Produzione di proteine terapeu.che

Produzione di proteine terapeu.che

Proteine di interesse terapeu.co Proteine come farmaci (es. insulina, an.corpi, ormoni, an.coagulan., fa:ori della coagulazione) Proteine come an.geni per la produzione di vaccini (es. HBsAg) La produzione industriale di proteine terapeu.che richiede l uso della tecnologia del DNA ricombinante per o:enere le elevate quan.tà di proteina necessarie

Biosintesi dell insulina nelle cellule β del pancreas Catena A Catena B 21 aa 30 aa Unite da due pon. S- S ESONE 1 ESONE 2 PREPROINSULINA Pep.de segnale PROINSULINA C B A INSULINA Nell apparato di Golgi un enzima rimuove 33 aa che cos.tuiscono il pep.de C

L insulina forma esameri stabilizza. dallo zinco

PRODUZIONE DI INSULINA RICOMBINANTE IN BATTERI - Plasmidi separa. codificano per la catena A e B in ceppi di E. coli separa. - Le catene A e B sono prodo:e so:o il controllo del promotore lac come proteine di fusione con la regione N- terminale di LacZ - Le sequenze LacZ sono eliminate con tra:amento con bromuro di cianogeno (scinde legami Met- X) - Le catene A e B sono mescolate assieme e tramite un processo chimico in condizioni ossidan. si formano i pon. S- S e viene purificata la forma na.va

Produzione di insulina ricombinante nel lievito Saccharomyces cerevisiae (via della proinsulina) Pro- insulina cos.tuita da catena B1-29 (mancante di Thr30) e catena A1-21 fusa al pep.de segnale dell α- factor per produrre insulina secreta.

Espressione cos.tu.va so:o il controllo del promotore TPI (trioso- fosfato isomerasi), selezione mediante complementazione con il gene della TPI di S. pombe in un ceppo di S. cerevisiae tpi::leu2

Valutazione dell efficienza della sequenza del pro- pep.de e della sequenza spacer nella produzione di insulina ricombinante nel lievito

Schema del processo industriale di produzione dell insulina ricombinante mediante la via della proinsulina.

Analoghi dell insulina approva. per l uso come farmaci

Proprietà farmacocine.che degli analoghi dell insulina

Eritropoie.na L eritropoie.na (EPO) è un ormone che s.mola la produzione di globuli rossi. E una glicoproteina di 165 aa con 4 catene di carboidra. (3 N- e 1 O- glicosilazione). La N- glicosilazione è necessaria per la secrezione e la stabilità dell EPO nel plasma. La O- glicosilazione non sembra avere influenza sull acvità biologica dell EPO. EPO ricombinante prodo:a in CHO e in lievito

Produzione di eritropoietina umana in Pichia pastoris Espressione sotto il controllo del promotore AOX1, segnale di secrezione α-factor, induzione per 40 ore, resa 50 mg/l (12-13 copie del vettore integrate nel genoma)

Harvested Fermentation Broth Centrifugation Produzione di eritropoietina umana in Pichia pastoris Microfiltration Ultrafiltration #1 Blue-dye Chromatography Hydroxyapatite Chromatography * Cation Exchange Chromatography #1 Ultrafiltration #2 PEGylation Cation Exchange Chromatography #2 Ultrafiltration #3 Sterile Filtration Final Product *This step was only applied at scales larger than 40 liters

Stru:ura degli an.corpi In base al.po di catena pesante: IgG, IgE, IgD monomeriche IgA dimeriche IgM pentameriche Pon. disolfuro Glicosilazione

Risposta immunitaria e organizzazione genica delle IgG

An.corpi monoclonali Linee cellulari stabilizzate - linfoci. + cellule di mieloma HGPRT - in presenza di un agente di fusione - crescita su terreno selecvo HAT (ipoxan.na, aminopterina,.mina) - L aminopterina è un an.bio.co che inibisce la sintesi de novo degli acidi nucleici. Ipoxan.na e.mina perme:ono di sopravvivere a cellule HGPRT +, che possono usare le vie di recupero HGPRT è un enzima della via di recupero delle purine.

