DIAGNOSTICA MOLECOLARE How does the global diagnostics market develop? The world market in diagnostics has a forecast yearly growth rate of 5-7%. Technological innovation is driving growth. The diagnostics industries seem to remain untouched by the global economic depression. The overall market potential amounts to 30 billion Euro in 2010. 1
Caratteristiche di un metodo UTILE per la rilevazione di patogeni 1. Specificità 2. Sensibilità 3. Semplicità (rapidità) 2
Saggi diagnostici di tipo immunologico VANTAGGI Sensibilità Specificità LIMITI Proteina target espressa Sito target non mascherato Semplicità Applicabili in molti campi -rilevazione di metaboliti -identificazione di agenti patogeni -valutazione e controllo di tumori Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay ELISA 3
Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay ELISA Anticorpi policlonali Quantità dei diversi anticorpi variabili tra diverse preparazioni Non adatti a distinguere bersagli molto simili (es: differenze di un unico determinante antigenico tra forma patogena e non patogena) Anticorpi monoclonali 4
Linfociti B: cellule non coltivabili, in coltura muoiono dopo 7-10 gg Cellula ibrida Linfocita B Cellula in grado di moltiplicarsi in vitro (mielomi) 5
Formazione e selezione degli ibridomi (1) PEG 35% HGPRT - (Ipoxantina-guanina fosforibosil transferasi) Formazione e selezione degli ibridomi (2) Crescita in HAT Hypoxanthine Aminopterin Thymidine Precursore G, A Inibitore Deidrofolato reduttasi Per superare blocco produzione pirimidine (C, T) dovuto a aminopterina ELISA terreno di coltura come fonte di anticorpi 6
Alcuni target diagnostici degli anticorpi monoclonali 7
Clearview Chlamydia MF: Assay Principle The absorbent pad in the Sample Window contains a latex labelled monoclonal antibody directed against a genus-specific lipolysaccharide epitope of Chlamydia. When a specimen containing a Chlamydia trachomatis antigen is added to the sample pad, the chlamydial antigen binds to the latex labelled anti-chlamydial antibody. This moves along the test strip and binds to a region of immobilised anti-chlamydia antibody in the Result Window. If there is no Chlamydia trachomatis antigen present then the Result Window will remain clear. At Start A Positive Result A Negative Result Saggi diagnostici basati sul DNA Ibridazione di sonde PCR 8
Caratteristiche delle sonde di ibridazione DNA o RNA Lunghe (>100) o corte (<50) Sintetizzate chimicamente o costituite da parti di geni SPECIFICHE 1. test sulle specie target 2. test sulle specie affini 3. test su un ampio campo di organismi 4. test su colture miste per determinare la sensibilità Schema generale di un saggio diagnostico basato su ibridazione di sonde Ancoraggio del DNA a singolo filamento a un supporto solido (membrana) Aggiunta della sonda marcata (appropriate condizioni di temperatura e forza ionica) Lavaggi Rivelazione della sonda marcata => specificità e sensibilità 9
membrana Dot-Blot DNA da analizzare DNA da analizzare DNA da analizzare DNA da analizzare Sonda A Sonda B Sonda C Sonda D Dot-Blot inverso membrana Sonda A Sonda B Sonda C Sonda D DNA da analizzare marcato Condizione ideale: utilizzo delle sonde ad acidi nucleici direttamente sul campione (no coltura -arricchimento-; no estrazioni laboriose) Se nel campione la sequenza target è rara, si può ricorrere alla PCR 10
Esempio di utilizzo di sonde a DNA: la diagnosi della malaria Uccide 1.000.000 di persone / anno Necessità di metodi diagnostici sensibili, semplici e poco costosi Esempio di utilizzo di sonde a DNA: la diagnosi della malaria Diagnosi classica: esame al microscopio di uno striscio di sangue dopo colorazione Giemsa Test ELISA: Rapido e automatizzabile [Rapid Diagnostic Test (RDT) fornisce risultati in 10 min] Ma non distingue tra infezioni attuali o pregresse 11
Esempio di utilizzo di sonde a DNA: la diagnosi della malaria 1. Screening di una genoteca di P.falciparum 2. Selezione dei cloni contenenti DNA altamente ripetuto (rdna) 3. Utilizzo dei cloni selezionati come sonde 4. Test di specificità della sonda selezionata DNA di P. falciparum positivo DNA di P. vivax negativo DNA di P. cynomolgi negativo DNA umano negativo Esempio di utilizzo di sonde a DNA: la diagnosi della malaria Sensibilità: 10 pg di DNA purificato da P.falciparum = circa 100 parassiti Questo metodo rileva soltanto le infezioni in atto! 12
Altri esempi di utilizzo di sonde a DNA Legionella pneumophila Salmonella typhi Campylobacter hyointestinalis Escherichia coli enterotossica (insufficienza respiratoria) (intossicazione alimentare) (gastrite) (gastroenterite) Esempio di utilizzo di saggi basati su PCR: la diagnosi del Trypanosoma cruzi Malattia di Chagas (tripanosomiasi americana) 300.000 nuovi casi all anno 21.000 decessi all anno 13
Esempio di utilizzo di saggi basati su PCR: la diagnosi del Trypanosoma cruzi Diagnosi classica: esame al microscopio di uno striscio di sangue Somministrazione del sangue del paziente a insetti non infetti e successiva analisi al microscopio del contenuto dell intestino (30-40 giorni) Saggi immunologici (possibilità di falsi positivi) Esempio di utilizzo di saggi basati su PCR: la diagnosi del Trypanosoma cruzi DNA T. cruzi PCR Multiple copy fragment 188 bp Elettroforesi 14
