Tecniche per il nervo periferico
I nervi periferici sono strutture composite costituite da fibre nervose, vasi sanguigni e tessuto connettivo. All esame macroscopico appaiono come cordoncini biancastri a superficie esterna liscia.
COMPOSIZIONE DEL NERVO una guaina esterna formata da tessuto connettivo l epinevrio, composto da tessuto fibroso lasso e scarso tessuto adiposo nell ambito del quale si trovano i fascetti nervosi, arterie vene e vasi linfatici. Ogni singolo fascetto è a sua volta delimitato dal perinevrio, costituito da file concentriche di cellule perineurali appiattite separate da collagene. Lo spessore del perinevrio varia a seconda dello spessore del fascetto. Dal perinevrio di staccano sottili sepimenti connettivali che riempiono gli spazi compresi tra le singole fibre nervose costituendo l endonevrio.
In base alla presenza o meno di una guaina prodotta dalle cellule di Schwann le fibre nervose si dividono in: mielinizzate e non mielinizzate. Le fibre mielinizzate, nell uomo, hanno un diametro variabile tra 1μ e 20 μ, mentre quelle non mielinizzate sono sempre di un diametro inferiore e sono raccolte in gruppi di 8 15 circondate da una catena comune di cellule satelliti (cellule di Schwann o di Remark ). Ogni singolo assone mielinizzato è circondato dalla sua catena di cellule di Schwann e dalla guaina mielinica costituita dalle membrane plamatiche, giustapposte e compattate, delle cellule di Schwann.
La guaina mielinica si interrompe periodicamente in corrispondenza del nodo del Ranvier che rappresenta quindi un tratto di assone sprovvisto di guaina. Il tratto di fibra che è compreso tra due nodi di Ranvier è chiamato segmento internodale o internodo, la cui lunghezza è direttamente proporzionale al diametro dell assone. La lunghezza degli internodi si mantiene relativamente costante in una determinata fibra. La presenza di segmenti internodali eccessivamente corti è generalmente un segnale di un precedente danno alla cellula di Schwann. Anche lo spessore della guaina mielinica è proporzionale al diametro dell assone. La relazione tra il diametro dell assone d e quello della fibra D è espressa generalmente come valore d/d o g, è relativamente costante ed ha un valore di circa 0,7.
Le fibre dei nervi periferici possono anche essere distinte in: sensitive ( afferenti ) se conducono impulsi sensitivi dalla periferia al centro; motrici- somatiche (efferenti ) se conducono impulsi motori ai muscoli scheletrici; motrici viscerali ( efferenti ) se conducono impulsi motori alla muscolatura liscia o cardiaca; eccitosecretrici ( efferenti ) se innervano le ghiandole endocrine o esocrine
Le neuropatie periferiche si dividono in: mononeuropatie, un solo nervo è colpito o più nervi in modo asimmetrico polineuropatie in cui più nervi sono colpiti in modo bilaterale e simmetrico.
MONONEUROPATIE Tutti quei processi patologici capaci di indurre lesioni focali come traumi, compressioni, malattie vascolari infiammatorie o degenerative. POLINEUROPATIE possono essere genetiche oppure sostenute da cause diverse, le più frequenti sono quelle tossiche, metaboliche o infiammatorie.
Le biopsie nervose sono particolarmente informative anche nei casi in cui si sospetti una patologia infiammatoria come ad esempio casi di vasculite e polineuropatia demielinizzante infiammatoria cronica o anche nell amiloidosi. Le neuropatie demielinizzante sono facilmente diagnosticabili specie utilizzando le preparazioni a fibre singole. Le mononeuropatie le sezioni trasversali permettono di ben evidenziare la distribuzione focale delle lesioni.
Il coinvolgimento di differenti tipi di fibre è altamente informativo per alcune neuropatie genetiche. Ad esempio, la perdita prevalente di piccole fibre mielinizzate caratterizza le neuropatie ereditarie sensitive ed autonomiche ( tipo I, II, IV ), mentre le grandi fibre mielinizzate sono caratteristiche della malattia di Fiedreich. La biopsia è anche indicata quando si abbia una grave neuropatia periferica della quale non sia possibile ipotizzarne la genesi su base clinica.
