Plasmidi 0-10 kb Fago lambda (di inserzione) 0-15 kb Fago lambda (di sostituzione) 9-23 Kb Cosmidi 30-45 Kb Batteriofago P1 70-100 Kb PAC 130-150 kb BAC 70-200 kb YAC 200-2000 kb MAC ~ 1000 kb 1
Vettori plasmidici pbr322 puc18 2
Cloning 3
Genoma di λ le 4 forme del genoma di λ 4
Genoma di λ Ciclo litico cro soppressore di cl Ciclo lisogeno soppressore cl sopprime trascrizione di altri geni di λ + cro 5
Clonaggio 6
Plasmide chimerico 7
Cosmide (Vettore ibrido) * La miscela di concatenameri è complessa e può contenere:» vettori senza inserto,» inserti multipli consecutivi,» vettori multipli senza inserto. si possono ottenere false particelle fagiche no DNA ricombinante Per ciascuna infezione 10 4-5x10 5 colonie infettate/µg DNA di inserto utilizzato 8
Vettori Cosmidici Del plasmide possiede: funzione replicativa, polylinker, marcatori che ne permettono la selezione. Del fago λ possiede: Le estremità coesive cos, 250bp assicurano la giunzione cos (sequenze necessarie per il legame e per il taglio della terminasi) Inserti fino a 45-50Kb Vettori basati sul batteriofago P1 (plasmide Ad10 con vari elementi del genoma di P1) Impacca il suo DNA in un capside che può contenere 115 Kb di DNA inserto usando sistemi di impaccamento in vitro del fago T4 inserti fino a 122 KB 9
PAC (basato sul batteriofago P1) Pac sito di impacchettamento di P1 2 siti loxp siti normalmente riconosciuti dalla ricombinasi del fago Proteina cre prodotta dal dal gene cre presente nel genoma di E. coli (cellula ospite) Vettore digerito con due enzimi di restrizione DNA genomico inserito nel sito della tetraciclina (BamHI) 10
PAC vettore plasmidico con elementi di P1 Impaccamento Estratti di impaccamento di P1: pacasi taglia il DNA ricombinante nel sito pac coopera con l estratto (t+c), inserendo il DNA nella testa, a partire dal sito pac (max 115-120kb) Si infetta un ceppo di E. Coli cre+: il prodotto del gene cre (ricombinasi) agisce sui siti loxp, promuovendo la circolarizzazione del plasmide. Cloni ricombinanti Kanamicina 11
Vettori BAC (Bacterial Artificial Chromosome) GENI REGOLATORI ori S e rep E: mediano la replicazione unidirezionale del fattore F par A e par B: mantengono il nr. di copie al livello di 1 o 2/genoma di E. coli Cos N e lox P possono generare estremità (taglio specifico con terminasi di λ) utili per: mappature di restrizione dell inserto, 12 costruire contigui di cloni.
Vettori YAC (Yeast Artificial Chromosome) VANTAGGI: si possono clonare sequenze eucariotiche con un organizzazione genomica di tipo ripetitivo frammenti di DNA 2 Mb SVANTAGGI: possibili chimere scarsa amplificazione. 1 YAC/cellula di lievito Componenti essenziali dei cromosomi di S. cerevisiae (si divide per gemmazione) a) centromero b) telomeri c) ARS elementi di Sequenza a Replicazione Autonoma (del DNA cromosomico) In totale poche centinaia di bp di DNA sufficienti perché il cromosoma sia funzionale in vivo nel lievito. Per costruire uno YAC combinare 4 corte sequenze 2 telomeri 1 centromero 1 sequenza ARS Queste 4 sequenze + DNA estraneo, lineare e di adeguate dimensioni cromosoma funzionale nel lievito S. cerevisiae 13
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Costruzione di uno YAC Cellule di lievito ospite AB1380 AB1380 possiede una mutazione nel gene ade-2 (cellule rosse) e alleli recessivi per trp1 e ura3 (sistema di selezione) amp: gene per la resistenza all ampicillina ori: origine di replicazione per la propagazione in E. coli SUP4: gene di un trna soppressore che annulla la mutazione ade-2 (presente nel ceppo di lievito ospite) TRP1 e URA3 servono come sistema di selezione per identificare le cellule che contengono il vettore YAC Cellula di lievito ospite AB1380 con gene mut. Ade-2 colonie rosse (fenotipo mutante) L introduzione di uno YAC con il gene SUP4 intatto (senza inserto) sopprime la mutazione ade-2 colonie incolori L introduzione di uno YAC con il gene SUP4 interrotto dal DNA clonato ripristina il fenotipo mutante colonie rosse 15
Cloni BAC, PAC e YAC sono stati utili per clonare grandi regioni genomiche, per generare la mappa fisica del genoma umano, identificare geni legati a malattie e per generare topi transgenici e per studi di espressione. Problemi per: espressione genica a lungo termine in cellule umane e terapia genica somatica potenziale mutazione inserzionale silenziamento del transgene in seguito ad inserimento nei cromosomi dell ospite HACs offrono un approccio alternativo Replicano e segregano come cromosomi normali, usano le componenti funzionali della cellula ospite senza integrarsi, evitando così il problema di un eventuale silenziamento genico Es: gene di resistenza all igromicina in cellule ibride CHO Ci si aspetta un espressione regolata e a lungo termine di piccoli e grandi loci e ridotti rischi di risposte immunitarie. 16
