Corso Micropropagazione Prof. O. Conti. micropropagazione. Caratteri generali

Transcript

1 micropropagazione Caratteri generali

2

3 Propaggine Corso Micropropagazione Prof. O. Conti

4 Cos e la micropropagazione La micropropagazione è una tecnica che permette la propagazione vegetativa di genotipi selezionati in condizioni di sterilità. Allo scopo di ottenere una rapida moltiplicazione partendo da un espianto, viene indotta la proliferazione di germogli in un mezzo di coltura idoneo, composto di sali minerali, vitamine, zuccheri e ormoni.

5 Vantaggi della micropropagazione A) Rapidità della propagazione: partendo da una piccola gemma, in un anno si possono ottenere anche un milione di piantine; B) Risanamento da tutte le infezioni patogene, siano essi batteri, funghi e anche virus. Il materiale moltiplicato in vitro può essere definito virus-esente ; C) Riduzione dei costi di produzione unitaria rispetto ai metodi tradizionali; d) Possibilità di propagare per via vegetativa specie e varietà difficilmente moltiplicabili con i metodi tradizionali; e) Miniaturizzazione dei germogli che permette di occupare spazi molto ridotti. Per questo motivo risulta molto vantaggiosa la conservazione del germoplasma in vitro. f) Produzione svincolata dall andamento stagionale in quanto eseguita in ambiente completamente condizionato: ciò permette di programmare la produzione con un certo margine di sicurezza sulla capacità di riuscita; g) Uniformità delle piantine prodotte, più rispondenti alle esigenze del vivaisti e, alla fine, dei coltivatori; h) Diminuzione dei tempi richiesti dal miglioramento genetico. Infatti è possibile accelerare di diversi anni l introduzione nel mercato di nuove varietà.

6 Svantaggi della micropropagazione A) Probabilità di produrre piantine con variazioni genetiche rispetto alla pianta madre. Ciò è dovuto agli elevati tassi di moltiplicazione che provocano anche una rapida moltiplicazione di eventuali genotipi variati; b) Impossibilità di micropropagare alcune specie C) Costi iniziali di impianto di un laboratorio abbastanza elevati, dovuto all acquisto di attrezzature piuttosto costose; d) Assenza di un protocollo standard per tutte le specie e) Necessità di impiegare personale qualificato, specializzato ed addestrato appositamente;

7 Quali parti vengono micropropagate Corso Micropropagazione Prof. O. Conti

8

9 APICE VEGETATIVO (MERISTEMA PRIMARIO) Corso Micropropagazione Prof. O. Conti Cellule meristematiche all'apice di una gemma vegetativa a forma di cono, che originano i tessuti della pianta; in genere sono protetti ed al di sotto di questi apici sono presenti le zone di differenziazione.

10 Cambio (meristema secondario) Tessuto costituito da cellule indifferenziate da cui si originano i tessuti definitivi. I meristemi sono considerati tali sia quando sono in piena attività, con le cellule in attiva divisione, durante i periodi di accrescimento, sia quando attraversano periodi di riposo.

11 Nodo singolo - microtalee Si tratta di utilizzare delle piccole parti di pianta che siano dotate almeno di una gemma

12 Morfogenesi Corso Micropropagazione Prof. O. Conti MORFOGENESI: processo di rigenerazione che avviene grazie a processi avventizi. Non è un processo che avviene in tutte le specie e in tutte le varietà di una specie; le cellule che possono dar luogo a morfogenesi sono dette COMPETENTI. La competenza è verso una specifica via di sviluppo (se è competente x sviluppo dell embrione somatico non lo è x lo sviluppo del germoglio) caulogenesi - germogli Rizogenesi - radici Embriogenesi somatica embrioni somatici (embrioni con caratteristiche uguali alla pianta madre) Inoltre può essere: -diretta: da cellule differenziate di tessuto senza che prolifichi tessuto indifferenziato -indiretta: da cellule de-differenziate di callo quindi proliferazione di tessuto indifferenziato CALLO: massa di tessuto amorfo formato da cellule non specializzate che si moltiplicano in maniera disorganizzata. Si può ottenere da cellule in coltura o da espianti di tessuto sotto lo stimolo di regolatori di crescita endogeni oche causano il de-differenziamento; dal callo si può rigenerare la pianta. CALLO

