Perche usare Gel di Poliacrilammide per separare le proteine? I gel di poliacrilammide hanno una trama piu compatta I pori hanno dimensioni minori che nei gel di agarosio Le proteine sono molto piu piccole del DNA Amminoacido medio = 110 Dalton Paio di nucleotidi medio = 649 Dalton Elettroforesi di proteine Condizioni Non Denaturanti nessun pre-trattamento delle proteine prima dell elettroforesi Le proteine conservano la loro struttura 2 e 3 Le proteine conservano la loro carica Le proteine sono separate sulla base di carica, dimensioni e forma Nome Carica Massa Forma Proteina Q +3 30kD Proteina R 4 42kD 1
Elettroforesi di proteine Condizioni denaturanti Le proteine sono trattate con SDS (detergente anionico) prima dell elettroforesi (SDS-PAGE) SDS-PAGE SDS: Sodium dodecyl sulphate PAGE: Polyacrylamide Gel Electrophoresis Le proteine sono separate secondo la mobilità elettroforetica in funzione della loro massa molecolare e non in funzione della carica SDS detergente solubile per molecole idrofobiche, con carica negativa (solfato) SDS L SDS rompe le interazioni idrofobiche denaturando la proteina. La componente anionica dell'sds lega la catena peptidica (uno ione SDS ogni due residui aminoacidici; 1,4 g di SDS per mg di proteina). La carica negativa di SDS maschera la carica della proteina. Tutte le proteine vengono ad assumere un rapporto carica/massa simile. Migrano in gel elettroforesi in modo proporzionale al log massa. Possibile determinare la massa di una proteina con approssimazione del 5-10% 2
PAGE Proteine denaturate e cariche negativamente, sottoposte ad un campo elettrico migrano tutte verso il polo +, senza separarsi per dimensione. proteine denaturate e cariche negativamente, sottoposte ad un campo elettrico ed in un ambiente (matrice di poliacrilammide) che consente di separarsi in modo differente in base alla dimensione. POLIACRILAMIDE Acrilamide N,N -metilen-bis-acrilamide (bis) + Catalizzatori Le molecole di acrilammide sono tenute assieme dalla bis-acrilammide formando una struttura a maglie 3
13/05/2013 Scelta della % di poliacrilammide del gel % di acrilammide consigliata Dimensioni delle proteine 8% 10% 12% 40-200 kda 21-100 kda 10-40 kda Come funziona una SDS-PAGE? s-s Le proteine cariche negativamente si muovono verso l elettrodo positivo SDS, calore Proteine con SDS Proteine piu piccole si muovono piu velocemente Le proteine si separano per dimensione + 4
Estrazione delle proteine Lisi delle cellule con un tampone di lisi che dissocia le proteine e inibisce le proteasi cellulari Concentrazione dei sali Detergenti (Triton X-100, NP40, SDS) ph (tampone) Inibitori di proteasi Bassa temperatura (ghiaccio) Inibitori proteasi: Leupeptina, Pepstatina, Aprotinina, PMSF Proteasi Estrazione delle proteine Lysis buffer 300mM NaCl 50mM Tris-Cl ph 7.6 0.5% Triton X-100 Inib fosfatasi 1x 1mM PMSF leupeptina 10 µg/ml aprotinina 10 µg/ml Stock solutions NaCl, 3M Tris-Cl ph 7.6, 1M Triton X-100 Inib fosfatasi 10X PMSF, 100mM Leupeptina, 10mg/ml Aprotinina, 10mg/ml Quali volumi di ogni soluzione stock dobbiamo prelevare per preparare 5ml di lysis buffer? 5
Estrazione delle proteine Lysis buffer 300mM NaCl 50mM Tris-Cl ph 7.6 0.5% Triton X-100 Inib fosfatasi 1x 1mM PMSF leupeptina 10 µg/ml aprotinina 10 µg/ml Stock solutions 0.5ml= 500ul NaCl, 3M 0.25ml= 250ul Tris-Cl ph 7.6, 1M 0.025ml= 25ul Triton X-100 0.5ml= 500ul inib fosfatasi 10X 0.05ml= 50ul PMSF, 100mM 0.005ml= 5ul Leupeptina, 10mg/ml 0.005ml= 5ul Aprotinina, 10mg/ml H2O = 3.665 ml Quantizzazione proteine Soluzione Coomassie protein assay kit Lettore ELISA Reader (EL800 Bio-tek Instruments), lettura a 595nm La concentrazione finale sarà espressa in µg/µl una proteina è concentrata 5 µg/ µl Quanti µl di campione devo prelevare per ottenere 80 µg di campione da caricare su gel? 5 µg: 1 µl= 80 µg: X µl X= 16 µl 6
Cosa c e nel tampone di caricamento? Un tampone (Tris) per fornire il giusto ph (6,8) SDS (Sodio Dodecil Solfato) per solubilizzare le proteine e fornire loro una carica negativa complessiva Glicerolo per rendere pesanti i campioni e farli scendere nei pozzetti Un agente riducente (DTT o b-mercaptoetanolo) per rompere i legami disolfuro Un colorante (Blu di Bromofenolo) per visualizzare i campioni Come preparare un gel per SDS-PAGE Preparazione vetri per colare gel-41 7
Come preparare un gel per SDS-PAGE Preparazione miscela per lower-resolving gel: % acrilammide-bis acrilammide (poliacrilammide) Tris-HCl ph 8.8 SDS APS (ammonio persolfato) TEMED (tetrametiletilendiamina) La reazione di polimerizzazione avviene per un meccanismo a catena di radicali liberi, generati per decomposizione chimica di un composto labile. L APS è l'estere disolfato dell'acqua ossigenata (-O3S-O-O-SO3-) che rapidamente genera radicali instabili.so4-. Il TEMED è una amina terziaria che reagisce con questi radicali a formare radicali liberi, che a loro volta reagiscono con l'acrilamide per indurre la polimerizzazione. Come preparare un gel per SDS-PAGE Colare resolving-30 8
