cardiomiocita linfocita

REGOLAZIONE GENICA

cardiomiocita adipocita linfocita neurone

Tbx1K14cKO embryos have small incisors, abnormal molar cusping with defective ameloblast differentiation and amelogenin expression.

Tbx1 over-expression increases amelogenin, enamel formation and a delay in formation of the third molar.

Cellula indifferenziata / pluripotente Cellule differenziate / specializzate? RIPROGRAMMAZIONE

John Gurdon, 1962

Shinya Yamanaka, 2006

Controllo dell espressione dei geni I diversi tipi cellulari di un organismo contengono lo stesso DNA. Ciascuna cellula ha la potenzialita di esprimere qualsiasi gene Espressione genica e selettiva e altamente regolata Una cellula puo cambiare l espressione dei suoi geni in risposta a segnali interni e esterni Esistono diversi livelli di controllo nella via DNA à RNA à proteine

FPKM (livello di espressione) Espressione genica nella linea cellulare P19Cl6 Geni Liv. estremi: 0.003 (Mier2) 4890 (Rplp1), range dinamico 1.6x10-6

Quali geni trascrivere e quando? In cellule diverse, o nella stessa cellula ma in tempi diversi, sono trascritti diversi gruppi di geni Geni espressi in tutte le cellule (housekeeping genes) Molti geni sono regolati spazialmente (tessuto-specifici) e/o temporalmente Trascrittoma: l insieme dei geni espressi in una particolare cellula. Il trascrittoma determina l identita della cellula, la sua capacita di rispondere a segnali extracellulari (proliferare, differenziare, morire)

Livelli di controllo dell espressione genica

Regolazione della trascrizione Procarioti Eucarioti

La regolazione dei geni George Beadle e Edward Tatum 1941; i geni codificano per enzimi coinvolti nei processi metabolici; 1 gene à 1 enzima à 1 step Francois Jacob e Jacque Monod 1959: il concetto di geni regolatori che codificano per proteine che regolano altri geni Monod: perchè l enzima β-galattosidasi è prodotto in cellule batteriche solo quando I batteri ne hanno bisogno?

Il modello dell operone di Jacob e Monod: regolazione da controllo negativo Il repressore si lega anche ad un induttore (metabolita) che fa abbassare l affinita del repressore per l operatore à geni A e B espressi

Meccanismi di attivazione Attivazione per reclutamento della RNA pol II: operone trp; operone lac Attivazione allosterica: Attivatore NtrC, che controlla a distanza l espressione di geni coinvolti nel metabolismo dell azoto

Meccanismo: attivazione per mezzo del reclutamento della RNA polimerasi Molti promotori sono regolati da attivatori che favoriscono il legame della RNA polimerasi e/o da repressori che bloccano tale legame

1) l operone trp di E. coli Operone: Gruppo di geni che sono trascritti insieme da un singolo promotore sito di legame del repressore di triptofano L operone trp e regolato dalla presenza dell amminoacido triptofano nel mezzo

triptofano assente triptofano presente

Repressore trp inattivo Repressore trp attivo α-eliche di riconoscimento L attacco di 2 mol di trp al repressore cambia la conformazione della proteina che lo rende capace di legarsi al DNA (operatore)

Legame al DNA di una proteina regolatrice batterica con il dominio elica-giro-elica l elica di riconoscimento sito di legame Regolatore batterico tipico -lega come omodimero ad una sequenza ripetuta e invertita -ogni monomero lega un emi sito -il legame e mediato da un dominio elica-giro-elica

2) l operone lac di E. coli Il promotore lac dirige la trascrizione dei gene lac in un unico mrna policistronico che comprende piu di un gene. L mrna viene tradotto in 3 proteine diverse coinvolte nel metabolismo di glucosio L espressione dei geni lac e regolato da un attivatore e un repressore che lavorano insieme (duplice controllo)

sito di legame dell attivatore CAP (Catabolite Activator Protein) sito di legame del repressore Lac due subunita del repressore Lac si legano all operatore (allolattosio inibisce la capacità del repressore di legare il DNA)

