Tecniche di biologia molecolare Utilizzi delle endonucleasi e polimerasi
4 PRINCIPALI TIPI DI ENZIMI AGISCONO SUL DNA: - NUCLEASI (idrolisi del legame fosfodiestere in oligonucleotidi) - LIGASI (formazione del legame fosfodiestere fra due oligonucleotidi) - TOPOISOMERASI (GIRASI, ELICASI) (variazione di superavvolgimenti) - POLIMERASI (polimerizzazione mediante la condensazione di nucleotidi)
Endonucleasi di restrizione batteriche Sito di taglio palindromico 5 GATATC 3 3 CTATAG 5 EcoRV (E. coli Restrict. Endonucl. V) Gli ER sono proteine omodimeriche, simmetriche che riconoscono un sequenza bersaglio simmetrica (sito palindromico), e tagliano entrambe i filamenti di DNA Inseriscono anse nel solco maggiore e scorrono lungo il doppio filamento di DNA fermandosi in corrispondenza al sito palindromico (riconoscono uno specifico pattern di basi). L interazione causa mutamenti conformazionali nell'enzima e nel DNA, che si piega - l'enzima richiede Mg ++, necessario per la sua attività; Ci sono tre tipi di ER: Tipo I Tipo II aspecifici; specifici per sequenze palindromiche Tipo III specifici e richiedono l idrolisi di ATP
le endonucleasi di restrizione tagliano entrambe i filamenti della molecola di DNA alcune tagliano in modo netto (BLUNT end) (es. Ecor V, SmaI) altre tagliano in modo sfilacciato (STICKY end) (es. BamHI, KpnI) Sito di taglio palindromico taglio netto (blunt) tagli sfilacciati (sticky)
Gli ER sono utilizzati per tagliare frammenti oligonucleotidici con precisione che poi possone essere inseriti in vettori per esempio i plasmidi trattati con lo stesso ER. Questi frammenti possono essere sequenze codificanti (es. geni senza introni) per farli amplificare e/o esprimere. Possono anche essere sequenziati Il plasmide (vettore) è trasfettato/trasformato in una cellula ospite per permettere il clonaggio molecolare dei frammenti (produzione multipla di copie identiche = amplificazione) Fragmentation: rottura controllata del filamento di DNA Ligation: inserimento mirato nel vettore Transfection: inserimento del vettore nella cellula Selection: selezione delle cellule correttamente trasformate
l inserimento del plasmide nel vettore è un processo stocastico può risultare in diversi prodotti, solo uno dei quali è utilizzabile è quindi necessario includere nella preparazione del plasmide caratteristiche che permettono di isolare il prodotto desiderato
+ - Electroporation
Le DNA ligasi Enzimi che congiungono catene di DNA - catalizzano la formazione di un legame fosofodiestere fra un ossidrile al 3' di un frammento con il fosfato sul 5' di un altro. DNA1 3'OH O ligasi - + O-P-O 5' DNA2 O- ATP (NAD+) PPi (AMP) O DNA1 3' O-P-O 5' DNA2 O - Agiscono su dsdna, chiudendo rotture su una delle due catene. ATP è usato come attivatore dagli eucarioti, NAD+ dai batteri. Si forma un intermedio nel quale una unità di AMP si lega al fosfato 5' di un frammento e lo attiva per la formazione del legame con OH sul 3 dell altro frammento. ligasi + ATP NH 2 PPi O - ligasi + O-P-O 5' DNA2 O- NH AM- P fosfoammide DNA1 3' O-P-O 5' DNA2 O O - DNA1 3'OH AM- P O -P-O 5' DNA2 O -
le DNA topoisomerasi Tipo I - rilassano il DNA superavvolto. Tagliando un solo filamento, e permettendo lo srotolamento dell altro e poi lo ricongiungono. Riducono localmente lo strain in tratti di doppia elica sovra- o sottoavvolti Tipo II (girasi) tagliano entrambe i filamenti e permettono il passaggio di un altro tratto della doppia elica attraverso il taglio. Un processo che richiede l idrolisi di ATP. Per entrambe i tipi, durante il taglio si forma un legame fosfoesterico con una tirosina enzimatica, ed è liberato l OH 5, che poi attacca la fosfotirosina dopo lo srotolamento. Le topoisomerasi e girasi sono necessarie durante la replicazione o trascrizione del DNA, per evitare crisi topologiche a monte e/o a vale del DNA localmente disavvolto.
DNA polimerasi e RNA polimerasi le DNA polimerasi richiedono un FILAMENTO STAMPO, a catena singola di DNA, sul quale agire, e sintetizza una catena esattamente complementare allo stampo (appaiamento Watson-Crick corretti fra la base entrante e quella dello stampo dntp richiedono anche una catena PRIMER (che può essere DNA o RNA) con un terminale 3'-OH libero sulla quale innestare il primo dntp. Il primer si lega alla catena stampo al sito di origine della sintesi. Le NA polimerasi raramente inserisce basi male appaiate (dominio 5 3 polimerasi molto fedele) e controlla l'appaiamento eliminando residui con basi appaiate incorrettamente (dominio 3 5 esonucleasico). La funzione 5'3 esonucleasi serve per rimuovere la sequenza primer alla fine della sintesi. DNA-dependent DNA polimerase (replicazione) richiedono primer DNA-dependent RNA polymerase (trascrizione) non richiedono primer. Non così precise RNA-dependent DNA polimerase (trascrittasi inverse) richiedono primer
La Trascrittasi Inversa e le librerie di cdna Il cdna è una copia retro-trascritta di un mrna. In effetti rappresenta solo la pare codificane di un gene (privo di sequenze promotrici o di introni) Per produrla si sfrutta una Trascrittasi inversa e le caratteristiche del mrna La trascrittasi è un RNA-dependent DNA polymerase e quindi necessita di un primer Si sfrutta la coda di poly(a) al terminale 3, ibridizzando con un primer poly(t) Si produce un ibrido DNA/RNA, e l RNA e rimosso con RNAsi (una nucleasi selettiva per RNA) Adesso è possibile utilizzare una DNA-dependent DNA-polymerase e primer poly(da) per sintetizzare l altro filamento. Eventualmente si può amplificare il cdna così prodotto mediante la tecnica del PCR Siccome tutti gli mrna estratti da una cellula hanno la coda poly(a) si ottiene una LIBRERIA genica. Questa può essere subclonata in batteri e sequenziata per ottenere i cosiddetti «Expressed Sequence Tag» (EST)
Molecular cloning insieme di metodi utilizzati per assemblare DNA ricombinante e dirigere la sua replicazione in una cellula ospite, inserendo nella cellula un vettore molecolare (plasmide, virale) che contiene il DNA d interesse. L espansione clonale della cellula permette: 1) l amplificazione del DNA (che può essere recuperato) ; 2) l espressione della proteine codificata dal DNA. Metodo convenzionale: 1) - estrazione di DNA genomico - preparazione di cdna da RNA - sintesi di un gene artificiale 2) Frammentazione con endonucleasi sprecifiche selective amplification 3) Amplificazione selettiva (es. con PCR) fragment isolate cellular DNA
4) Scelta della combinazione vettore/cellula ospite. Il vettore deve contenere: - un origine di replicazione (Ori) - uno o più siti di restrizione per endonucleasi specifiche dove introdurre il frammento - un gene marker che permette di selezionare le cellule ospite (gene essenziale) Multiple restriction (cloning) sites (MCS) marker reporter - un gene reporter per lo screening delle cellule trasfettate (es. effetto cromogenico) choose vector Marker: Il gene ampr codifica per l enzima -latamasi che idrolizza antibiotici -lattamici (ampicillina). Fornische resistenza ed è essenziale per crescere in terreno con ampicillina Reporter: Il gene lacz codifica per l enzima -galattosidasi che scinde legami glicosidici, es. per idrolizzare il lattosio (e che è inattivato nel batterio ospite). Usando come substrato X- gal, produce colore.
