SPETTROFOTOMETRIA D.C. Harris, Elementi di chimica analitica, Zanichelli Capitoli 7 e 8 Spettroscopia: originariamente era quella branca della scienza in cui si studiava come la luce (visibile) può essere risolta nelle sue componenti. Spettri: grafici dell intensità radiante in funzione della lunghezza d onda o della frequenza. Recentemente il significato di spettroscopia è stato ampliato per includere gli studi con altri tipi di radiazione elettromagnetica, quali raggi X, ultravioletto, infrarosso, microonde, e radiazione a radiofrequenza. 1
PROPRIETÀ ONDULATORIE DELLA RADIAZIONE ELETTROMAGNETICA Molte delle proprietà delle radiazioni elettromagnetiche sono convenientemente descritte trattando le radiazioni come onde sinusoidali. N.B. - La radiazione elettromagnetica non richiede mezzo di supporto per la sua trasmissione. 2
Parametri d onda Ampiezza (A): lunghezza del vettore elettrico al massimo nell onda. È una misura della forza del campo elettrico al massimo dell onda. Periodo (p): tempo in secondi richiesto per il passaggio di massimi o minimi successivi attraverso un punto fisso nello spazio. Frequenza (ν): numero di oscillazioni del campo per secondo ( = 1/p). Viene misurata in hertz (Hz = numero di cicli per secondo) o in s -1. 3
Parametri d onda Lunghezza d onda (l): distanza lineare fra due punti equivalenti su onde successive (per esempio, massimi o minimi successivi). Velocità di propagazione (V): spazio percorso in un secondo, rapporto tra la lunghezza d onda e il periodo o prodotto della frequenza (s -1 ) per la lunghezza d onda (m). V = λ p = λν Numero d onda ( ); reciproco della lunghezza d onda (cm -1 ). È direttamente proporzionale alla frequenza (e quindi all energia) della radiazione. La costante di proporzionalità è il reciproco della velocità. ν ҧ = 1 λ = ν V V = ν νҧ 4
La radiazione elettromagnetica ha numerose forme, che dipendono dalla sua frequenza, quali: - radiazione a radio frequenza. - microonde (mw) - calore radiante - luce visibile (VIS) - ultravioletto (UV) - raggi X - raggi gamma 5
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La frequenza di un fascio di radiazione (n) è determinata dalla sorgente e rimane costante. Al contrario, la velocità (V) della radiazione (e quindi la sua lunghezza d onda, l) dipende dalla composizione del mezzo che essa attraversa, secondo l equazione: V i = λ i /p = ν λ i 7
Nel vuoto, la velocità alla quale la radiazione si propaga è massima: c = 3.0 l0 8 m/s. Nell aria la velocità differisce solo leggermente da c (è circa lo 0.03% in meno). In qualunque mezzo contenente materia, la propagazione della radiazione è rallentata dall interazione con gli atomi o molecole presenti nel mezzo. Il rapporto tra la velocità di propagazione nel vuoto (c) e nel mezzo (V i ), ad una determinata lunghezza d onda, è l indice di rifrazione n i : n i = c/v i L indice di rifrazione dell acqua a 20 C è 1.33, mentre quello del vetro varia da 1.5 a 1.9. 8
Proprietà particellari della radiazione elettromagnetica Il modello ondulatorio non è adeguato a spiegare l assorbimento e l emissione di energia radiante. Si ricorre allora a un modello basato sulle particelle: la radiazione elettromagnetica è trattata come una corrente di particelle o pacchetti di energia chiamati fotoni. L energia di un fotone è proporzionale alla frequenza della radiazione, secondo la legge di Planck: E hn hc l hcv dove h è la costante di Planck (= 6.63 10-34 J s). 9
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Assorbimento di radiazione Un fotone che incontra una molecola può essere assorbito provocando la promozione di uno degli elettroni più esterni dallo stato fondamentale ad uno stato eccitato. E = hn M + hn M* Perchè un fotone sia assorbito occorre che la sua energia sia esattamente uguale alla differenza tra stato eccitato e stato fondamentale. 11
Dopo un breve periodo (10-6 10-9 s) la specie eccitata si rilassa al suo stato fondamentale, perdendo l energia in eccesso secondo diverse possibili vie: emissione di calore, decomposizione fotochimica, riemissione fosforescente o fluorescente: M* M + energia Cozzi, Protti, Ruaro, Vol. B. La vita media di M* è molto breve e la sua concentrazione sempre molto bassa; il processo di eccitazione e rilassamento non turba il sistema.
