Filippo Pacchioni Olivier Jousson CIBIO, Università di Trento (TN) Sviluppo di metodiche molecolari avanzate per il controllo di qualità microbiologico nei processi di produzione di prodotti farmaceutici e di integratori alimentari Progetto sostenuto nell ambito del bando per progetti di ricerca scientifica finalizzati allo sviluppo di iniziative imprenditoriali (2014/2015)
I PARTNER E LE COLLABORAZIONI CIBIO, Università di Trento (Povo, TN): Olivier Jousson (responsabile del laboratorio di Genomica Microbica) Elisabetta Giacobazzi Mattia Benedet Filippo Pacchioni Clotilde Bettua E Pharma Trento S.P.A. (Ravina, TN): Paolo Andreatta (ex Direttore Generale e Amministratore Delegato) Claudia Lunelli (responsabile laboratorio Microbiologico del controllo qualità) Mara Giacomozzi (responsabile del Controllo Qualità)
LA RICERCA Obiettivo del progetto: - Implementare l uso di metodologie molecolari (real-time PCR) alternative o complementari alle metodiche attualmente in uso per il controllo qualità microbiologico: nei processi produttivi in ambito farmaceutico nel monitoraggio degli ambienti di produzione e confezionamento - Caratterizzazione della comunità batterica che popola l impianto idrico e l aria degli ambienti di lavoro dell azienda con l impiego della tecnologia NGS (Next Generation Sequencing)
CONTROLLO QUALITA MICROBIOLOGICO: ANALISI EFFETTUATE DALL AZIENDA Materie prime e prodotti finiti Conta totale dei microrganismi aerobi vivi Microrganismi specifici TAMC (conta totale microbica aerobica) TYMC (conta totale lieviti e muffe) Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus
CONTROLLO QUALITÀ MICROBIOLOGICO: ANALISI EFFETTUATE DALL AZIENDA Acqua purificata ad osmosi inversa Ambienti di produzione e confezionamento Aria degli ambienti di lavoro (aree produttive, magazzino, aree laboratorio microbiologico) TAMC (conta totale microbica aerobica) TYMC (conta totale lieviti e muffe)
CONTROLLO QUALITÀ MICROBIOLOGICO: METODO COLTURALE (linee guida European Pharmacopoeia ) Pesare e risospendere la materia prima/prodotto finito Raccogliere il campione d acqua lungo l impianto e filtrarlo Filtrare il campione Posizionare il filtro sul terreno di crescita Incubare i terreni a crescere Contare le colonie cresciute Aspirare il campione d aria nei locali dell azienda Incubare i terreni a crescere Contare le colonie cresciute
METODO COLTURALE: TEMPI E CONDIZIONI DI CRESCITA Microrganismo Terreno Temperatura Tempi di incubazione TAMC TSA 30 35 C 3-5 giorni Materie prime e prodotti finiti TYMC SDA 20 25 C 5 giorni Bile-tolerant gram-negative bacteria VRBGA 30 35 C 18 24 h Escherichia coli MCA 30 35 C 18 72 h Salmonella enterica XLDA 30 35 C 18 48 h Pseudomonas aeruginosa Cetrimide agar 30 35 C 18 72 h Staphylococcus aureus Mannitolo agar 30 35 C 18 72 h Ambienti di produzione e confezionamento TAMC R2A 30 35 C 7 giorni TYMC SDA 20 25 C 7 giorni
LIMITI METODO COLTURALE: TEMPO E TERRENO DI COLTURA Tempi di risposta delle analisi lunghi (dai 3 ai 7 giorni) Maggiori tempi di stoccaggio dei prodotti finiti Maggiori tempi prima dell utilizzo delle materie prime Si allungano tempi di rilascio e consegna dei prodotti finiti Saturazione dei magazzini Selezione di alcune specie a scapito di altre più difficilmente coltivabili o presenti in minore quantità in seguito alla scelta di: terreno di coltura condizioni di crescita
ANALISI MOLECOLARE DI PRODOTTI FARMACEUTICI - Impiego della real-time PCR per la rilevazione del numero di copie del gene 16S batterico - Vantaggi: Tempi più brevi per il controllo qualità microbiologico Risposte più specifiche: possibilità di sviluppare saggi batterio-specifici, utile per specie batteriche patogene