Produzione di an.corpi nel lievito Pichia pastoris Ceppo ingegnerizzato per produrre oligosaccaridi del.po Man 5 GlcNAc 2 Espressione so:o il controllo del promotore AOX1 Resa 1.26 g/l dopo 146 ore di coltura con biomassa circa 400 g/l peso fresco di cellule (8.6 mg/l/ora)

U.lizzo di an.corpi in terapia Campi di applicazione clinica Malace cardiovascolari Malace infiammatorie e autoimmuni Immunosoppressione Neoplasie ematologiche ed epiteliali Uso in terapia an.cancro: proprietà dell an.gene bersaglio Espressione stabile e omogenea nelle cellule tumorali, trascurabile in cellule sane Elevata densità di espressione Mancanza di forme circolan. Capacità di acvare i processi di morte cellulare

An.corpi: come uccidono le cellule tumorali Azione dire*a Citotossicità complemento- mediata quando proteine del complemento legano la Fc dell an.corpo che si è legato alla cellula bersaglio, la cellula va incontro a lisi Citotossicità cellulare an6corpo- dipendente la Fc dell an.corpo legato alla cellula bersaglio è riconosciuta da suoi rece:ori su cellule effe:rici ed avviene lisi cellulo- mediata o fagocitosi della cellula tumorale Apoptosi Agisce in questo modo Rituximab Azione indire*a Inibizione della crescita Alterazioni del ciclo cellulare La trasduzione del segnale è inibita perché l an.corpo si lega al rece:ore per un fa:ore di crescita sulla cellula tumorale in modo da bloccare il legame del ligando endogeno portando all inibizione della fosforilazione di rece:ori.rosin- chinasici e di even. di segnalazione a valle della cascata regola.va. Sfru:ano ques. meccanismi Trastuzumab e Bevacizumab

An6corpi chimerici (80% umani): i domini costan. della molecola murina sono sta. sos.tui. con le loro rispecve contropar. umane prendendo le sequenze geniche della catena leggera k e della catena pesante delle IgG1, le Ig più efficien. ad acvare il complemento e la citotossicità delle cellule effe:rici An6corpi umanizza6 (95% umani): le CDR murine sono state inserite in an.corpi umani Murino Chimerico Umanizzato

Rituximab An.corpo chimerico dire:o dire:o contro CD20. E stato il primo an.corpo monoclonale ad avere successo nella terapia per il linfoma non- Hodgkin e ad o:enere le licenza dalla FDA nel 1997. CD20 è una proteina trans- membrana con le seguen. proprietà: è espressa a livelli eleva. sul 95% delle cellule B affe:e da linfoma, ma non su altre cellule del corpo è espressa sui linfoci. B sani ma non sui loro precursori immaturi (perme:endo la ricos.tuzione di un compar.mento di cellule B dopo la terapia) e sulle plasmacellule (perme:endo una produzione con.nua di immunoglobuline) dopo il legame con l an.corpo non va in circolo nel plasma e non viene internalizzata è essenziale per il differenziamento e la proliferazione dei linfoci. B L acvazione del complemento è fondamentale nell efficacia dell an.corpo ma è molto importante anche l induzione dell apoptosi mediante influsso di calcio.