13 Scelta del materiale di partenza Scelta del materiale di partenza Una volta decisa la specie o la varietà che si vuole micropropagare, risulta necessario scegliere la pianta da cui si intende eseguire l espianto: la cosiddetta pianta madre. Apparentemente tale dettaglio può sembrare insignificante, in realtà è di fondamentale importanza. Con la micropropagazione è sufficiente una sola gemma per produrre in un anno diverse centinaia di migliaia di piantine, quindi un errata valutazione iniziale delle caratteristiche genetiche e sanitarie della pianta madre sarebbe disastrosa, in quanto l errore iniziale verrebbe replicato a dismisura. La scelta della pianta madre deve essere molto accurata e possibilmente su piante accessibili ed individuabili in qualsiasi momento.

14 FASI DELLA MICROPROPAGAZIONE 1. Preparazione e sterilizzazione del mezzo di coltura 2. Prelievo e preparazione degli espianti 3. proliferazione degli espianti 4. Allungamento e RADICAZIONE dei germogli 5. acclimatamento e trapianto. Corso Micropropagazione Prof. O. Conti

15 TERRENI DI COLTURA Corso Micropropagazione Prof. O. Conti Fase 1: Preparazione e sterilizzazione del mezzo di coltura Sono dei substrati contenenti diverse sostanze nutritive (o in alcuni casi TOSSICHE) che vengono utilizzati per la crescita di organismi di diversa tipologia (batteri, funghi, vegetali ecc). Possono essere 1. PREPARAZIONE E STERILIZZAZIONE DEL MEZZO DI COLTURA LIQUIDI: sono chiamati BRODI (BROTH) SOLIDI: contengono AGAR.

16 Fase 1: Preparazione e sterilizzazione del mezzo di coltura 1. PREPARAZIONE E STERILIZZAZIONE DEL MEZZO DI COLTURA

18 Fase 1: Preparazione e sterilizzazione del mezzo di coltura Cosa contiene un substrato 1. PREPARAZIONE E STERILIZZAZIONE DEL MEZZO DI COLTURA Gelling agents: Agar, agarose, gellan gum Regolatori di crescita (fitormoni) Elementi minerali (17 elementi essenziali) Fonte d energia e di carbonio (saccarosio) Vitamine Composti organici Acqua ph ( ) 18

19 Fase 1: Preparazione e sterilizzazione del mezzo di coltura 1. PREPARAZIONE E STERILIZZAZIONE DEL MEZZO DI COLTURA agar Serve per solidificare i terreni di coltura È un polisaccaride contenente zolfo estratto da un alga marina. Reperibile in commercio in forma essiccata pura, si disidrata facilmente. Ci sono vari tipi di agar che hanno proprietà fisiche diverse. Non è un nutriente, ma utilizzato come agente solidificante nei terreni di coltura. Dal punto di vista chimico è un galattano, carboidrato complesso formato da molecole di galattosio. Liquefazione a 97/100 C; solidificazione a 42/ 45 C I terreni agarizzati possono essere incubati a tutte le temperature. E insolubile a temperatura ambiente; il completo scioglimento avviene in autoclave

20 Fase 1: Preparazione e sterilizzazione del mezzo di coltura 1. PREPARAZIONE E STERILIZZAZIONE DEL MEZZO DI COLTURA L uso dell agar permette di dare al terreno la forma voluta, versandolo ancora liquido nel contenitore più idoneo e lasciandolo solidificare Inoltre: non è metabolizzato dalla gran parte dei batteri; non manifesta alcuna tossicità;

21 Regolatori di crescita ESSENZIALI Le auxine Le citochinine NON ESSENZIALI Le gibberelline (GA) L acido abscissico (ABA) 1. PREPARAZIONE E STERILIZZAZIONE DEL MEZZO DI COLTURA L etilene 21

