Studio della regolazione dell espressione genica

Un gene soggetto a regolazione possiede una o più sequenze regolatorie posizionate in maniera diversa rispetto al gene. I regolatori possono essere positivi o negativi.

Come funzionano gli enhancers pur essendo lontani dal gene? Il DNA looping promuove l interazione proteina-proteina

Nucleosoma Gli istoni sono proteine basiche ricche in lisina e arginina (>1/5), altamente conservate Ruolo strutturale e funzionale 5 principali istoni: H1, H2A, H2B, H3, H4

Le modificazioni degli istoni Gli istoni possiedono delle code che sporgono dal nucleosoma e che sono sede delle PMT Acetilazione: Metilazione Ubiquitinazione Sumoilazione Le PTM: Sono a carico di enzimi specifici Sono reversibili Permettono sia la modificazione dell interazione col DNA che il reclutamento di proteine che modificano struttura e funzione della cromatina Fosforilazione In pratica permettono di modulare tutti i processi che coinvolgono l accesso al DNA (trascrizione, replicazione, ricombinazione, riparazione )

Rimozione di una carica positiva sulla lisina Acetilazione Alterazione dell interazione col DNA Avviene principalmente su H3 e H4 E operata dalle istone acetilasi La deacetilazione è operata dalle HDAC E associata con l attivazione della trascrizione

Metilazione Avviene su residui di lisina (1-3 met) e arginina (1-2 met) degli istoni H3 e H4 Il numero di gruppi metilici influenza il reclutamento di diverse proteine E operata dalle istone metiltransferasi (HMT) La rimozione del gruppo metilico è operata da istone demetilasi E associata sia all attivazione che alla repressione trascrizionale L effetto dipende dal residuo metilato e dal grado di metilazione

Chromatin immunoprecipitation (ChIP)

Real time PCR (PCR quantitativa) Permette di determinare quante copie di un specifica sequenza di DNA o RNA sono presenti nel campione

Come studiare un enhancer in vivo

Saggio luciferasico per caratterizzare un enhancer o promotore 1. Analisi delle sequenze di legame per fattori di trascrizione (per es. mathlab) 2. ChIP per verificare il legame + luciferase assay per testare la funzionalità del legame Specific TF Enhancer

Identificazione di un sito di legame sul DNA Gel retardation

EMSA per identificare la minima sequenza di legame Electrophoretic Mobility shift assay: sfrutta il principio della differente mobilità elettroforetica fra un complesso proteina-dna e il DNA da solo a. Un piccolo frammento di DNA viene marcato radioattivamente o per fluorescenza. b. Incubazione con la proteina o con il lisato proteico di interesse c. Elettroforesi di policrilammide non denaturante Permette di capire anche se più proteine sono legate allo stesso DNA (in base alle differenze di MW delle proteine)

Per individuare quale proteina si sta legando si fa il supershift: il legame all anticorpo specifico rallenta la corsa del complesso proteico Un dsdna di CR4 contenente l element0 sox-oct viene incubato con lisati di ESC indifferenziate. L aggiunta di anticorpi per Oct4 o Sox2 determina un supershift del complesso.

Metilazione del DNA Modifica chimica che avviene sul DNA Gruppi metile sono aggiunti alla citosina generando 5-metil citosina Il genoma dei vertebrati è globalmente metilato con eccezione delle regioni 5 dei geni, promotori isole CG e esoni La metilazione del DNA è responsabile della repressione genica e avviene ad opera delle DNA metil trasferasi (DNMT). Sebbene molte isole CG restano non metilate durante lo sviluppo una minoranza diventa metilata per consentire la repression genica. Infatti la metilazione del DNA è ereditabile e reversibile. Un esempio classico è l inattivazione del cromosoma X durante cui centinaia di CGIs diventano fortemente metilate, assicurando il silenziamento genico. Altri esempi di metilazione naturale sono i geni imprinted e i geni espressi esclusivamente nella linea germinale.

Bisulfito per determinare la metilazione del DNA Si tratta il DNA con bisulfito (solfato di idrogeno,hso 3 ) Le C non metilate vengono convertite in U e poi in T (fase di PCR prima del sequenziamento) HSO 3 Comparazione della sequenza del DNA trattato e non col bisulfito