Indice generale Prefazione all edizione americana Prefazione all edizione italiana Ringraziamenti dell Editore Guida alla lettura PARTE 1 Introduzione XIII XIV XV XVI CAPITOLO 1 Brevi cenni storici 1.1 La genetica della trasmissione 1 Le leggi di Mendel dell ereditarietà 2 La teoria cromosomica dell ereditarietà 3 Ricombinazione genetica e mappatura 5 Evidenze fisiche della ricombinazione 6 1.2 Genetica molecolare 6 La scoperta del DNA 7 Le relazioni tra geni e proteine 7 Le attività dei geni 9 1.3 I tre domini della vita 12 Riassunto 14 CAPITOLO 2 La natura molecolare dei geni 2.1 Natura del materiale genetico 17 La trasformazione nei batteri 17 Natura chimica delle catene nucleotidiche 21 2.2 Struttura del DNA 25 Evidenze sperimentali di base 25 La doppia elica 27 2.3 Geni costituiti da RNA 30 2.4 Chimica fisica degli acidi nucleici 30 Diversità delle strutture di DNA 30 DNA di diverse misure e forme 35 Riassunto 38 Per il ripasso 39 Per l approfondimento 39 CAPITOLO 3 Introduzione alla funzione dei geni 3.1 La conservazione dell informazione 41 Introduzione all espressione genica 41 Struttura delle proteine 42 Ruolo delle proteine 47 Scoperta degli RNA messaggeri 49 Trascrizione 50 Traduzione 54 3.2 Replicazione 60 3.3 Mutazioni 61 Anemia falciforme 61 Riassunto 64 Per il ripasso 65 Per l approfondimento 65 PARTE 2 Metodiche della biologia molecolare CAPITOLO 4 Tecniche di clonaggio molecolare 4.1 Clonaggio dei geni 67 Il ruolo delle endonucleasi di restrizione 68 Identificare un clone specifico con una sonda specifica 85 Clonaggio di cdna 86 4.2 Reazione a catena della polimerasi 90 La PCR convenzionale 91 Box 4.1 Jurassic Park: solo fantasia? 93 PCR Real-Time 95 4.3 Metodi per l espressione di geni clonati 96 Vettori di espressione 96 Altri vettori eucariotici 105 Uso del plasmide Ti per trasferire geni nelle piante 106 Riassunto 108 Per il ripasso 109 Per l approfondimento 109 CAPITOLO 5 Strumenti molecolari per lo studio dei geni e dell attività genica 5.1 Separazioni molecolari 111 Elettroforesi su gel 111 Elettroforesi bidimensionale 114 Cromatografia a scambio ionico 116 Cromatografia per filtrazione su gel 117 Cromatografia di affinità 119 5.2 Traccianti marcati 119 Autoradiografia 120 Phosphorimaging 121 Conta a scintillazione in liquido 122
VIII Indice generale Traccianti non radioattivi 123 5.3 L ibridazione degli acidi nucleici 124 Identificazione di frammenti di DNA mediante Southern blot 124 Tipizzazione del DNA e DNA fingerprinting 126 Impiego forense delle impronte digitali del DNA e della sua tipizzazione 127 Immunoblot (Western blot) 130 Sequenziamento del DNA 132 Mappatura per restrizione 136 Modificazione delle proteine tramite clonaggio genico: mutagenesi sito diretta 139 5.4 Mappare e quantificare i trascritti 141 Northern blot 142 Mappatura S1 143 Estensione dell innesco (Primer extension) 146 Trascrizione run-off e trascrizione di cassette senza G 148 5.5 Misura del tasso di trascrizione in vivo 150 Trascrizione nucleare run-on 150 Trascrizione di geni reporter 152 Misura dell accumulo di proteine in vivo 154 5.6 Studio delle interazioni DNA-proteine 155 Legame su filtro 155 Saggio di ritardo (shift) della mobilità su gel 156 Footprinting con DNasi 156 Footprinting con DMS e altre tecniche di footprinting 159 5.7 Alla ricerca di sequenze di RNA che interagiscono con altre molecole 160 SELEX 160 SELEX Funzionale 161 5.8 Knockouts 162 Riassunto 166 Per il ripasso 167 Per l approfondimento 168 PARTE 3 La trascrizione nei procarioti CAPITOLO 6 Il meccanismo della trascrizione nei procarioti 6.1 La struttura della RNA polimerasi 169 La specificità del fattore sigma (σ) 170 6.2 I promotori 170 Il legame della RNA polimerasi ai promotori 171 La struttura del promotore 172 6.3 Inizio della trascrizione 175 Le funzioni di σ 175 Struttura e funzione del fattore σ 181 Il ruolo della subunità-α nel riconoscimento dell elemento a monte del promotore 185 6.4 Allungamento 186 Struttura del complesso di allungamento 191 6.5 Terminazione della trascrizione 205 Terminazione Rho-dipendente 209 