Marcatura della sonda/primer Radioattivo (P 32 ) -Breve tempo di dimezzamento -Pericolosità potenziale NON radioattivo -DNA biotinilato stabile 1 anno -sensibilità comparabile a P 32 Colorimetrico Chemiluminescente Rilevazione del DNA target tramite chemiluminescenza (1) 15
Rilevazione del DNA target tramite chemiluminescenza (2) Rilevazione del prodotto di PCR tramite coloranti fluorescenti Es:Fluoresceina Rodammina 16
1. SYBR Green Real-time PCR Denatured DNA Primer annealing DNA polymerization 1. SYBR Green 2. Molecular Beacons Real-time PCR [5+15+5 nucleotidi] 17
1. SYBR Green 2. Molecular Beacons Real-time PCR www.molecular-beacons.org 1. SYBR Green 2. Molecular Beacons Real-time PCR 18
1. SYBR Green 2. Molecular Beacons 3. Sonda Taqman Real-time PCR Fingerprint del DNA DNA non degradato Sonde utilizzate: minisatelliti 19
1 2 3 4 5 6 7 8 Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) 1. PCR DNA genomico dell organismo target come stampo Primer con sequenza random 9-10 nucleotidi Contenuto G+C = 50-80% Amplificazione di vari frammenti (da 100 a 3000 pb) 2. Analisi elettroforetica del pattern di amplificazione 20
Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) E. coli BL21 (DE3) E. coli M15 E. coli M15 E. coli M15 E. coli M15 E. coli BL21 (DE3) E. coli M15 E. coli M15 E. coli M15 E. coli M15 E. coli BL21 (DE3) E. coli M15 E. coli M15 E. coli M15 E. coli M15 21
Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) VANTAGGI Possibilità di utilizzare lo stesso insieme di primers per caratterizzare molte specie o ceppi diversi (p.es. distinguere ceppi patogeni da ceppi non patogeni) Non sono necessarie genoteche, southern blot o altre reazioni di ibridazione. È possibile automatizzare il procedimento Non è necessario conoscere le sequenze target Diagnosi molecolare delle malattie genetiche A cosa serve: Riconoscere i portatori di malattie ereditarie Effettuare diagnosi prenatale Effettuare una diagnosi precoce Quindi consente di sapere se c è un rischio per la persona o per la sua progenie 22
Identificazione di mutazioni puntiformi (SNP) Identificazione di mutazioni in diversi siti intragenici Diagnosi dell anemia falciforme Mutazione a carico di un singolo nucleotide nella catena β dell emoglobina CCTGAGG sequenza normale CCTGTGG sequenza mutata Omozigoti S/S: anemia grave, aspettativa di vita breve Eterozigoti A/S: normalmente asintomatici (portatori sani) 23
Diagnosi dell anemia falciforme CCTNAGG sequenza riconosciuta da CvnI Diagnosi dell anemia falciforme Elettroforesi e colorazione del gel con bromuro d etidio 24
Identificazione di mutazioni puntiformi (SNP) Allele Specific Hybridization Fluorescence labeled PCR fragments are applied to immobilized oligonucleotides representing SNP sequences. After stringent hybridization and washing conditions, fluorescence intensity is measured for each SNP oligonucleotide. Identificazione di mutazioni puntiformi (SNP) Allele-Specific Primer Extensions Primer Extensions with Terminators 25
Identificazione di mutazioni puntiformi (SNP) PCR/OLA (Oligonucleotide Ligation Assay) Ipotesi: T G Identificazione di mutazioni puntiformi (SNP) PCR/OLA (Oligonucleotide Ligation Assay) 26
Identificazione di mutazioni puntiformi (SNP) PCR/OLA (Oligonucleotide Ligation Assay) Identificazione di mutazioni puntiformi (SNP) PCR/OLA (Oligonucleotide Ligation Assay) 27
Identificazione di mutazioni puntiformi (SNP) PCR con primers fluorescenti Rodammina Identificazione di mutazioni puntiformi (SNP) PCR con primers fluorescenti Fluoresceina 28
Identificazione di mutazioni puntiformi (SNP) Identificazione di mutazioni in diversi siti intragenici Screening di mutazioni multiple in un unico gene β-talassemia: causata da mutazioni in uno dei vari siti suscettibili sul gene della β-globina => Riduzione della quantità di β-globina prodotta => Assenza della β-globina sintetizzata => Formazione di una proteina incompleta o mutata 29
1. Sintesi di sonde con code di poli(dt) ottenute tramite deoxyribonucleotidyltransferase 2. Spot su una membrana di nylon e cross-linking con UV 30
Microarrays DNA chips Migliaia di sonde (fino a 57.000) Diverse applicazioni - diagnosi e tipizzazione - risposta dell ospite al patogeno o a varie sostanze in studi di espressione genica Terminologia Probe (sonda): fissato su vetro 1) oligo sintetizzati in situ 2) DNA amplificati Target: in soluzione 1) cdna marcato con dye fluorescenti 2) crna biotinilato 31
Come funzionano i MICROARRAY Matrice solida miniaturizzata su cui sono immobilizzate migliaia di sequenze di DNA (sonde) in posizioni definite Analisi simultanea dell espressione di centinaia o migliaia di geni Ibridazione di molecole target marcate (cdna,crna) con le sonde complementari immobilizzate sul supporto solido 32
Come allestire i microarrays? Libreria di cloni Piastre di batteri DNA Sequenze Database + selezione sonde Prodotti di PCR immobilizzazione Come si svolge un esperimento di microarrays 33