Indicazioni La biopsia del nervo periferico è riconosciuta oggi come una valida procedura investigativa, ma, in considerazione che si tratta di un metodo invasivo che provoca nei pazienti delle piccole menomazioni, deve essere effettuata solo se veramente indicata e naturalmente con il consenso informato del paziente.
Il fine dell esame istopatologico del nervo è quello di identificare le alterazioni patognomoniche o caratteristiche per un determinato gruppo di patologie (amiloidosi disordini infiammatori, malattie demielinizzanti ). Inoltre l esame bioptico fornisce utili indicazioni sull andamento temporale della malattia (acuto, subacuto, cronico), sull entità della neuropatia e sull estensione della rigenerazione.
E opportuno ricordare che le fibre nervose possono facilmente subire alterazioni meccaniche e chimiche. Gli artefatti si possono verificare sia in fase di prelievo sia in quella di fissazione e possono essere talmente gravi da rendere la biopsia inutilizzabile ai fini diagnostici. Risulta quindi estremamente importante seguire un protocollo preciso per tre importanti fasi dell esame bioptico: Selezione del nervo periferico per la biopsia Tecnica di escissione da utilizzare Trattamento del campione
NERVI SENSITIVI Il nervo più frequentemente usato per scopi diagnostici è il nervo surale, contiene sia fibre sensitive che autonomiche. Per questo motivo esistono valori di controllo relativamente costanti che permettono di definire con sufficiente precisione il range di normalità. Altri nervi sensitivi che possono essere a volte utilizzati sono: il peroneo superficiale, il safeno, il radiale superficiale e l auricolare maggiore. Lo studio di questi nervi è riservato a casi speciali, ma il range di normalità è meno costante e i deficit residui dell intervento meno tollerati clinicamente.
NERVI MISTI SENSITIVI E MOTORI La porzione laterale del nervo peroneo profondo è stata occasionalmente usata per lo studio del sistema motorio. Vengono prelevati alcuni fascetti laterali a livello della caviglia che provocano un deficit funzionale del muscolo estensore breve delle dita. Questo nervo è piuttosto delicato e va incontro ad alterazioni fisiologiche precoci che lo rendono poco indicato per la biopsia.
BIOPSIA COMBINATA NERVO E MUSCOLO La biopsia contemporanea del nervo e del muscolo può essere utile nello studio di lesioni focali, come le vasculiti. Può essere ottenuta con una sola incisione per quanto riguarda il nervo peroneo e il muscolo peroneo breve, il nervo surale nel polpaccio e il muscolo gastrocnemio.
Generalmente un chirurgo esperto riesce a prelevare un segmento di nervo della lunghezza di circa tre centimetri con il minimo trauma. Il campione, una volta escisso, viene inviato immediatamente al laboratorio di istopatologia, per evitare danni al tessuto, è opportuno che il nervo venga avvolto in una garza imbevuta in soluzione fisiologica a bassa temperatura ( è sufficiente del ghiaccio attorno al contenitore ). Nel laboratorio di istopatologia se il nervo è sufficientemente lungo ( più di tre centimetri ) viene diviso in due o tre porzioni.
E indispensabile per ogni biopsia avere a disposizione preparati: fissati in formalina e inclusi in paraffina fissati in gluteraldeide che possono essere processati per la microscopia elettronica e per le preparazioni a fibre singole. congelare un frammento che può essere conservato in azoto liquido per essere poi utilizzato per studi di tipo immunoistochimico, biochimico e di biologia molecolare.
TRATTAMENTO DEL CAMPIONE La prima tappa fondamentale per ottenere buoni risultati finali è la fissazione, questa può indurre una certa retrazione del nervo e quindi causare degli artefatti. Ciò si può evitare se, appena giunto in laboratorio, il nervo viene orientato longitudinalmente e posto su di un supporto al quale viene tenuto aderente. In alternativa si possono applicare dei piccoli pesi all estremità distale del nervo mentre l estremità prossimale viene ancorata ad un tappo di sughero che viene messo a galleggiare in un contenitore con il liquido fissativo.