RNA polimerasi II dimeri di CAP αctd Il regolatore CAP ha domini distinti per l attivazione della RNA pol. e il legame al DNA Complesso CAP-αCTD-DNA

Attivatore CAP (CRP, cyclic AMP Receptor Protein) camp e sintetizzata da ATP dall enzima adenilico ciclasi camp e una piccola molecola importante per la trasduzione di segnali intracellulari Nei batteri, i livelli di camp sono regolati dai nutrienti nel mezzo di coltura ( glucosio -- camp) camp (ligando)

I geni La fonte di energia preferite da E.coli e glucosio. Nell assenza di glucosio il batterio puo usare lattosio lacy codifica per la permeasi del lattosio che trasporta il lattosio nella cellula lacz codifica per l enzima β-galattosidasi che scinde il lattosio in galattosio e glucosio laca codifica per una transacetilasi che libera la cellula di alcuni prodotti metabolici tossici (tiogalattosidi)

Il duplice controllo dell operone lac Integrazione di due segnali metabolici, lacy, laca Proteine regolative: L attivatore CAP lega il DNA e attiva la trascrizione dei geni lac solo in assenza di glucosio Il repressore Lac lega il DNA e reprime la trascrizione dei geni lac solo in assenza del lattosio

CAP/cAMP rep Lac AND Attivazione Trascrizionale

Meccanismi di attivazione Attivazione per reclutamento della RNA pol II: operone trp; operone lac Attivazione allosterica: Attivatore NtrC, che controlla a distanza l espressione di geni coinvolti nel metabolismo dell azoto

Attivazione allosterica: regola passaggi successivi al legame della RNA polimerasi complesso RNA pol/dna chiuso complesso aperto Gli attivatori che funzionano allostericamente inducono un cambiamento conformazionale o nella RNA pol. o nel DNA

Attivazione allosterica mediata dall attivatore NtrC Azoto basso NtrC P NtrC NtrB (chinasi) NtrC ha domini distinti per il legame al DNA e l attivazione della RNA pol. e lega il DNA solo in presenza di uno specifico segnale metabolico (bassi livelli di azoto) +ATP RNA polimerasi nel complesso aperto La fosforilazione di NtrC espone il dominio di legame al DNA che permette di legarsi al DNA ~150 bp a monte del promotore

Regolazione della trascrizione Procarioti Eucarioti

Controllo trascrizionale Mediato da: 1) Elementi genetici: - Promotore; Fattori Generali di Trascrizione (FGT); Hub per assemblaggio del macchinario di trascrizione - enhancers/ suppressors; proteine regolatrici specifiche (fattori di trascrizione) - Isolatori (Insulators) 2) Modificazioni cromatiniche - modificazione della code istoniche - complessi di rimodellamento della cromatina 3) Modificazioni del DNA e l espressione genica 10% dei circa 30,000 geni umani codifica proteine regolatrici

I fattori generali di trascrizione assemblaggio sequenziale di FGT che porta la RNA pol al promotore à complesso di pre-inizio complesso di pre-inizio TFIIH induce il passaggio dal complesso chiuso al complesso aperto à promoter escape à fase di allungamento e rilascio dei FGT

Elementi genetici: - Promotore/Fattori Generali di Trascrizione - sequenze regolatrici (enhancers, suppressors)/proteine regolatrici specifiche (fattori di trascrizione) Enhancer: una regione del DNA che contiene siti di legame per una o piu proteine regolatrici Non ha ne posizione ne orientamento specifico rispetto al gene che regola Puo regolare la trascrizione in modo tessuto-specifico. L enhancer e presente in tutte le cellule ma se la proteine regolatrice e solo presente nel fegato à il gene che viene regolato sara trascritto solo nel fegato.

