISH VIRAL CONTAMINATION IN ITALY: QUALITATIVE AND QUANTITATIVE DATA VENETO (Northern Adriatic sea) Year Species n HAV (%) NoV (%) 2008 2009 Tapes Mytilus Crassostrea 24 23 23 (70) 0 0 0 11 (45.8) 14 (60.9) 11 (45.8) (51 4) (70) (51.4) NoV results are considered as presence of either GI or GII copies/g Mytilus (n=14) Tapes (n=11) Crassostrea (n=11) MIN 4,8E+01 * 1,4E+01 * 1,5E+02 MAX 3,1E+04 1,4E+05 2,2E+04 geom MEAN 1,8E+03 4,9E+03 2,0E+03 range (geom mean±ds) 4,7E+01 1,1E+04 3,3E+02 7,4E+04 4,2E+02 9,6E+03 NoV results are considered as sum of GI and GII ; * estimated values (LOQ GI: 175-260 copies/g; LOQ GII: 120-180 copies/g) Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA48
ASSESSMENT OF SHELLFISH VIRAL CONTAMINATION IN ITALY: QUALITATIVE AND QUANTITATIVE DATA GULF OF NAPLES (Thyrrenian sea) Year Species n NoV (%) 2007 2010 Mytilus class A Mtil Mytilus class B Mytilus retailers * others retailers * 58 59 19+16 7+4 (=163) 13 (22.4) 47 (79.7) 7) 27 (77.1) 7 (63.6) NoV results are considered as presence of either GI or GII ; * registered + street vendors Years 2009 20102010 copies/g Mtil Mytilus cl.a la Mtil Mytilus cl.b lb (n=6) (n=21) Mytilus retailers (n=25) others retailers til (n=6) MIN 3,6E+01 * 3,8E+01 * 1,0E+01 * 2,8E+01 * MAX 7,4E+02 1,3E+05 2,4E+06 1,6E+04 geom MEAN 2,0E+02 3,4E+03 4,8E+03 1,7E+03 range (geom mean±ds) 1,4E+01 7,8E+02 2,1E+01 4,3E+04 2,6E+01 6,4E+04 2,0E+01 1,5E+04 NoV results are considered as sum of GI and GII * estimated values (LOQ GI: 175 260 copies/g; LOQ GII: 120 180 copies/g) Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA49
ASSESSMENT OF SHELLFISH VIRAL CONTAMINATION IN ITALY: QUALITATIVE AND QUANTITATIVE DATA OUTBREAKS Time NoV days copies/g batch 28.12.2012 0 5,2E+03 La Spezia batch 09.01.2013 +11 5,9E+03 batch 13.02.2013 +46 2,9E+03 batch 26.02.2013 +59 5,3E+02 Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA50
Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA51