PROGETTO DNA CHIAVI IN MANO
La collaborazione con il Virgilio e il progetto dell IFOM Il progetto DNA chiavi in mano è un percorso pensato dal Centro di Ricerca internazionale IFOM per avvicinare i ragazzi al mondo della ricerca. Grazie alla collaborazione di un ricercatore della Bicocca, delle Docenti del Maxwell e del Virgilio e dell utilizzo delle attrezzature di tale Istituto, gli studenti della 4 ALST hanno potuto realizzare il progetto e lavorare per tre giornate sull unità base della vita: il DNA.
Le fasi del progetto Estrazione del DNA genomico dalla mucosa boccale Corsa elettroforetica su gel di Agarosio PCR (reazione a catena della polimerasi) Digestione enzimatica del DNA del fago λ con HIND III o EcoRI e corsa elettroforetica su gel di agarosio Pomeriggio al centro di ricerca IFOM di Milano e visita dei laboratori
Estrazione del DNA genomico dalla mucosa boccale Tramite spazzolino sterile si è estratto dalla mucosa boccale materiale genetico, riposto in provette e immerso in una soluzione per rompere le membrane e liberare il Dna legato alle proteine. Il materiale è stato miscelato e incubato a 100 per denaturare le proteine. L aggiunta di una nuova soluzione ha fatto precipitare le proteine rendendole insolubili. Centrifugando il tutto, i frammenti di membrana e le proteine (pellet) si sono depositati sul fondo e in superficie il surnatante contenente il DNA. Con l aiuto di una micropipetta, il DNA è stato poi trasferito in una provetta contenente isopropanolo freddo utile a far precipitare il Dna, essendo quest ultimo insolubile in alcool.
Fatto evaporare l isopropanolo IL DNA rimane visibile in soluzione con l aggiunta del benzetilene * e reso fluorescente grazie all intercalante. Un intercalante è una molecola di tipo planare in grado di inserirsi nei filamenti di DNA. Grazie alle loro proprietà idrofobe, gli agenti intercalanti sono in grado di inserirsi tra due basi azotate lungo i filamenti della doppia elica. *E stato utilizzato il benzetilene invece del bromuro di etidio che è cancerogeno
Ed ecco il risultato! La zona bianca che si vede in superficie è il nostro Dna boccale. Si è rimasti colpiti dalle piccolissime quantità con cui i ricercatori lavorano ogni giorno: si è prelevato quantità dell ordine dei μl (un milionesimo di litro).
Corsa elettroforetica su gel d agarosio La corsa elettroforetica è un metodo di separazione di campioni basato sulla diversa velocità di migrazione di particelle elettricamente cariche attraverso una soluzione tampone. I frammenti di Dna migrano verso il polo positivo perché il gruppo fosfato presente nella loro struttura li carica negativamente Abbiamo digerito il DNA di un determinato tipo di fago tramite l utilizzo di specifici enzimi di restrizione quali Hind III e EcoRI. Per l allestimento della cella elettroforetica abbiamo sigillato i lati di una vaschetta con nastro adesivo, inserito in essa un pettine per la creazione di pozzetti. Quindi abbiamo colato il gel di agarosio nella vaschetta e aspettato che si solidificasse(il gel diventa opaco solidificando).eliminare il pettine ed il nastro quindi inserire la vaschetta nella cella elettroforetica. Caricare in ogni pozzetto i campioni di DNA digerito ed i controlli negativi.
Con l aiuto di un ricercatore abbiamo preparato il gel di agarosio al 1%. L agarosio è un polisaccaride che agisce come una ragnatela attraverso la quale passeranno i frammenti di Dna. Allestita la cella elettroforetica ( supporto specifico per l esperimento) e creato i pozzetti dopo solidificazione del gel, abbiamo aggiunto una soluzione tampone fino a ricoprire completamente il gel : la vaschetta era pronta per la corsa del Dna campione.
Tramite micropipetta (..e polso fermo!!) abbiamo posizionato in ogni pozzetto 20μl di campione di Dna e fatto correre per 25 minuti a 120 V.