Buoni risultati si ottengono facendo aderire su di un supporto costituito da un piccolo rettangolo ricavato da una mattonella di sughero le porzioni di nervo prelevate l nervo in pochi minuti aderisce bene al supporto e può essere messo a fissare nei contenitori con formalina tamponata al 4% e in gluteraldeide facendo naturalmente attenzione che la superficie del sughero con adeso il nervo sia rivolta verso il basso. La gluteraldeide viene usata ad una concentrazione del 2,5% diluita in tampone di Sorensen PH 7,4 ed il nervo viene lasciato fissare per circa 24 ore a temperatura ambiente. Successivamente il campione viene posto in tampone di Sorensen e conservato in frigorifero a 4 C in attesa dei trattamenti successivi
Post-fissazione La porzione di nervo fissata in gluteraldeide e orientata allo studio per la Microscopia Elettronica e per la preparazione a fibre singole viene ulteriormente divisa. Due piccole porzioni agli estremi del nervo vengono sezionate trasversalmente ( il taglio deve essere preciso e perpendicolare all asse del nervo ) e saranno indirizzate alla processazione per l inclusione in resina, la porzione centrale viene liberata di parte dell epinevrio con l utilizzo di pinzette a punta fine e di uno stereo microscopio, in questo modo si ottengono gruppi di fibre nervose grossolanamente separate.
La post-fissazione in osmio è importante in quanto ottimo fissatore dei lipidi, rende più stabili le strutture del nervo per i trattamenti successivi, inoltre la colorazione nera che da ai preparati rende più visibili le fibre per la preparazione delle fibre singole e costituisce un primo lieve contrasto alle sezioni per l osservazione al microscopio elettronico
TAMPONE DI SORENSEN E costituito da due soluzioni madri: Soluzione A Na 2 HPO 4 anidro 9.47 gr H 2 O distillata fino a 1000 cc. Soluzione B KH 2 PO 4 anidro 9.08 gr. H 2 O distillata fino a 1000 cc. Per 100 ml di tampone a ph 7,4 occorrono: 80.4 ml di sol A 19,6 ml di sol B
Inclusione in resina Processazione: metodo di routine % Tempo Alcool 50% 15 Alcool 70% 15 Alcool 80% 15 Alcool 95% 15 Alcool 95% 15 Alcool assoluto 15 Alcool assoluto 15 Ossido di propilene 15 Ossido di propilene 15
Inclusione Ossido di propilene + resina epossidica 1:1 60 a T ambiente. Resina assoluta overnight a 4 C, il contenitore deve essere aperto coperto da una garza.
Il giorno seguente, dopo ulteriore passaggio in resina pulita, il campione viene incluso in apposite celle in gomma. Porre massima attenzione nell orientamento del nervo che deve consentire un taglio perfettamente perpendicolare all asse, per questo può essere consigliabile avere dei piccoli frammenti di resina polimerizzata da inserire come supporto al nervo. Per facilitare l orientamento dell inclusione, non sempre agevole a causa della resina che uniforma le superfici del nervo, può essere utile usare lo strereomicroscopio. La polimerizzazione avviene in termostato: 60 C 16 20 ore.
Un metodo alternativo di disidratazione e inclusione è quello più rapido che utilizza come agente disidratante l acetone: 5 passaggi da 5 ciascuno con acetone al 60% a T ambiente (60 cc. acetone + 40 cc acqua distillata) 5 passaggi da 5 ciascuno con acetone assoluto a T ambiente 2 passaggi da 15 con acetone assoluto + resina 1: 1 a 60 C 2 passaggi da 15 con acetone assoluto + resina 1: 3 a 60 C 1 passaggio da 20 con resina pura a 60 La polimerizzazione avviene in termostato: 60 C 16 20 ore. L inclusione avviene nelle apposite celle in gomma
RESINA EPOSSIDICA La quantità minima di resina che è consigliabile preparare è di 50 cc, la vischiosità dei costituenti potrebbe comportare errori eccessivi nella misurazione con risultati non costanti sulla consistenza finale. Per 50 cc occorrono: 30 cc di DDSA (induritore) (dodecenil succinic anhydride ) 10 cc di EPON 812 10 cc di ARALDITE CY 212 epossidi 1 cc didmp30 (catalizzatore) Tri( dimethylaminomethy)phenol
Dalle inclusioni così ottenute si tagliano con l ausilio dell ultramicrotomo, (LEICA ULTRACUT UCT rotativo ad avanzamento meccanico). Prima del taglio le inclusioni devono essere sottoposte a sgrosso e alla squadratura a piramide trapezoidale.
La forma a trapezio consente un facile orientamento delle sezioni in particolare per l eventuale successiva riduzione per il taglio delle sezioni fini.