5) Inserimento del frammento nel vettore (un plasmide o cromosoma artificiale), utilizzando apposite endonucleasi e ligasi per es. inserire all interno del gene lacz 6) Introduzione del vettore nella cellula ospite (spesso E. coli) resa competente Trasfezione (cellule animali); trasformazione (batteri, lievito); trasduzione (vettore virale) 7) Screening e selezione delle cellule ospiti correttamente trasformate (solo se trasformate sono resistenti a ampicillina, solo se ricombinanti non si colorano) 8) Espansione clonale della cellula ospite (amplificazione) ed utilizzo
Restriction mapping: l'utilizzo di ER con diverse specificità permette di mappare un frammento di DNA, cioè di generare una serie caratteristica di frammenti, che risulta in un pattern elettroforetico tipico. Nella medicina forense, il DNA proveniente da diversi individui, per la presenza o assenza di siti di taglio diversi, da luogo a mappe uniche e distinguibili. 1) Isolare un frammento di DNA usando l ER EcoRI (es. Frammento di 2 kilobasi) 2) Clonare in plasmide (es. pbluescript, 3.0 kbasi, MCS per EcoRI e BamH1). + http://www.mun.ca/biology/ scarr/rflp_animation.gif 3) Trattare il plasmide con l altro ER (BamH1) - ci sono due possibilità: - l inserto non contiene un sito BamH1 solo una banda in SDS PAGE (5 kb) - l inserto contiene un sito BamH1 due bande in SDS-PAGE (x e y KB)
4) Gel con inserto che contiene un sito BamH1: Un taglio avviene a livello del sito nel plasmide Bluescript, accanto a quello per EcoRI (terminale del frammento) e uno interno al frammento stesso. - si ottengono due tipi d informazione: a) che l inserto contiene un sito BamHI b) che il sito BamHI è a 1.4 kb dal terminale (posizione del sito) sito BamH1 mappato
Utilizzo del il restriction mapping nel sequenziamento di DNA L informazione nella mappa di restrizione è utile per molte tecniche che manipolano il DNA Per esempio permettere di tagliare un segmento di DNA grande in frammenti più piccoli, e poi selezionarli per il sequenziamento L ultima generazione di sequenziatori agisce infatti su frammenti piccoli ( 100-400 basi) Il restriction mapping permette di confrontare i frammenti anche senza informazioni sulla sequenza. Per esempio, sapendo che due frammenti di 8 e 10 kb provengono dallo stesso pezzo di DNA cromosoma si vuole capire come si sovrappongono. Si determina quindi la mappa di restrizione con diversi ER Dalla distanza dei siti dai terminali noti si può dedurre la loro posizione e quindi dove i frammenti più grandi si sovrappongono. in questa maniera si possono scegliere i frammenti da sequenziare evitando costose duplicazioni
POLYMERASE CHAIN REACTION - PCR Una tecnica di biologia molecolare che consente la moltiplicazione (amplificazione) di frammenti di DNA o RNA dei quali si conoscano le sequenze nucleotidiche iniziali e terminali. RICHIEDE: DNA template con regione di DNA (target) da amplificare. Due primers che sono complementari ai terminali 3' dei filamenti senso and anti-senso. Taq polymerase o altra polimerasi con TM elevato e funzionamento ottimale a ca. 70 C. Soluzione tampone, che fornisce un ambiente chimico adatto a mantenerla stabile e attiva dntp Cationi divalenti, generalmente Mg 2+ o Mn 2+, e monovalente K +
POLYMERASE CHAIN REACTION - PCR
POLYMERASE CHAIN REACTION AMPLIFICAZIONE DI DNA GENOMICO o DI cdna Whole gene with introns Only coding DNA
POLYMERASE CHAIN REACTION PROTOCOLLO Doppio filamento di DNA denaturazione primer 1 2 3 Sequenza desiderata annealing & polimerizzazione Sequenza neosintetizzata 4 denaturazione 5 6 annealing & polimerizzazione 7 1) Portare temp. a 95 C e denaturare il doppio filamento di DNA. La sequenza che si vuole amplificare è denotata in rosso, ed è affiancata da sequenze note (giallo) 2) La miscela è raffreddata a 48-60 C (dipende da primer e stampo). I primer (verde) si legano alle sequenze complementari (giallo) in un processo di annealing) 3) Si aggiunge la polimerasi TAQ ( ) a 72 C e i desossinucleotidi-3p (, A,T,G,C) ed inizia il processo di sintesi polimerasica di DNA complementare allo stampo, sia della sequenza desiderata che di quella affiancante (celeste). 4) Si riporta a 95 C, entrambe i nuovi doppi filamenti si denaturano. Ne seguiamo solo uno (l altro è sbiadito) 5) Si ripete il ciclo di annealing come in (2) 6) Si ripete il ciclo di sintesi come in (3) sia sul filamento originale che quello nuovo 7) Il filamento indicato è identico a quello superiore del doppio filamento originale Rappresentazione ciclica del processo PCR (PCR.EXE)
