TECNICHE ELETTROFORETICHE
L elettroforesi e un metodo di separazione che si basa sulla diversa mobilita degli ioni (o di sostanze elettricamente cariche), quando posti all interno di un campo elettrico generato fra due elettrodi; tale tecnica e largamente usata per la separazione di molecole biologiche, quali proteine,amminoacidi ed acidi nucleici.
All interno di un campo elettrico (E), su ogni ione di carica q viene applicata una forza (F) espressa da: F = qe
Tuttavia, esiste anche una resistenza frizionale, che rallenta il movimento della particella carica; tale resistenza e una misura delle dimensioni idrodinamiche della molecola, della sua forma, delle dimensioni del mezzo in cui avviene l elettroforesi e della viscosita del tampone; quindi si ha: F friz. = ƒ Dove e la velocita di migrazione dello ione ed ƒ e il suo coefficiente frizionale.
In un campo elettrico costante le forze sullo ione si bilanciano, quindi si ha: qe = ƒ ogni ione, dunque, si muove con una velocita costante caratteristica. Generalmente, viene utilizzato il termine mobilita elettroforetica ( ), che rappresenta il rapporto tra la velocita dello ione e l intensita del campo elettrico: = /E =q/f
SCHEMA DI UN APPARATO PER ELETTROFORESI ZONALE Per prevenire fenomeni quali il rimescolamento delle molecole che stanno migrando, fenomeni che avvengono nell elettroforesi in soluzione libera, nell elettroforesi zonale e stato introdotto l ausilio di un supporto solido, inerte ed omogeneo.
ELETTROFORESI SU GEL Ha ampiamente sostitito i sistemi su carta e su strato sottile per la separazione di proteine ed acidi nucleici. Vantaggi: offre un maggiore potere risolutivo. Diversi tipi di gel: i gel d AMIDO si preparano scaldando e poi raffreddando una sospensione di amido ed hanno una composizione variabile dall 1% al 15%. Le catene ramificate dell amilopectina si intrecciano tra loro, formando un gel semirigido.
Gel di AGAR: miscela di due polimeri derivati dal galattosio: l agarosio e l agaropectina. Ottimo per immunoelettroforesi, questo tipo di gel e largamente usato per la separazione di acidi nucleici e di frammenti di DNA di restrizione, grazie all assenza di elettro-osmosi e di filtrazione molecolare. Infine, la miglior risoluzione per quanto riguarda la separazione di proteine si ottiene con i gel di POLIACRILAMMIDE. Questi ultimi possiedono una trascurabile tendenza all adsorbimento, l assenza di elettroosmosi e la facilita di analisi quantitativa dei risultati.
ANALISI DEL GEL Al termine dell elettroforesi su gel di poliacrilammide (PAGE) il gel viene analizzato mediante una delle seguenti procedure: colorazione,autoradiografia od analisi densitometrica.
La procedura piu comune e la colorazione; le proteine vengono generalmente evidenziate mediante colorazione con blue di Coomassie (sensibile fino ad 1 g di proteina), o con nitrato d argento (sensibile fino a 10 ng di proteina). Una volta colorato, il gel puo essere fotografato e, mediante analisi densitometrica (misura della densita ottica di ogni banda), si può stabilire quantitativamente l intensita di ogni singola banda.
Gli acidi nucleici, invece, vengono generalmente evidenziati mediante colorazione con bromuro di etidio, un intercalante fluorescente che diventa arancione quando legato agli acidi nucleici ed eccitato mediante luce UV (sensibilita 10-15 ng di DNA).
ELETTROFORESI SU GEL DI POLIACRILAMMIDE IN PRESENZA DI SDS L elettroforesi su gel di poliacrilammide e uno dei metodi piu utilizzati per separare le diverse proteine di una miscela e determinarne il peso molecolare. Il dodecilsolfato di sodio (SDS) e un detergente anionico, che si lega saldamente alle proteine provocandone la denaturazione e fornendo loro una quantita di carica negativa costante per unita di massa. Pertanto, durante l elettroforesi i complessi proteina SDS si muoveranno tutti verso l anodo. La loro mobilita risultera inversamente proporzionale al loro peso molecolare e risentira solo delle proprieta di setaccio molecolare del gel.
