La scoperta della doppia elica mezzo secolo fa ha coinvolto la pratica medica con lentezza, ma sono probabili trasformazioni significative nei prossimi 50 anni. Bisogna cambiare la pratica medica e la formazione dei medici per poter realizzare i potenziali benefici Bell, Nature 421: 414, 2003 Tratta da lezioni di genetica Prof. PF Pignatti 1
In base al potere di risoluzione della tecnica Metodologie citogenetiche Metodologie molecolari Formulare la domanda Utilizzare la metodica appropriata 2
Metodologie molecolari Analisi Southern (DNA) Analisi Northern (RNA) Analisi Western (Proteine) PCR (DNA) RT-PCR (RNA) Microarray (DNA RNA Proteine) 3
Sonde Molecolari Sequenze nucleotidiche marcate a singolo filamento in grado di riconoscere sequenze complementari 4
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Denaturazione di una molecola di acido nucleico a doppia elica Rinaturazione o ibridazione di polinucleotidi a filamento singolo in una molecola a doppia elica 6
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Marcatura Radioisotopi ( 32 P, 3 H, 35 S) Fluorescenti (biotina-avidina) Chemiluminescenti (fosfatasi alcanica) 8
Analisi Southern Estrazione del DNA Quantificazione e Controllo Qualità Digestione con Enzimi di Restrizione Elettroforesi preparativa Trasferimento del DNA dal gel ad un supporto di nylon Ibridazione con la sonda Autoradiografia 9
Enzimi di Restrizione Endonucleasi che riconoscono e tagliano il DNA a livello di specifiche sequenze 10
Elettroforesi 11
Elettroforesi di DNA genomico umano tagliato con enzimi di restrizione 12
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Immagine ottenuta dopo: ibridazione della membrana con una specifica sonda esposizione della membrana su lastra autoradiografica sviluppo della lastra 15
Analisi Northern Estrazione dell RNA totale Isolamento degli mrna o Arricchimento dei mirna Elettroforesi Trasferimento del RNA dal gel ad un supporto di nylon Ibridazione con la sonda Autoradiografia 16
Elettroforesi di RNA totale 17
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Limiti Notevole quantità di DNA - RNA Proteine (numero elevato di cellule da analizzare) Uso di sostanze radioattive Tempo impiegato 20
PCR - Polymerase Chain Reaction ideata nel 1983 da Kary B. Mullis il quale ottenne, per questo, il premio Nobel per la chimica (1993). Questa tecnica, utilizzando i principi della duplicazione del DNA, permette di ottenere in poco tempo notevoli quantità di materiale specifico 21
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PCR schema 23
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DNA bersaglio Primers Enzima Nucleotidi trifosfati Ioni Mg ++ 25
DNA bersaglio Campione Primers Oligonucleotidi sintetici complementari a sequenze fiancheggianti il tratto di DNA da studiare 20 25 bp Enzima DNA polimerasi Nucleotidi trifosfati 26
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Termociclatori Denaturazione del DNA (94 C) Ibridazione dei primers al bersaglio (40 C 60 C) Sintesi del DNA (72 C) 29
Denaturazione Ibridazione Sintesi Denaturazione Ibridazione Sintesi 30
Vantaggi Si può evitare l uso di tecniche più laboriose. Velocità di esecuzione Si possono analizzare campioni di poche cellule (anche 1 cellula). Elevata sensibilità 31
Biopsie Analisi prenatale e Analisi preimpianto Tracce di infezioni virali Malattia mimima residua Medicina forense 32
Real Time PCR 33
Permette di quantificare il DNA del campione analizzato Ricerca di DNA virali Ricerca di OGM negli alimenti 34
RT-PCR Reverse transcription-pcr 35
Sequenziamento 36
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Scomparsa di un sito BclI nel gene del fattore VIII 39
PCR allele specifica 40
Multiplex ARMS test per individuare 4 specifiche mutazioni che causano la fibrosi cistica 41
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Diagnosi di malattie da espansione di triplette ripetute 44
Analisi contemporanea di più geni 45
Queste tecniche si basano sempre sul principio dell ibridazione; Differenze: legato al supporto troviamo un oligonucleotide non il campione il campione è marcato 46
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Il campione: RNA totale convertito in cdna e marcato (analisi dell espressione) DNA genomico (analisi delle mutazioni) 48
Un supporto a cui vengono legati degli oligonucleotidi specifici: Complementari ai geni che vogliamo studiare Complementari a sequenze normali e a sequenze mutate 49
Ibridazione di DNA amplificato con PCR ad oligonucleotidi allele specifici (ASO) 50
DNA microarrays consist of thousands of individual gene sequences bound to closely spaced regions on the surface of a glass microscope slide. 20-50 µm 20-50 µm Millions of identical oligonucleotide probes per feature 49-400 chips/wafer 1.28cm up to ~ 400,000 features/chip 51
To conduct a multiplex gene expression screen, a microarray needs to be designed to contain cdna clones or gene-specific oligonucleotides (designed from transcribed gene regions) to represent every gene of interest. To investigate expression of the chosen genes represented in such arrays, RNA is prepared from the selected target cells, converted into cdna using standard reverse transcriptase procedures, labeled with a fluorescent tag and hybridized to the microarray. cdna clones oligonucleotide arrays 52
Schematically Before labelling Array 53
Schematically Labelled but before hybridization Array 54
Schematically After hybridization Array 55
Schematically Quantification 4 2 0 3 Array 56
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Microarrays may be used to assay gene expression within a single sample or to compare gene expression in two different cell types or tissues samples, such as in healthy and diseased tissue. Follow population of (synchronized) cells over time, to see how expression changes (vs. baseline) Expose cells to different external stimuli and measure their response (vs. baseline) Take cancer cells (or other pathology) and compare to normal cells. RNA Tumor sample Reference sample RNA green laser excitation red laser cdna cdna emission Hybridize overlay images and normalise 58
Gene expression during tumorigenesis - cells can be sampled at different recognized stages during the progression to cancer 59
Developmental stage-specific gene expression 60
Gene expression during differentiation - investigation of how gene expression patterns are altered during differentiation. 61
screening of polymorphisms and mutation There is also huge potential for assaying for mutations in known disease genes, as recently exemplified in the case of the breast cancer susceptibility gene, BRCA1. In addition, there have been vigorous efforts to identify and catalog human single nucleotide polymorphism (SNP) 62 markers
ADVANTAGES Microarray analysis offers the advantage of profiling expression levels of hundreds or thousands of genes simultaneously using a single RNA preparation Human ~ 25,000 genes Mouse ~ 25,000 genes Theorycally, all genes of an organism can be analyzed by a single array Easy to use Yeast ~ 6200 genes E. coli ~ 4200 genes High speed This technology is a very dynamic one and Phage ist4 currently ~ 20 genes spawning a variety of derivative technologies including the development of protein and antibody microarrays and cell microarrays Influenza ~ 12 genes 63
LIMITS Obviously, this is an expression-based technology, capable only of monitoring cellular responses at the RNA level. Some critical signaling changes may occur only at the protein or posttranslational level and therefore would not be detected with gene arrays. The correlation between the number of mrna and protein molecules is generally not strong enough to predict one value from the measurement of the other DNA transcription mrna translation Protein 64
LIMITS High cost technology No quantitative: 3 fold variations are experimental Data interpretation represent a complex problem: mrna profiling data (as other applications) typically consist of many thousands of measurements for each array Needs verification by other approach (i.e., Real time PCR) 65
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