Dalle inclusioni così ottenute si tagliano con l ausilio dell ultramicrotomo, (LEICA ULTRACUT UCT rotativo ad avanzamento meccanico). Le lame utilizzate sono di vetro ottenute dal taglio di una barra di vetro alle quali si applica una vaschetta per la raccolta delle sezioni. Le sezioni semifini hanno uno spessore di 0,5 1 μ. Raccolte su di un vetrino portaoggetti le sezioni devono essere asciugate. Un metodo valido per ottenere sezioni senza pieghe, è quello di far asciugare le sezioni in una capsula di Petri con all interno un batuffolo di cotone imbevuto di benzene e posta in termostato a 60 C (sotto cappa aspirata).
Blu di Toluidina su sezioni semifini Soluzione colorante 1 gr di BORACE ( Sodio Tetraborato ) sciolto in 100cc di H 2 O distillata, sull agitatore magnetico scaldando la soluzione si aggiunge 1 gr di BLU DI TOLUIDINA far sciogliere bene. La soluzione è pronta per l uso dopo qualche giorno. Il colorante si versa dopo filtrazione sulle sezioni semifini poste su di una piastra calda per 2-5 minuti. Il calore è importante in quanto la resina essendo fondamentalmente idrofoba impedirebbe le penetrazione del colorante acquoso.
Blu di Toluidina su sezioni semifini
Sezione trasversale di fascetto nervoso fissato in formalina e incluso in paraffina. Colorazione Ematosillina Eosina. E riconoscibile l epinevrio formato da tessuto connettivo lasso con voluminose diramazioni vascolari ed il perinevrio che circonda i singoli fascetti.
In alcuni casi selezionati è opportuno procedere all allestimento di sezioni ultrafini per l osservazione ultrastrutturale che consente di ottenere informazioni dettagliate, ad esempio sulla struttura della mielina o sulla presenza di inclusioni e alterazioni tipiche delle malattie metaboliche.
Il taglio avviene sempre con l utramicrotomo dopo aver selezionato e ridotto la piramide. Si utilizza una lama di diamante. Lo spessore delle sezioni fini varia da 500 a 700 A 50 70 nmt (nanometri )
COLORAZIONE DI SEZIONI ULTRAFINI Le sezioni ultrafini vengono raccolte sul lato opaco di griglie di rame da 150 200 mesh. L indice di misura mesh indica il numero di maglie della griglia. Le griglie con le sezioni vengono poi colorate o meglio contrastate con: ACETATO DI URANILE ( soluzione sovrasatura in alcool etilico 95 ) per 40 Risciacquo in alcool 95 CITRATO DI PIOMBO ( 0,1 gr di citrato di piombo in 4 ml di NaOH 1N portato a 40ml con H 2 O bidistillata ) per 10 Risciacquo in H 2 O bidistillata
PREPARAZIONE PER FIBRE SINGOLE Dopo la post- fissazione in tetrossido di osmio ed i successivi lavaggi ( Sorensen), i segmenti di nervo vengono trasferiti in una soluzione composta da tampone di Sorensen e glicerolo nella proporzione di 1:1 per 24 ore alla temperatura di 4 C successivamente vengono posti in glicerolo puro. Il glicerolo agevola lo scorrimento delle fibre nervose e ne facilita la manipolazione. La tecnica della preparazione a fibre singole richiede molto tempo, lavorando con pinzette a punta sottile osservando attraverso uno stereomicroscopio, l operatore elimina l epinevrio e il perinevrio.
PREPARAZIONE PER FIBRE SINGOLE Si procede successivamente alla separazione delle singole fibre o di gruppi di due o tre fibre da ciascuno dei fascetti ottenuti. Quando si sono ottenute fibre singole queste vengono trasferite sudi un vetrino portaoggetto accostando fibre provenienti da fascetti diversi per garantire un campionamento randomizzato. Vengono poi montate in balsamo.
Preparazione a fibre singole. E visibile la degenerazione assonale, per confronto, la fibra in alto è normale ed è visibile un nodo del Ranvier.
Colorazione immunoistochimica con anticorpo HAM 56 su sezione longitudinale. Il nervo è sede di degenerazione assonale l anticorpo contorna le camere di digestione della mielina nel citoplasma dei macrofagi.