Trastuzumab (Hercep.n) An.corpo IgG1 umanizzato dire:o contro HER2 HER2 è un proto- oncogene che codifica il rece:ore.rosin- chinasico del fa:ore di crescita epidermico umano Il rece:ore HER2 è una proteina transmembrana che si trova su numerosi tessu. epiteliali e che viene iper- espressa nel 20-30% dei casi di tumore al seno (>2 milioni di copie contro 20000-50000 nelle cellule epiteliali normali). L iper- espressione di solito è dovuta ad una amplificazione del gene Trastuzumab lega con alta affinità HER2 ed induce l internalizzazione del suo rece:ore e quindi il blocco della trasduzione del segnale I tumori con iper- espressione di HER2 vengono iden.fica. o mediante analisi immunoistochimica (posi.vità a HER2-3) o con la FISH (evidenzia la presenza di amplificazione genica) È stato il primo an.corpo monoclonale contro tumori solidi ad essere approvato dalla FDA. E riconosciuto come agente singolo nella terapia di seconda linea nei tumori al seno HER2 + metasta.ci

Bevacizumab È un an.corpo monoclonale umanizzato che inibisce la segnalazione angiogenica legando VEGF in modo da prevenire la sua interazione con VEGFr1 e VEGFr2. Ha ricevuto l approvazione della FDA nel 2004 come tra:amento di prima linea per il cancro colore:ale metasta.zzato in associazione con 5- FU VEGF è un fa:ore di crescita proangiogenico che regola la proliferazione e la permeabilità vascolare ed è un fa:ore an.apopto.co per i nuovi vasi sanguigni Agisce tramite due rece:ori, VEGFr1 e VEFGr2, che sono espressi sull endotelio vascolare. La loro espressione in genere aumenta in risposta a ipossia, oncogeni e citochine.

γ- carbossilazione delle proteine

La cascata della coagulazione del sangue

Disordini gene.ci della coagulazione: emofilia A (fa:ore VIII) emofilia B (fa:ore IX) La World Federa.on of Haemophilia s.ma che nel mondo ci siano 400.000 emofiliaci. La produzione dei fa:ori della coagulazione necessari per ques. pazien. a:raverso la tecnologia del DNA ricombinante perme:e di superare i problemi di contaminazioni virali che rendono meno sicuri i deriva. del plasma.

Fa:ore VIII Il fa:ore VIII è una proteina di 2332 aa che ha una stru:ura a domini A1- A2- B- A3- C1- C2. Il dominio B viene inizialmente rimosso e nel plasma il fa:ore VIII è associato al fa:ore di von Willebrandt (vwf), che lo stabilizza. Il dominio C2 è coinvolto nel legame a vwf e alle membrane.

Fa:ore VIII ricombinante Espresso in cellule di mammifero BHK e CHO a livelli bassi: secrezione poco efficiente. Cos. molto eleva. (oltre 100.000 $/anno per paziente) Produzione di fa:ore VIII ibrido uomo/maiale (sequenze FVIII di maiale nei domini A1 e A3 aumentano livelli di espressione migliorando la velocità di secrezione) in un sistema len.virale so:o il controllo del promotore EF- 1α in cellule BHK Livelli di espressione: 9 pg/cellula/giorno cioè circa 7.3 mg in 2.5 l raccol. dal giorno 3 al giorno 7 di coltura Purificazione mediante cromatografia a scambio ca.onico su SulfoPropyl- Sepharose: 4.9 mg di fa:ore VIII con elevata purezza

Fa:ore VIII ricombinante

Espressione del Fa:ore IX in cellule CHO Fa:ore IX (415 aa) espresso in CHO a 180 µg/ml (forma acva solo 1.5 µg/ml). I livelli di espressione aumentano se viene co- espressa la furina (proteasi che rimuove un pep.de segnale necessario per la γ- carbossilazione). Approvato con il nome BeneFIX nel 1998.

Fa:ore VIIa ricombinante Il fa:ore VII è espresso in cellule BHK come proteina a singola catena. L acvazione (proteolisi R152- I153) è spontanea. Purificazione mediante cromatografia a scambio ionico, cromatografia di affinità su an.corpo monoclonale contro il dominio Gla e altre due cromatografie a scambio ionico. Il fa:ore VIIa è indicato nei pazien. con emofilia A o B che hanno sviluppato an.corpi inibitori contro i fa:ori VIII o IX.

Nuovi approcci per aumentare l emivita di FVIII, FIX e FVIIa