Suppressor: regione del DNA che contiene siti di legame per proteine regolatrici che sopprimono la trascrizione. PUO COINCIDERE CON UN UNHANCER competizione attivatore repressore mascheramento Interazione con FGT

Elementi genetici: - enhancers/suppressors; proteine regolatrici specifiche (fattori di trascrizione) aiutano i FGT e la RNA pol. ad iniziare e/o sostenere la trascrizione La RNA polimerasi oloenzima può essere reclutata al promotore da proteine attivatrici

Le proteine regolatrici eucariotiche possono legare a siti di DNA a monte o/e a valle del promotore I promotori dei geni eucariotici possono essere regolati a distanza e da sequenze regolatrici multiple

ISOLATORE CTCF

In che modo le proteine regolatrici riconoscono il sito di legame sul DNA?

Le proteine regolatrici riconoscono sequenze specifiche nella doppia elica intatta

Il bordo di ciascuna coppia di basi presenta uno schema caratteristico di donatori e accettori di idrogeno e di zone idrofobiche riconoscibili dalle proteine regolatrici Potenziali Don. Legami H Potenziali Acc. Legami H Regioni idrofobiche (CH 3 ) Atomo di idrogeno Le quattro possibili configurazioni di coppie di basi

Il codice di riconoscimento sul DNA

Interazioni proteina-dna nella scanalatura maggiore

Le proteine regolatrici degli eucarioti usano diversi domini per il legame al DNA

I tipi di domini che legano il DNA sono di numero limitato Elica-giro-elica Omeodominio Dita di zinco Cerniera di leucine Elica-ansa-elica T-box I domini generalmente usano α eliche o foglietti β per legarsi alla scanalatura maggiore

elica N-terminale (elica C-terminale) Elica-giro-elica Il piu semplice e piu comune motivo, presente nei batteri (fattore σ, repressore Trp, attivatore CAP) e negli eucarioti

elica di riconoscimento Omeodominio (variante di elica-giro-elica)

sequenza amminoacidica α-elica (12-25) Foglietto β antiparallelo (1-10) proteina con 3 dita di zinco, le α-eliche legano il DNA in solchi maggiori adiacenti aumentendo la forza e la specifita delle interazioni DNAproteina atomi di zinco Dita di zinco (zinc finger)

Cerniera di leucine (leucine zipper) α eliche a omodimero

Fascio di 4 α eliche che legano il DNA come omo- o eterodimero Elica-ansa-elica (helix-loop-helix) Eterodimerizzazione: esempio di controllo combinatoriale, in cui proteine diverse regolano un processo cellulare. Uno dei meccanismi usati dalle cellule eucariotiche per regolare l espressione genica

Le proteine regolatrici sono modulari

Sequenza di legame 5 3 FT 3 5 Frammentazione Immunoprecipitazione Ab Sequenziamento del DNA

Le proteine regolatrici si legano a sequenza specifiche del DNA BINDING MOTIF

Mappatura dei siti di legame sul genoma e identificazione dei geni regolati

Circuiti genici modelli di regolazione complessa Vegfr2 Vegfr3 Tbx20 Fgf8 Isl1 Gata4 Cyp26 Nkx2.5 Wnt5a Foxh1 Shh Mef2c Wnt RA signaling Gbx2 Pax9 Fgf8 Myst3 Foxc1/2 Tbx1 Chd7 Fgf10 Hes1 Smad7 p21 SRF BMP-Smad1 Congenital Heart Disease genes

Controllo trascrizionale Mediato da: 1) Elementi genetici: - Promotore; Fattori Generali di Trascrizione (FGT); Hub per assemblaggio del macchinario di trascrizione - enhancers/ suppressors; proteine regolatrici specifiche (fattori di trascrizione) - Isolatori (Insulators) 2) Modificazioni cromatiniche - modificazione della code istoniche - complessi di rimodellamento della cromatina 3) Modificazioni del DNA

Regolazione della chromatina I nucleosomi controllano l accessibilita del DNA alle proteine regolatrici e trascrizionali Riorganizzazione dei nucleosomi struttura cromatinica aperta : attivazione trascrizionale; struttura chiusa : repressione trascrizionale. Lo stato cromatinico e regolato da due classi di fattori: modificatori degli istoni complessi di rimodellamento della cromatina (CRC)