Mediante SDS-PAGE e possibile determinare la massa molecolare relativa (Mr) di una proteina, confrontando la sua mobilita relativa (Rf) con quella di una serie di proteine standard di Mr nota, separate sullo stesso gel. Rf = d s /d o d s = distanza percorsa dal campione d o =distanza percorsa dal blu di bromofenolo
La mobilita elettroforetica relativa delle proteine varia in modo lineare con il logaritmo decimale (log) della loro Mr, quindi riportando in grafico R f in funzione del log della Mr di ogni proteina standard, si ottiene una retta di taratura dalla quale si puo risalire alla Mr della proteina incognita.
STANDARD PROTEICI IMPIEGATI
ISOELETTROFOCALIZZAZIONE L isoelettrofocalizzazione (IEF) consiste nello studio della mobilita elettroforetica delle proteine in funzione del ph. Le proteine sono molecole anfotere, cioe contengono sia residui acidi che basici. Il loro grado di ionizzazione dipende dal ph del mezzo e dai valori dei pk di ciascun gruppo amminoacidico ionizzabile. L elettroforesi avviene su un gradiente continuo e stabilizzato di ph (dall anodo al catodo) e, pertanto, ogni proteina tendera a migrare sino a raggiungere la regione di ph corrispondente al proprio punto isoelettrico (pi).
SCHEMA DELL IEF
IEF SU GEL
WESTERN BLOTTING
Come detto, la tecnica PAGE effettua il frazionamento di una miscela di proteine durante il processo di elettroforesi. E possibile sfruttare questo frazionamento, per esaminare ulteriormente le singole proteine. Il primo passaggio consiste nel trasferimento delle proteine separate dal gel su un foglio di nitrocellulosa (protein blotting).
Il trasferimento delle proteine puo essere eseguito attraverso due diverse modalita : Capillary blotting Electroblotting
Capillary blotting Il gel viene posto su strati di carta da filtro bagnati, imbevuti nel tampone, mentre un foglio di nitrocellulosa viene posto sopra il gel; viene fatto passare del tampone attraverso il gel, posizionando un altro blocco di materiale assorbente asciutto ed applicando un peso considerevole sul foglio di nitrocellulosa. Il passaggio del tampone attraverso il gel, per azione capillare, trasporta le proteine separate dal gel al foglio di nitrocellulosa.
Electroblotting Un sandwich di gel e nitrocellulosa viene compresso tra due fogli di plastica rigidi ed immerso in un tampone tra due elettrodi paralleli; viene fatta passare corrente elettrica in direzione perpendicolare al gel, provocando l elettroforesi delle proteine separate. Queste escono dal gel ed entrano nel foglio di nitrocellulosa.
Una volta trasferite sulla nitrocellulosa, le proteine separate possono essere sottoposte ad ulteriore esame, cioe all analisi del blot, che richiede solitamente l impiego di un anticorpo specifico per una certa proteina.
Tipi di marcatori frequentemente coniugati con l anticorpo secondario Enzimi: in presenza dello specifico substrato l enzima converte quest ultimo in prodotto colorato insolubile, che precipita sulla nitrocellulosa; gli enzimi solitamente impiegati sono la fosfatasi alcalina e la perossidasi di rafano. 125 I: il legame dell anticorpo al blot viene misurato quantitativamente mediante autoradiografia. Fluorofori: marcatori fluorescenti come la fluoresceina isotiocianato.
Proteina A marcata con 125 I : tale proteina viene impiegata al posto dell anticorpo secondario, in quanto lega la porzione Fc di quello primario; il legame viene rivelato mediante autoradiografia. Particelle di oro: sono visualizzate direttamente, in quanto danno una colorazione rossa quando si legano ad un anticorpo primario sul blot. Anticorpi secondari biotinilati: la biotina e una vitamina che si lega fortemente all avidina; il blot viene prima incubato con un anticorpo secondario biotinilato, poi con avidina coniugata ad un enzima (fosfatasi alcalina o perossidasi di rafano), che genera un prodotto colorato insolubile.