I RECETTORI: Caratterizzazione e isolamento Andrea Ferrigno Funzione dei recettori di membrana Secrezione dell ormone nel sangue L ormone è trasportato attraverso il circolo sanguigno L ormone raggiunge le cellule target
Funzione dei recettori di membrana activated/ inhibited Caratteristiche dei recettori Interazione debole (reversibilità) Alta affinità Specificità del legame Specificità dell effetto
Approcci allo studio dei recettori Clonazione Studio del legame con il ligando (curve dose-effetto) Determinazione della struttura tridimensionale Individuazione (studi di binding) Purificazione Sviluppo di nuovi farmaci Studio del meccanismo d azione Sequenziamento Studio del legame recettore-ligando Obiettivi: Studio dell attività intrinseca Determinazione EC 50 (potenza) Determinazione K d (efficacia)
Tecniche per lo studio del legame recettore-ligando CAMPIONI: Sezioni di tessuto Cellule isolate Colture cellulari Membrane isolate Recettori isolati TECNICHE: Dialisi all equilibrio Scintillazione Spettroscopia in fluorescenza Citometria a flusso Microarray di proteine Tecniche in fluorescenza Spettroscopia in fluorescenza Citometria a flusso Microarray di proteine Ligando Marcatore fluorescente La fluorescenza vira da verde a rosso Recettore Recettore marcato Complesso ligando/recettore
Distribuzione e localizzazione dei recettori Studi sulla schizofrenia: autoradiografia di encefalo umano marcato con [3H]MDL: distribuzione e localizzazione dei recettori 5HT2A. Isolamento e purificazione di recettori Isolamento dell organo Omogenazione Trattamento con detergenti L organo elettrico della torpedine è ricco di recettori dell acetilcolina Il veleno dei cobra è ricco di a- bungarotossina, antagonista del recettore dell acetilcolina
Tecniche di purificazione: la cromatografia di affinità miscela di proteine contentente il recettore ligando covalentemente legato a sfere di polistirene recettore purificato Sequenziamento dei recettori proteici La degradazione di Edman in quattro passi: 1) PITC si lega all estremità N-terminale 2) Liberazione del derivato PITC/aminoacido (PTH) 3) Identificazione del PTH mediante HPLC 4) Si ripete dal punto 1) fino all idrolisi della proteina intera Sequenziatore automatizzato
Determinazione della struttura tridimensionale Dalla densità elettronica al modello atomico Sequenza aminoacidica + dati di diffrazione Modello atomico del recettore
Recettori ricombinanti: il perché Le tecniche classiche di isolamento dei recettori sono vincolate all esistenza di casi eccezionali. L organo elettrico della torpedine è ricco di recettori dell acetilcolina Il veleno dei cobra è ricco di a- bungarotossina, antagonista del recettore dell acetilcolina Recettori ricombinanti: il come 1) Estrazione di tutti gli mrna da cellule che esprimono anche il recettore di interesse 2) Gli mrna sono enzimaticamente convertiti in cdna e inseriti in plasmidi di espressione 3) I plasmidi di espressione sono trasfettati in cellule batteriche 4) Le cellule che contengono il DNA esprimono il recettore e lo espongono sulla membrana 5) Le cellule che esprimono il recettore sono distinte dalle altre grazie a un ligando selettivo, marcato con sostanze radioattive o fluorescenti
Plasmide contenente il cdna di una proteina irrilevante Recettori ricombinanti: riepilogo Plasmide contenente il cdna del recettore di interesse Le cellule che non contengono il cdna di interesse non esprimono il recettore e non sono ricunosciute dal ligando marcato Le cellule contenenti il cdna di interesse esprimono il recettore Il ligando marcato riconosce il recettore Le cellule di interesse sono rivelate mediante radioattività o flurescenza Approcci allo studio dei recettori Clonazione Studio del legame con il ligando (curve dose-effetto) Determinazione della struttura tridimensionale Individuazione (studi di binding) Purificazione Sviluppo di nuovi farmaci Studio del meccanismo d azione Sequenziamento