Stato cromatinico di base Mod. istoni Rimodellamento fattore di trascriz. (FT) specifico pioniere interagisce con DNA Modifica stato cromatinico Reclutamento di altri FT RNA Pol. II, Trascrizione

L organizzazione strutturale degli istoni del core regione variabile regione conservata α-eliche

Istone-acetiltransferasi (HAT) Coattivatori nucleari, formano complessi multiproteici. Esistono 5 diverse famiglie di proteine HAT. Interagiscono con fattori di trascrizione, i quali reclutano le HAT su siti specifici. In qualche caso, un dominio HAT è parte di un fattore di trascrizione. Acetilazione istonica riduce affinità istoni-dna e rappresenta un punto di interazione con altri fattori di trascrizione.

Modificazione covalenti delle code N-terminali

Lo stato di acetilazione degli istoni è reversibile Acetilazione HAT HDAC De-acetilazione

Istone-deacetilasi (HDAC) HDAC, catalizzano la deacetilazione degli istoni à reprimono la trascrizione Formano complessi multiproteici (Sir2, NuRD, Sin3), comprendenti i complessi di rimodellamento della cromatina; NuRD e Sin3 contengono proteine in grado di legare il DNA metilato

Metilazione H3 (operata da metiltrasferasi istoniche) H3K4me1 (struttura permissiva, enhancers in funzione) H3K4me2 H3K4me3 (attiva) H3K27me3 (sopprime) La metilazione istonica è letta da proteine cromodominio che legano gruppi metilici (per es CHD7, PRC1).

Lo stato di metilazione degli istoni è reversibile Metilato Metiltrasferasi ist. De-metilasi ist. Non-metilato

CONVERSIONE METILAZIONE-ACETILAZIONE Feng Tie et al. Development 2009;136:3131-3141

Complessi di rimodellamento della cromatina Grossi complessi multiproteici che utilizzano energia da idrolisi di ATP per: Mobilizzare Disassemblare Modificare i nucleosomi I cambiamenti sono reversibili / temporanei Cambiano l accessibilita del DNA alle proteine regolatrici Trascrizione, Replicazione, Riparo Sono reclutati (da fattori di trascrizione) in regioni specifiche dove agiscono localmente

SWI-SNF: Rimodellamento attivatore SWI-SNF 1. promuove la mobilita del nucleosoma à espone TATA à assembla complesso di pre-inizio. 2. SWR1 facilita la sostituizione di un istone del core con una variante 3. FACT disassembla l ottamero istonico.

The SWI-SNF-like BAF complex

Posizione dei nucleosomi e accessibilità La posizione del nucleosoma non e alterata

(attivatore trascrizionale) (HAT) Possibile catena di eventi in seguito a interazione con attivatore trascrizionale (recettore glucocorticoidi) (1) TF lega il DNA e recluta il coattivatore CBP /HAT à acetilazione degli istoni locali (2) che crea sito di legame per un CRC (3) apre la cromatina del promotore (4) RNA pol si lega al promotore (5)

Gli attivatori di trascrizione, i complessi di rimodellamento della cromatina e le HAT cooperano per attivare la trascrizione

Polycomb: rimodellamento repressivo PRC2 > EZH2 -> H3K27me3 PRC1 In cellule staminali, polycomb sopprime geni che inducono il differenziamento

I repressori, i complessi di rimodellamento della cromatina e gli HDAC cooperano per reprimere la trascrizione di un gene

I telomeri

Modello di gene silencing al livello del telomero Proteine che legano il DNA telomerico reclutano Sir2 che si diffonde lungo il cromosoma modificando le code N-terminale degli istoni adiacenti H4 Sir2 (istone deacetilasi) riconosce le code istoniche ipoacetilate H4 Schemi specifici di modificazione istoniche permettono ai nucleosomi di compattarsi in schiere strette e poco accessibili

Organizzazione dei cromosomi all interno del nucleo

Eucromatina Modello dello scaffold proteico Le anse delle fibre di 300 nm sono ancorate alla matrice nucleare attraverso regioni ricche in AT (MAR, regioni associate alla matrice nucleare) Eterocromatina

Matrice nucleare Rete fitta di proteine filamentose e fibrille di RNA. Serve da organizzatore strutturale all interno del nucleo. L interazione tra le MAR e matrice organizza la cromatina in domini e mantiene i territori cromosomici.