PCR: reazione a catena della polimerasi La PCR è una tecnica di biologia molecolare che consente, partendo da un piccolissimo campione di DNA, di sintetizzarne in vitro milioni di copie del segmento in poche ore.con una successione di riscaldamenti e raffreddamenti la Dna polimerasi riesce, partendo da serie di nucleotidi conosciuta (i primer) complementare al Dna di partenza, a duplicare più volte il campione di Dna. 10
La miscela di reazione che abbiamo preparato contiene piccolissimi volumi di materiale perché la Pcr lavora in piccole quantità. La soluzione contiene: Sequenza di DNA che si vuole amplificare Sequenza di nucleotidi che funge da primer, dntps Gli NTPs (o nucleosidi trifosfato) sono molecole che servono a fornire l'energia necessaria per far avvenire la duplicazione (durante la PCR). Tali molecole sono composte da uno zucchero a cinque atomi di carbonio (deossiribosio o ribosio) legato ad una base azotata e a tre gruppi fosfato. Per perdita di gruppi fosfato possiamo ottenere NDPs (nucleosidi difosfato) o NMPs (nucleosidi monofosfato). Sequenza di nucleotidi che funge da primer, dntps.
Abbiamo inserito la provetta nel termociclatore, strumento che ci permette di eseguire più cicli di riscaldamento ( per separare i due filamenti della doppia elica di DNA) e raffreddamento (per permettere ai primer di attaccarsi alle loro sequenze complementari ) con tempi diversi. Le molecole di DNA polimerasi, riconosciute le sequenze innesco, cominciano ad aggiungere nucleotidi a partire da siti in cui si sono attaccate tali sequenze. Abbiamo ripetuto il processo una ventina di volte.
Terminata la corsa abbiamo visualizzato su una lampada a luce blu, le copie del Dna prodotte con la PCR Abbiamo allestito la cella elettroforetica con il gel di Agarosio e fatto la corsa elettroforetica disponendo i frammenti di DNA in un campo elettrico generato dalla differenza di potenziale applicata a due elettrodi, migrati verso il polo positivo perché carichi negativamente.
Digestione enzimatica del DNA del fago λ con HIND III ed EcoRI Il DNA usato è quello del fago lambda: è il substrato che verrà tagliato dall enzima Hind III in punti ben precisi. Poichè è conosciuta la dimensione in paia di basi di ogni banda, si può usare il DNA del fago lambda come marcatore di peso molecolare per trovare la dimensione approssimativa di bande ignote tramite un confronto (se composte da un numero simile di paia di basi le bande si fermeranno alla stessa altezza del gel). 14
L enzima utilizzato è l Eco RI, enzima di restrizione capace di tagliare il Dna ogni volta che incontra una sequenza di basi azotate prestabilita. Il tampone (presente nella cella elettroforetica) serve per ottenere un ambiente di reazione stabile e gli ioni Mg ++ come cofattori. I due enzimi utilizzati possiedono due diversi siti di restrizione. Il frammento di DNA carichi negativamente per i residui di fosfato migrano attraverso la griglia molecolare di agarosio verso il polo positivo. L enzima EcoRI taglia ogni volta che incontra la sequenza: CTTAAG (o la sua complementare). Il taglio verrà quindi effettuato tra la A e la G.
maggiore è la corsa del campione minore sarà il numero di coppie di nucleotidi costituenti e più facile sarà il passaggio attraverso la fitta rete di Agarosio. Tramite il transilluminatore abbiamo potuto leggere i risultati della nostra corsa. Comparando i risultati con campioni standard siamo riusciti ad avere una misura indicativa dei tratti di Dna che abbiamo fatto correre:
Visita ai laboratori di ricerca Alla fine dell esperienza, ma non per ultima di importanza, abbiamo visitato i laboratori dei centri di ricerca internazionali dell IFOM (istituto FIRC di oncologia molecolare). Siamo rimasti un po stupiti perché ci aspettavamo di vedere gli enormi stanzoni che si vedono nei film; invece per ogni ricercatore è previsto un piccolo banco di lavoro con mille strumenti e reagenti, mentre in camere apposite sono riposte attrezzature più ingombranti e pericolose. Al termine della visita, abbiamo interrogato le guide sui programmi di ricerca attuali e iniziative future, sulle opportunità di lavoro, riuscendo a capire come e dove operano i giovani scienziati e compreso cosa vuol dire essere ricercatore. Il mondo della ricerca ci è parso più vicino!
Le nostre impressioni Nonostante il nostro laboratorio sia molto fornito, questa esperienza è stata molto positiva perché abbiamo utilizzato attrezzature particolari e compreso come si lavora nei laboratori di ricerca. Supportati anche dalle insegnanti e da un giovane ricercatore che ci ha seguito nelle attività ed aiutato a comprendere meglio ciò che stavamo facendo, il progetto è servito a realizzare e rendere più efficace ciò che avevamo appreso a livello teorico ed avvicinarci al mondo professionale della ricerca e della sperimentazione Scientifica. 18
AL LAVORO!!! 19
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Realizzato dalla 4 A liceo scientifico tecnologico a.s. 2012-2013 Docenti: Nadia Galvagno Pasqua Losciale 21