TOP-DOWN approach TACF (telomere-associated chromosome fragmentation) Sviluppato nel 1991 α DNA alfoide Y umano telomero umano neo marker (neomicina) Usati per frammentare il braccio q del cromosoma Y per ricombinazione omologa, tra centr e il DNA alfoide in cellule ibride uomo-hamster. Selezione dei cloni + con G418 (antib). Secondo ciclo di frammentazione con un diverso vettore target con marker gpi guanina-fosforibosil-trasferasi Cloni + selezionati per la presenza dei marcatori in terreno HAT HAT: Hypoxantine-Aminopterin-Thymidine 17
BOTTOM-UP approach Harrington 1997 Co-transfezione con mix di sequenze alfoidi umane sintetiche, telomeri, DNA genomico e un marcatore in HT1080 (linea cellulare di fibrosarcoma). - DNA alfoide umano è clonato in un grande costrutto con marker (neo) - Cloni stabili neomicina R selezionati con G418 e analizzati per la formazione di HAC 18
TACF (telomere-associated chromosome fragmentation) a. Sonda human Cot1 Sonda EGFP transgene b. Minicromosoma X umano (~ 500Kb) in cellule di pollo DT40: - α-satellite DXZ1 - CENP-C c-d. HAC in cellule di topo LA-9 c. D17Z1 ibroda con HAC satellite minor di topo ibrida solo con centromero di topo. d. CENP-C ibrida su HAC 19
Due tra i metodi usati per esprimere il gene HPRT portato da un HAC per complementare cellule mutate per il gene HPRT. a. costrutto di 440kb con αdna del cr 17 locus genomico HPRT1 da Xq26.2 due marcatori neomicina e puromicina. Usato per trasfettare locus genomico HPRT1 da Xq26.2. b. due diversi costrutti 21 αdna e locus HPRT1 da Xq26.2 co-trasfettati in locus genomico HPRT1 da Xq26.2 HPRT: (hypoxhanthine guanine phosporibosyltransferase) Efficienza 20-80% HAC stabili per diversi mesi in assenza di selezione Segregazione accurata nel 98% delle mitosi Selezione dei cloni+ con G418 (geneticina). (analogo della neomicina solfato) 20
Macnab and Whitehouse, Gene Therapy, 16:1180-1188, 2009 AC Artificial Chromosome BAC Bacterial Artificial Chromosome HAC Human Artificial Chromosome PAC P1-derived Artificial Chromosome YAC Yeast Artificial Chromosome 21
Potential characteristics of human artificial chromosomes (HACs) Kazuki and Oshimura, Molecular Therapy, 19 9, 1591 1601, 2011. b The size limits depend on each vector. (c,d) Limitations and consequences of gene delivery with conventional vectors such as a virus or plasmid, and with HACs, respectively. 22
Kazuki and Oshimura, Molecular Therapy, 19 9, 1591 1601, 2011. An example for the construction of engineered human artificial chromosomes (HACs) via top-down approach and subsequent gene delivery. HAC ideale: NON deve contenere geni endogeni del cromosoma di partenza Microcell-Mediated Chromosome Transfer The Cre-lox system is used as a genetic tool to control site specific recombination events in genomic DNA. chicken B cell line DT40 allows efficient gene disruptions due to its high homologous recombination activity 23
Thus, the resulting 21HAC vector contains four useful features: (i) it has a well-defined genetic architecture; (ii) it is episomally present, independent of the host chromosomes; (iii) it is mitotically stable in human somatic cells in vitro and mouse cells both in vitro and in vivo; and (iv) it has a system for safeguarding against tumor formation. Furthermore, any desired gene could be cloned into the 21HAC using the Cre-loxP system in Chinese hamster ovary cells, or by a homologous recombination system in DT40 cells. 24
Kazuki and Oshimura, Molecular Therapy, 19 9, 1591 1601, 2011. Schematic diagram of the human artificial chromosome (HAC) vector system for functional analyses and for the treatment of genetic disorders. (a) HAC construction with gene(s) of interest. ips: induced pluripotent stem HSC: hematopoietic stem cell MAB: mesoangioblast mgs: multipotent germline stem MSC: mesenchymal stem cell 25
Kazuki Y. and Oshimura M. Human Artificial Chromosomes for Gene Delivery and the Development of Animal Models Molecular Therapy, vol. 19 no. 9, 1591 1601 sep. 2011 Macnab S. and Whitehouse A. Progress and prospects: human artificial chromosomes. Gene Therapy, 16, 1180 1188, 2009 26