Come preparare un gel per SDS-PAGE Preparazione miscela per upper-stacking gel: 4 % acrilammide-bis acrilammide (poliacrilammide) Tris-HCl ph 6.8 SDS APS TEMED Come preparare un gel per SDS-PAGE colare stacking-21 9
Elettroforesi SDS-PAGE Cathode Tris-HCl ph 6,8 Tris-HCl ph 8,8 Anode Elettroforesi SDS-PAGE Preparazione vaschetta per corsa gel-41 10
Stacking ph 6,8 Il Gel Resolving ph 8,8 + vengono caricate proteine e marker di peso molecolare colorato viene applicata una corrente elettrica Ioni Cloruro (-) / Proteina / Glicina (+) (tampone tris-cl/glicina) Differenze di ph causano la ionizzazione della glicina, permettendo alle proteine di migrare nel gel separatore (resolving) SDS-PAGE Colorazione con Blu di Coomassie 11
Caricamento campioni corsa gel per SDS-PAGE Corsa campioni-38 Caricamento campioni e corsa gel per SDS-PAGE Proteine separate per peso molecolare Protein Color MW (daltons) Myosin Blue 204,649 B-galactosidase Magenta 127,511 Bovine serum albumin Green 85,130 Carbonic anhydrase Violet 37,830 Soybean trypsin inhib. Orange 30,906 Lysozyme Red 27,230 Aprotinin Blue 6,638 12
e dopo la SDS-PAGE? 1. fissare proteine su gel e visualizzarle con colorazione 2. Trasferire le proteine su membrana e procedere con anticorpi specifici pe rilevare proteine di interesse nel campione (Western blotting) Visualizzazione delle proteine nel gel Colorazione con il Coomassie Brilliant Colorazione con l argento Silver staining (puo essere visualizzato ~1ng di proteina per banda) Coomassie staining Silver staining 13
Western Blotting per determinare la presenza, la quantità ed il peso molecolare di una proteina in differenti campioni Western Blot, a cosa serve Qual e la proteina che mi interessa? SDS-PAGE (non certo) Si basa sul confronto di peso molecolare Western blot (certo) Si basa su una reazione specifica antigene-anticorpo? + 14
Western Blot, a cosa serve Quanta proteina di interesse c e? Proteina di interesse Bande non specifiche [Proteina], pg Western Blotting, come si procede separazione per SDS-PAGE trasferimento su un supporto (membrana di nitrocellulosa/pvdf - Polivinilidene fluoride), in presenza di campo elettrico saturazione con proteine generiche (Milk-BSA) per prevenire le interazioni non specifiche tra l anticorpo e la membrana legame dell anticorpo primario (riconosce la proteina specifica immobilizzata sulla membrana) legame dell anticorpo secondario l anticorpo è coniugato con un enzima (fosfatasi alcalina/ perossidasi) e riconosce specificamente l anticorpo primario, gia legato alla proteina sulla membrana) Rilevazione del legame proteina-anticorpo mediante un substrato dell enzima 15
Western Blotting, come si procede Western Blotting, come si procede Trasferimento su membrana immobilizzazione delle proteine Fatto a 4 C per evitare surriscaldamento, decomposizione del tampone e degradazione delle proteine 16
Western Blotting, come si procede Trasferimento su membrana, sandwich Trasferimento dal catodo (-) all anodo (+) 1) Spugnetta 2) carta da filtro (3mm) imbevuti di tampone di trasferimento 3) Gel 4) Membrana 5) carta da filtro (3mm) imbevuti di tampone di trasferimento 6) Spugnetta Western Blotting, come si procede Carta filtro imbevuta di buffer membrana - + Gel Tampone di trasferimento Elettrodi SDS-PAGE sandwich blotting Direzione di trasferimento Membrana con proteine legate tampone di trasferimento 25mM Tris 190mM glicina 20% metanolo 17
Western Blotting, come si procede Western blot-1 58 Western Blotting, come si procede Coloraz ponceau-1 34 18
Western Blotting, come si procede legame dell anticorpo primario Western Blotting, gli anticorpi Anticorpi (immunoglobuline, Ig) proteina secreta nel sangue in risposta ad uno specifico antigene, come un batterio o un virus; neutralizza l antigene legandosi specificamente ed esso e producendo una risposta immunitaria. 19
Western Blotting, come si procede legame dell anticorpo secondario coniugato all enzima Fosfatasi Alcalina (AP) o perossidasi del rafano (HRP) Western Blotting, come si procede rilevazione Conversione di un substrato colorimetrico in un precipitato colorato. L enzima coniugato all anticorpo secondario scinde il substrato che, in corrispondenza della proteina specifica, sviluppa chemioluminescenza che impressiona la lastra 20
Western blot substrato HRP HRP luce Anticorpo primario Anticorpo secondario Rivelazione Il substrato metabolizzato dalla perossidasi (HRP) emette luce pg proteina 21