Riassunto 213 Per il ripasso 214 Per l approfondimento 215 CAPITOLO 7 Gli operoni: il controllo fine della trascrizione nei procarioti 7.1 L operone lac 217 Il controllo negativo dell operone lac 219 La scoperta dell operone 221 Il meccanismo della repressione 222 Il controllo positivo dell operone lac 224 Il meccanismo di azione di CAP 225 7.2 L operone ara 231 La struttura a cappio del DNA nella repressione dell operone ara 231 Evidenze a favore della struttura a cappio nella repressione dell operone ara 233 Autoregolazione di AraC 233 7.3 L operone trp 234 Il ruolo del triptofano nel controllo negativo dell operone trp 234 Il controllo dell operone trp mediante attenuazione 236 Annullamento dell attenuazione 237 7.4 Ribointerruttori 240 Riassunto 243 Per il ripasso 244 Per l approfondimento 245 CAPITOLO 8 Regolatori trascrizionali in procarioti: struttura e funzione 8.1 Modificazioni del fattore sigma 247 L infezione fagica 248 La sporulazione 250 Geni con promotori multipli 251 Altre modificazioni del fattore σ 252 8.2 La RNA polimerasi codificata dal fago T7 253 8.3 L infezione di E. coli a opera del fago λ 254
Indice generale IX La riproduzione litica del fago λ 256 Stabilirsi della lisogenia 263 Autoregolazione del gene ci durante la lisogenia 265 Il destino di un infezione fagica: lisi o lisogenia 269 L induzione della lisogenia 271 8.4 La famiglia dei repressori di λ 272 Analisi della specificità di legame mediante mutagenesi sito-diretta 272 Box 8.1 Cristallografia a raggi X 274 Analisi ad alta risoluzione delle interazioni repressore-operatore di λ 278 8.5 Il repressore del triptofano 282 Il ruolo del triptofano 283 8.6 Considerazioni generali sulle interazioni proteina-dna 285 Capacità di formare legami idrogeno delle quattro differenti paia di basi 285 L importanza delle proteine multimeriche che legano il DNA 286 8.7 Le proteine che legano il DNA: azione a distanza 287 L operone gal 287 Gli operatori duplicati di λ 288 Riassunto 290 Per il ripasso 292 Per l approfondimento 293 PARTE 4 La trascrizione negli eucarioti CAPITOLO 9 RNA polimerasi, promotori e fattori generali della trascrizione in eucarioti 9.1 Molteplicità delle RNA polimerasi eucariotiche 295 I ruoli delle tre RNA polimerasi nucleari 296 Struttura a subunità delle RNA polimerasi 298 9.2 Promotori 315 Promotori di classe II 315 Promotori di classe I 320 Promotori di classe III 321 9.3 Enhancer e silenziatori 325 Enhancer 325 Silenziatori 328 9.4 Fattori generali di trascrizione negli eucarioti 329 I fattori e il complesso di preinizio di classe Il 329 Struttura e funzione di TFIID 332 Struttura e funzione di TFIIB 344 Struttura e funzione di TFIIH 346 Formazione della bolla di trascrizione 349 Il complesso del mediatore e l oloenzima della polimerasi II 351 Il fattore di allungamento TFIIS 352 9.5 Fattori di classe I 354 Il fattore che lega l elemento centrale 355 Il fattore che lega l elemento UPE 357 Struttura e funzione di SL1 358 9.6 Fattori di classe III 359 TFIIIA 360 TFIIIB e C 361 Il ruolo di TBP 363 Riassunto 365 Per il ripasso 368 Per l approfondimento 369 CAPITOLO 10 Attivatori trascrizionali negli eucarioti 10.1 Categorie di attivatori 371 Domini di legame al DNA 372 Domini di attivazione trascrizionale 372 10.2 Strutture dei motivi di legame al DNA degli attivatori 373 Dita di zinco 373 La proteina GAL4 376 I recettori nucleari 378 Omeodomini 380 I domini bzip e bhlh 381 10.3 Indipendenza dei domini degli attivatori 383 10.4 Funzioni degli attivatori 385 Reclutamento di TFIID e dell oloenzima 385 10.5 Interazione tra gli attivatori 387 Dimerizzazione 388 Azione a distanza 389 Enhancer complessi 392 Fattori di trascrizione architetturali 394 Isolatori 397 10.6 Regolazione dei fattori di trascrizione 401 Coattivatori 401 Ubiquitilazione di un attivatore 405 Sumoilazione dell attivatore 407 Acetilazione dell attivatore 408 Vie di trasduzione del segnale 408 Riassunto 412 Per il ripasso 413 Per l approfondimento 414