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Assorbimento di radiazione In pratica, il fascio di luce che colpisce il campione viene assorbito (attenuato) selettivamente, cioè in modo diverso per le diverse frequenze che lo compongono. Per un dato campione, l assorbimento dipende in modo unico dalla lunghezza d onda (frequenza) del raggio incidente. Soluzione campione 14
Come si registra l assorbimento di radiazione da parte di una soluzione? SPETTROFOTOMETRO 15
Quali sono le grandezze sperimentali? Potere radiante (P): energia del raggio che raggiunge una certa area, per secondo. È legata all ampiezza della radiazione. Trasmittanza: frazione di radiazione incidente trasmessa dal mezzo: T = P/ P 0 %T = P/ P 0 x 100 Assorbanza: log in base 10 dell inverso della trasmittanza: A = log 10 1/T = - log 10 T = log 10 P 0 /P 16
Quali sono le grandezze sperimentali? Per un dato campione, la trasmittanza (e, ovviamente, l assorbanza) dipendono dalla lunghezza d onda. Lo spettrofotometro è in grado di misurare l attenuazione della radiazione in un ampio campo di lunghezze d onda. Spettro d assorbimento Grafico dell attenuazione della radiazione, in funzione della lunghezza d onda, la frequenza o il numero d onda. 17
Spettro di assorbimento di una tipica crema protettiva solare 18
Spettri di assorbimento di soluzioni colorate 19
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Spettri di assorbimento di un indicatore acido-base 21
Spettrofotometro a singolo raggio Spettrofotometro a doppio raggio How does a spectrophotometer work? https://www.youtube.com/watch?v=pxc6f7bk8cu 22
Sorgenti per la spettrofotometria di assorbimento molecolare
La lampada a deuterio Spettro di emissione di una lampada a deuterio
MONOCROMATORI I monocromatori sono in generale di due tipi: a reticolo o a prisma. Attualmente quasi tutti i monocromatori sono basati su reticoli a riflessione, in quanto sono meno costosi dei prismi e rendono possibile la progettazione di strumenti più compatti e più semplici.
MONOCROMATORI Principio di funzionamento di un monocromatore: il reticolo permette di separare i colori Superficie di un reticolo di diffrazione al microscopio Spettro ottenuto da un prisma per rifrazione
Cuvette per acquisizione di spettri nell UV e nel VIS 27
Cuvette per acquisizione di spettri nell UV e nel VIS 28
MATERIALI OTTICI Le celle, le finestre, le lenti e gli elementi dispersivi in uno spettrofotometro devono essere trasparenti nella regione di lunghezze d onda che è stata selezionata per l analisi. 29
Rivelatori fotonici I più utilizzati sono: fototubi, tubi fotomoltiplicatori, fotodiodi al silicio, celle fotovoltaiche, celle fotoconduttrici, dispositivi a trasferimento di carica.
Rivelatore a serie di diodi
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Legge di Beer-Lambert-Bouguer Per una radiazione monocromatica, l assorbanza è direttamente proporzionale alla lunghezza del cammino ottico (b) attraverso il mezzo ed alla concentrazione (c) della specie assorbente. Pierre Bouguer (1698 1758) è stato un matematico e geofisico francese A = e b c Se b è in cm e c in moli/litro, la costante di proporzionalità ε è chiamata coefficiente di assorbimento molare ed è misurata in cm -1 M -1 How a Simple UV-visible Spectrophotometer Works https://www.youtube.com/watch?v=wxraelexlek Jean-Henri Lambert (1728 1777), è stato un filosofo, matematico, fisico e astronomo svizzero August Beer (1825 1863) è stato un fisico, chimico e matematico tedesco 33
Legge di Beer-Lambert-Bouguer Il valore di b è un parametro strumentale noto (generalmente 1 cm). Il coefficiente di assorbimento molare dipende invece da parametri sperimentali, quali la temperatura, la composizione della soluzione (matrice), la lunghezza d onda d analisi e la natura dell analita. In generale, e non è noto. Per determinarlo si ricorre alla costruzione della curva di calibrazione. A = e b c 34
ANALISI QUANTITATIVA PER VIA SPETTROFOTOMETRICA: DETERMINAZIONE DELLO IONE NITRITO Retta di calibrazione 35
La legge di Lambert-Beer si applica anche a miscele, ammettendo che non vi siano interazioni tra le specie assorbenti: A totale = A 1 + A 2 + A 3 +... = e 1 bc 1 + e 2 bc 2 + e 3 bc 3 +... 36
TITOLAZIONI SPETTROFOTOMETRICHE 37
In seguito all assorbimento di un fotone, alcune molecole sono in grado di rilassarsi (tornare cioè allo stato fondamentale) perdendo l energia in eccesso attraverso riemissione fosforescente o fluorescente: M* M + hν
Componenti fondamentali di uno spettrofluorimetro
Relazione tra intensità di fluorescenza e concentrazione I = k P 0 c dove: P 0 = intensità della radiazione incidente; k = costante c = concentrazione
La fluorimetria è una tecnica molto sensibile e adatta all analisi di tracce. Purtroppo molti analiti non sono fluorescenti In diversi casi è possibile derivatizzare l analita in modo da renderlo fluorescente. Un esempio è la determinazione dello ione calcio attraverso la misurazione della fluorescenza del suo complesso con la calceina.
Applicazioni della spettrofluorimetria Osservazione di singole molecole di DNA con i molecular beacon La presenza di una singola catena di DNA o RNA bersaglio in un campione può essere rivelata con questi segnalatori molecolari.
Saggi immuno-enzimatici ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay
ELISA L enzima legato all anticorpo 2 può catalizzare reazioni che producono specie colorate o fluorescenti, facilmente determinabili.
Aequorea Osamu Shimomura, Roger Tsien, Martin Chalfie Premi Nobel per la Chimica 2008 Green Fluorescent Protein (GFP) 46
Come funzionano le lampade a fluorescenza? https://www.youtube.com/watch?v=4b\uh-6sadn8