ANALISI MOLECOLARE: SVANTAGGIO Impossibilità di distinguere microrganismi vivi da quelli morti Utilizzo di intercalanti vitali che legano il DNA delle cellule morte distinguendo organismi vivi dai morti Cellula Morta DNA di una cellula morta legato al PMA e non amplificato dalla PCR Cellula Viva PMA/Luce qpcr Propidium Monoazide (PMA) 10
Punti critici dell analisi molecolare Assenza kit specifico per estrarre DNA da matrici farmaceutiche Bassa carica batterica nelle materie prime e prodotti finiti Discriminare DNA vivo da quello morto Complessità nella composizione delle matrici farmaceutiche Testata l efficienza di estrazione di 4 kit diversi Aumentare massa di partenza per l estrazione Saggio PMA Ottimizzare protocollo di estrazione per bloccare potenziali inibitori dell estrazione
# Copie 16S BANDO SVILUPPO ECONOMICO ANALISI MATERIE PRIME E PRODOTTI FINITI: METODO MOLECOLARE Pesare 1g di Proxerex Sciogliere la matrice in 10mL di tampone peptonato a ph 7,0 sterile Analisi copie 16S 250µl senza PMA 250µl + 1,25µl PMA (50µm) Bioshake, 1000rpm, 20min, 25 C 1400000 1200000 1000000 800000 600000 Proxerex Cambiare tubo Cross-linking 400000 200000 0 Centrifugare 10min a 20Kxg e scartare 200µl Estrazione con PowerSoil, protocollo LowBiomass (aggiungendo 4-µL IEC) 16S qpcr
ANALISI MATERIE PRIME E PRODOTTI FINITI: ULTIMI ASPETTI DA OTTIMIZZARE BANDO SVILUPPO ECONOMICO Volume di partenza troppo basso per le matrici con cariche batteriche basse Aumentare la quantità di materiale di partenza da estrarre Concentrare la materia prima o il prodotto finito su filtri 0,22μm Ottimizzare il saggio di vitalità con coloranti vitali su filtro (PMA) Estrazione con PowerWater, MoBio CFU Metodo colturale Copie 16S Metodo molecolare
CARATTERIZZAZZIONE DELLA COMUNITÀ MICROBICA DELL IMPIANTO IDRICO E DELLE AREE AZIENDALI Raccogliere il campione d acqua lungo l impianto e filtrarlo Aspirare il campione d aria nei locali dell azienda Estrazione del DNA batterico Amplificazione e sequenziamento del gene 16S Analisi bioinformatiche delle sequenze
IMPIANTO IDRICO E-PHARMA PW-30 LINEA 1 LINEA 2 LINEA 3,4,5 LINEA 6 LINEA 7 LINEA 8 3 Piano PW-22 PW-23 PW-27 PW-11 PW-12 PW-13 PW-19 PW-20 PW-14 2 Piano PW-10 PW-9 PW-3 PW-2 PW-6 PW-5 PW-4 1 Piano
Asse 2 [14,8%] BANDO SVILUPPO ECONOMICO CARATTERIZZAZIONE DELLA COMUNITÀ MICROBICA DELL IMPIANTO IDRICO AZIENDALE MDS/PCoA sulla distanza UniFrac pesata Linea Sanificazione Prima Dopo Asse 1 [34,7%]
Abbondanza relativa media BANDO SVILUPPO ECONOMICO IMPATTO DELLA SANIFICAZIONE DELL IMPIANTO SUI PRINCIPALI PHYLA BATTERICI Phyla principali Sanificazione Dopo Prima * = batteri sporigeni *
RICADUTE SUL TERRITORIO Stesura protocollo molecolare Analisi controllo qualità eseguite in tempi più brevi Vantaggi qualitativi, logistici ed economici per E-Pharma ed altre realtà produttive nel territorio DISSEMINAZIONE DEI RISULTATI Comunità microbica dell impianto idrico Comunità microbica dell aria di reparti aziendali Oggetto di una possibile pubblicazione sulla caratterizzazione della comunità microbica degli ambienti di lavoro LAVORI SUCCESSIVI AL PROGETTO Inserimento e validazione dei protocolli impostati durante il progetto nel processo di controllo qualità microbiologico, in parallelo oppure sostituiti alle metodiche tradizionali previa presentazione di domanda di variazione e accettazione da parte del Ministero della Salute.