X Indice generale CAPITOLO 11 Struttura della cromatina e suoi effetti sulla trascrizione 11.1 Istoni 415 11.2 Nucleosomi 417 La fibra da 30 nm 421 L ordine di ripiegamento superiore della cromatina 423 11.3 Struttura della cromatina ed espressione genica 426 L effetto degli istoni sulla trascrizione dell RNA ribosomale (rrna) 5S 426 L effetto degli istoni sulla trascrizione dei geni di classe II 428 Il posizionamento dei nucleosomi 431 Acetilazione degli istoni 437 Deacetilazione degli istoni 439 Il rimodellamento della cromatina 442 Eterocromatina e silenziamento 452 I nucleosomi e l allungamento della trascrizione 457 Riassunto 460 Per il ripasso 461 Per l approfondimento 462 PARTE 5 Processi post trascrizionali CAPITOLO 12 Il processing dell RNA messaggero. Fase I: splicing 12.1 Geni a pezzi 463 Evidenze di geni interrotti 464 Lo splicing dell RNA 466 I segnali di splicing 468 12.2 Il meccanismo di splicing dei precursori nucleari dell mrna 469 Un intermedio ramificato 469 Il segnale di ramificazione 472 Spliceosomi 473 Assemblaggio e funzione dello spliceosoma 479 Reclutamento, selezione del sito di splicing e splicing alternativo 482 Ruolo del CTD della polimerasi II 486 Meccanismi di controllo dello splicing 490 12.3 Gli RNA che fanno auto-splicing 492 Introni di gruppo I 492 Introni di gruppo II 495 Riassunto 496 Per il ripasso 497 Per l approfondimento 498 CAPITOLO 13 Il processing dell RNA messaggero. Fase II: capping e poliadenilazione 13.1 Capping 499 Struttura del cap 499 Sintesi del cap 500 Funzioni del cap 503 13.2 Poliadenilazione 504 Poli(A) 504 Funzioni del poli(a) 506 Il meccanismo di base della poliadenilazione 507 I segnali di poliadenilazione 509 Taglio e poliadenilazione di un pre-mrna 511 Poli(A) polimerasi 514 Turnover del Poli(A) 515 13.3 Coordinazione degli eventi di processamento dell mrna 517 Effetto del cap sullo splicing 517 Effetto del poli(a) sullo splicing 518 Il legame del CTD di Rpb1 alle proteine che processano l mrna 518 I cambiamenti nell associazione tra i fattori di processamento dell RNA e il CTD sono correlati ai cambiamenti dello stato di fosforilazione del CTD 519 Accoppiamento tra terminazione della trascrizione e processamento dell estremità 3 dell mrna 520 Meccanismo della terminazione 521 Il ruolo della poliadenilazione nel trasporto dell mrna 523 Riassunto 524 Per il ripasso 525 Per l approfondimento 526 CAPITOLO 14 Altri eventi di processamento dell RNA 14.1 Processamento dell RNA ribosomale 527 Processamento dell rrna eucariotico 527 Processamento dell rrna batterico 531 14.2 Processamento dell RNA transfer 532 Il taglio di precursori policistronici 532 Formazione di estremità mature al 5 532 Formazione di estremità mature al 3 533 14.3 Trans-splicing 534 Il meccanismo del trans-splicing 534 14.4 Editing dell RNA 537 Meccanismo dell editing 539
Indice generale XI Editing attraverso deaminazione nucleotidica 542 14.5 Controllo post trascrizionale dell espressione genica 543 Stabilità dell mrna della caseina 544 Stabilità dell mrna per il recettore della trasferrina 544 Interferenza dell RNA 545 MicroRNA e silenziamento genico 556 Riassunto 561 Per il ripasso 562 Per l approfondimento 563 PARTE 6 La traduzione CAPITOLO 15 Il meccanismo della traduzione I: l inizio 15.1 L inizio della traduzione nei batteri 565 Il caricamento del trna 565 Dissociazione dei ribosomi 567 Formazione del complesso di inizio 30S 571 La formazione del complesso di inizio 70S 579 Sommario dell inizio nei batteri 580 15.2 Inizio negli eucarioti 582 Il modello di scansione dell inizio 582 Fattori d inizio eucariotici 586 Sguardo globale dell inizio della traduzione negli eucarioti 586 15.3 Controllo dell inizio 593 Controllo della traduzione nei batteri 594 Riassunto 597 Per il ripasso 598 Per l approfondimento 598 CAPITOLO 16 Il meccanismo della traduzione II: allungamento e terminazione 16.1 La direzione della sintesi e della traduzione dell mrna 601 16.2 Il codice genetico 603 I codoni non si sovrappongono 604 Non ci sono interruzioni nel codice 604 Il codice a triplette 606 La decifrazione del codice 607 Appaiamenti insoliti tra codone e anticodone 609 Un codice (quasi) universale 610 