Territori cromosomici: cromosomi umani 2 e 9 In-situ hybridization with whole chromosome painting probes for human Chr. 2 and 9

metafase umana dopo ibridazione con sonde specifiche per tutti i 24 cromosomi

Transcription factories

Assemblaggio di un nodo trascrizionale

Controllo trascrizionale Mediato da: 1) Elementi genetici: - Promotore; Fattori Generali di Trascrizione (FGT); Hub per assemblaggio del macchinario di trascrizione - enhancers/ suppressors; proteine regolatrici specifiche (fattori di trascrizione) - Isolatori (Insulators) 2) Modificazioni cromatiniche - modificazione della code istoniche - complessi di rimodellamento della cromatina 3) Modificazioni del DNA

Metilazione del DNA Citosina del sito CpG viene metilata da DNA metiltrasferasi à 5 metilcitosina Genoma dei mammiferi; ~75% delle citosine dei siti CpG sono metilate Metilazione dei siti CpG tende ad impedire l attivazione del promotore Isole CpG, 1-2 kb nel DNA ricco di doppiette CpG, normalmente non metilate (nei geni espressi) e localizzate nella regione 5 del gene

5 metil citosina

Metilazione del DNA e repressione trascrizionale La repressione e mediata da proteine che legano CpG metilati, es. MeCP2 MeCP2 recluta complessi contenenti HDAC e metiltrasferasi istoniche La perdita di gruppi acetile e l aggiunta di gruppi metile portano all inattivazione della cromatina e al silenziamento genico DNA metiltrasferasi Reclutamento di corepressori con attivita istone metiltrasferasi

Riassunto: regolazione trascrizionale I promotori dei geni eucariotici possono essere regolati a distanza Le sequenze regolatrici (enhancers) possono essere a monte e/o a valle del promotore. Sono riconosciute da fattori di trascrizione specifici (prot. regolatrici). Le proteine regolatrici lavorano insieme con la RNA pol II e i fattori generali di trascrizione per iniziare la trascrizione. La conformazione cromatinica è fondamentale per la regolazione genica. Le proteine regolatrici modulano l espressione genica di un organismo in modo tempo- e/o tissuto-specifico.

Controllo dell espressione genica: meccanismi post-trascrizionali

Controlli post-trascrizionali Dello splicing Dell inizio della traduzione Della degradazione selettiva di alcuni mrna

Splicing alternativo Le proteine regolatrici interagiscono con gli snrnp nella selezione del sito di splicing

Controllo traduzionale negativo DI FERRO Esempio: L attacco del repressore aconitasi all mrna che codifica la ferritina à diminuisce la traduzione dell mrna Ferritina: proteina che promuove la deposizione del ferro intracellulare Aconitasi: sensibile al ferro ECCESSO

Degradazione selettiva dell mrna in risposta a segnali extracellulari PRIVAZIONE Recettore della trasferrina: proteina coinvolta nell importo di ferro attraverso la membrana plasmatica Aconitasi: sensibile al ferro importazione di ferro FERRO IN

Come possono rispondere in modo opposto le due proteine (ferritina, trasferrina) quando sono regolati entrambi dalla stessa proteina regolatrice (aconitasi)? L aconitasi lega alla UTR 5 dell mrna della ferritina e blocca l inizio della traduzione Il legame alla UTR 3 dell mrna del rec. della trasferrina blocca un sito di taglio endonucleasico e stabilizza cosi l mrna (evita la degradazione) Aconitasi regola proteine diverse che agiscono nella stessa via metabolica

Altri esempi di regolazione post-trascrizionale

Degradazione proteica mediata da ubiquitina"

PICCOLI RNA e REGOLAZIONE GENICA

RISC / ARGONAUTA