DETERMINAZIONE DEI LIVELLI DI TRASCRIZIONE DI RNA METODO NORTHERN BLOT housekeeping gene (constitutively expressed) (e.g. G-3-P dehydrogenase) target gene
DETERMINAZIONE DEI LIVELLI DI TRASCRIZIONE DI RNA REAL TIME PCR Un metodo denominato anche PCR quantitativa che permette di amplificare e simultaneamente quantificare molecole di DNA o RNA. Dopo ogni ciclo di trascrizione (turno di amplificazione) l acido nucleico viene quantificato utilizzando sonde fluorescenti Può esser utilizzato per diagnostica o per determinare il livello di trascrizione di geni Uno dei metodi: TaqMan
sequenziamento del DNA sequenziatori di 1 generazione Metodo classico di SANGER: dideoxy terminator nucleotides dntp ddntp ddntp non può reagire polimerasi c dntp c c c c c c c c c c c c ddntp c c c c c c c c catena stampo primer catena trascritta
Metodo classico di SANGER: dideoxy terminator nucleotides Elettroforesi capillare VANTAGGI SVANTAGGI - Preciso - molto affidabile - Costo elevato - Efficiente, fino a1000 basi/corsa - laborioso (preparazione stampo difficile) - Versatile (Utile per altri tipi di analisi) - Permette di analizzare pochi campioni contemporaneamente (non è MP)
Shotgun sequencing Hierarchical shotgun 50-150 kb cloned in BAC Whole genome shotgun 2,10,50,150 kb cloned in vector
sequenziamento del DNA sequenziatori high-throughput Next Generation Sequencing (NGS) Bead method (emulsion PCR) Bridge method (surface PCR) Massively Parallel Sequencing (MPS)
BRIDGE AMPLIFICATION: cluster method with bridge PCR amplication Preparation Bridge amplification Complementary DNA strands Cut and flush one of the strands Cap and sequence 1) Prepare lawn of complementary oligo pairs 2) Seed DNA strand to be sequenced from a DNA Library and anneal to complementary linked oligo primer (green) 3) Build complementary strand and then denature, leaving an anchored complementary strand 4) This strand bends to anneal the other end to the other complementary oligo (yellow) forming a bridge 5) PCR produces double a stranded bridge. This denatures to two anchored strands (one complementary the other original) 6) The two strands then anneal to form two bridges etc., leading to (7) bridge amplifiaction 8) At the end of amplifiactaion many strands of both complementary and original sequences are present, but only the original sequence is sequenced. 9) The complementary strand is cut and flushed away, 10) The original strand is capped and sequenced using appropriate primer 11) Note that conditions are chosen so that each strand to be sequenced binds distant to other strands 12) This means that aplified strands are clustered in different parts of the surface
Emulsion PCR and BEAD enrichment 1) Prepare a DNA fragment library with all strands ending with the same adapter sequences 2) Prepare beads (~600 nm) with complementary oligonucleotides to the adapter on their surface 3) Mix beads and DNA fragments in an aqueous suspension in oil 4) Choose concentrations so that statistically each water drop has only one bead and one DNA strand 5) Carry out PCR within each droplet. Each cycle a complementary strand grows from the anchored oligonucleotide 6) At the end of PCR amplification, denature to leave only single-stranded DNA linked to the bead 7) Remove beads from emulsion and then place each bead in the well of 1000 nm a multi-well sequencing platform (only one 600 nm bead can enter into each 1000 nm well) 6) Carry out «ion torrent» or «pyro» sequencing. ph variation Ion torrent h pyroseq
Metodo ion torrent
METODI FGS (First generation sequencing) e NGS (Next Generation Sequencing) Method DNA Amplification Sequencing Chemistry Detection TYPE Sanger PCR Dideoxy termination + Capillary electrophoresis + fluorescence detection LTS 454 Bead PCR Pyro sequencing + dntp PPi light Luminescence emission MPS Illumina Bridge PCR Fluorescence release + dntp + Fluorescence emission MPS Ion Torrent Bead PCR H + release + dntp H + ph ph variation MPS LTS = low throughput system (only few sequences processed simultaneously) MPS = massively parallel sequencing (very many sequences processed at the same time it is a high throughpt system) NB 454, Illumna and Ion Torrent all determine the sequence as the polymerase catalized synthesis of the strand is proceeding so are «sequence through synthesis» methods (STS)