16.3 Il meccanismo dell allungamento 614 Uno sguardo sull allungamento 614 Il modello a tre siti del ribosoma 616 Fase 1 dell allungamento: legame di un amminoacil-trna al sito A del ribosoma 619 Fase 2 dell allungamento: formazione del legame peptidico 621 Fase 3 dell allungamento: la traslocazione 622 Le GTPasi e la traduzione 623 16.4 La terminazione 625 I codoni di terminazione 625 Fattori di rilascio 627 Utilizzo dei codoni di stop per inserire amminoacidi inusuali 630 16.5 Post-traduzione 631 Il ripiegamento delle proteine nascenti 632 Rilascio dei ribosomi dall mrna 633 Riassunto 635 Per il ripasso 636 Per l approfondimento 636 CAPITOLO 17 Ribosomi e trna WEB PARTE 7 Replicazione, ricombinazione e trasposizione del DNA CAPITOLO 18 Meccanismi di base nella replicazione e nel riparo del DNA 18.1 Caratteristiche principali della replicazione del DNA 641 Replicazione semiconservativa 641 Replicazione semidiscontinua del DNA 644 Inneschi nella sintesi del DNA 647 Replicazione bidirezionale e unidirezionale 648 Replicazione a circolo rotante 651 18.2 Enzimologia della replicazione del DNA 652 Tre DNA polimerasi in E. coli 653 Fedeltà della replicazione 658 DNA polimerasi eucariotiche multiple 659 Separazione dei filamenti 660 Proteine che legano il DNA a singolo filamento 662 Topoisomerasi 663 18.3 Danni al DNA e riparo 669 Danni causati dall alchilazione delle basi 669 Danni causati dalle radiazioni ultraviolette 671 Danni causati da raggi gamma e raggi X 672 Riparo diretto del danno 672 Riparo per escissione 674
XII Indice generale Riparo delle rotture a doppio filamento di DNA negli eucarioti 682 Il ruolo del rimodellamento della cromatina nel riparo delle rotture a doppio filamento 684 Riparo da appaiamento errato 686 Fallimento del sistema di riparo degli errori da appaiamento errato nell uomo 687 Affrontare il danno al DNA senza ripararlo 688 Riassunto 692 Per il ripasso 694 Per l approfondimento 695 CAPITOLO 19 Meccanismo dettagliato della replicazione del DNA 19.1 Inizio 697 L inizio della replicazione del DNA in E. coli 697 L inizio negli eucarioti 700 19.2 Allungamento 705 L oloenzima pol III e la processività della replicazione 705 19.3 Terminazione della replicazione 713 Decatenanzione: separazione delle molecole figlie di DNA 714 Terminazione negli eucarioti 716 Box 19.1 I telomeri, il limite di Hayflick e il cancro 720 Riassunto 726 Per il ripasso 727 Per l approfondimento 728 CAPITOLO 20 La ricombinazione omologa 20.1 Il pathway di RecBCD per la ricombinazione omologa 730 20.2 Esperimenti a supporto del pathway di RecBCD 733 RecA 733 RecBCD 737 RuvA e RuvB 737 RuvC 741 20.3 Ricombinazione meiotica 744 Il meccanismo di ricombinazione meiotica: una visione d insieme 744 La rottura a doppio filamento del DNA 745 Formazione delle estremità a singolo filamento sulle DSB 748 20.4 La conversione genica 749 Riassunto 750 Per il ripasso 750 Per l approfondimento 751 CAPITOLO 21 La trasposizione PARTE 8 Genomi WEB CAPITOLO 22 Genomica, proteomica e bioinformatica 22.1 Il clonaggio posizionale: un introduzione alla genomica 755 Strumenti tipici del clonaggio posizionale 756 A caccia del gene mutato in una malattia umana 759 Box 22.1 Problemi nello screening genetico 764 22.2 Sequenziamento genomico 766 Il Progetto Genoma Umano 769 Vettori per progetti su genomi di grandi dimensioni 771 La strategia clone-per-clone 773 Sequenziamento shotgun 777 Gli standard nel sequenziamento 780 Sequenziamento del genoma umano 780 Genomi di altri vertebrati 790 Il genoma minimo 793 Il codice a barre della vita 795 22.3 Applicazioni della genomica 796 Trascrittomica 797 Mappatura trascrizionale di interi cromosomi 805 Profiling genomico funzionale 808 Profiling funzionale tessuto-specifico 811 Localizzazione di siti bersaglio per fattori di trascrizione 813 Polimorfismi di singoli nucleotidi: farmacogenomica 817 22.4 Proteomica 820 Separazione delle proteine 821 Analisi delle proteine 822 Interazioni tra proteine 823 22.5 Bioinformatica 828 Riassunto 834 Per il ripasso 836 Per l approfondimento 837 Indice analitico I1