22 Fase 1: Preparazione e sterilizzazione del mezzo di coltura Regolatori di crescita Auxine 1. PREPARAZIONE E STERILIZZAZIONE DEL MEZZO DI COLTURA Essenziali (non sono noti effetti mutageni) Il solo composto naturale è lo IAA (Indole-3-Acetic Acid). Altri prodotti sintetici sono NAA, IBA, 2,4-D, 2,4,5-T, Pichloram) meno costosi e più stabili Stimolazione della distensione cellulare in fusti e coleoptili Promuovono la radicazione Sono sintetizzate nei meristemi, specialmente in quelli apicali (inibizione della crescita delle gemme laterali) 22

23 Fase 1: Preparazione e sterilizzazione del mezzo di coltura 1. PREPARAZIONE E STERILIZZAZIONE DEL MEZZO DI COLTURA Regolatori di crescita Citochinine Essenziali (non sono noti effetti mutageni) Un solo composto naturale la Zeatina; analoghi sintetici sono: Benzyladenine (BA) e Kinetin Stimola la divisione cellulare Promuove la formazione di gemme avventizie Sono sintetizzate nel meristema radicale e trasportate nel floema sotto forma di Zeatin-riboside 23

24 Fase 1: Preparazione e sterilizzazione del mezzo di coltura Corso Micropropagazione Prof. O. Conti Auxine Alte Formazione di radici dopo il taglio Embriogenesi Formazione di radici avventizie Induzione a callo Formazione di germogli avventizi Crescita di germogli ascellari Bilancio ormonale Citochinine Basse 1. PREPARAZIONE E STERILIZZAZIONE DEL MEZZO DI COLTURA Concentrazione ormonale esempio IBA (auxine) mg/lt BA (citochinine) mg/lt Moltiplicazione 1 1 Allungamento 1 0,2 Radicazione 2 0 Basse 24 Alte

25 Fase 1: Preparazione e sterilizzazione del mezzo di coltura Corso Micropropagazione Prof. O. Conti Auxine Alte Bilancio ormonale Citochinine 1. PREPARAZIONE E STERILIZZAZIONE DEL MEZZO DI COLTURA Basse Basse Formazione di radici dopo il taglio Embriogenesi Formazione di radici avventizie Induzione a callo Formazione di germogli avventizi Crescita di germogli ascellari 25 Alte

26 Fase 1: Preparazione e sterilizzazione del mezzo di coltura 1. PREPARAZIONE E STERILIZZAZIONE DEL MEZZO DI COLTURA Rapporto auxine/citochinine 26

27 Fase 1: Preparazione e sterilizzazione del mezzo di coltura 1. PREPARAZIONE E STERILIZZAZIONE DEL MEZZO DI COLTURA Vitamine Un ampio range di vitamine sono disponibili e possono essere usate Generalmente, più è piccolo l espianto, più appropriata deve essere la scelta della/e vitamine Viene spesso usato Un cocktail di vitamine L inositolo di solito deve essere aggiunto a maggiori concentrazioni (100mg/l)

28 Fase 1: Preparazione e sterilizzazione del mezzo di coltura Corso Micropropagazione Prof. O. Conti 1. PREPARAZIONE E STERILIZZAZIONE DEL MEZZO DI COLTURA Composti inorganici Macroelementi (>mg/l di N, P, K, Ca, Mg e S) e microelementi (<mg/l Fe, Cu, Mn, Co, Mo, B, I, Zn, Cl e alcune volte Al, Ni e Si). Disponibili formulazioni commerciali in polvere 28

30 Fase 1: Preparazione e sterilizzazione del mezzo di coltura ph 1. PREPARAZIONE E STERILIZZAZIONE DEL MEZZO DI COLTURA Il ph influenza - La solubilità dei Sali - L assorbimento degli elementi nutritivi - La solidificazione dell agar Il ph ottimale deve essere compreso tra 5,2 e 5,8

31 Fase 1: Preparazione e sterilizzazione del mezzo di coltura Una volta preparato, il substrato ed i contenitori, oltre ad altro materiale da sterilizzare, viene messo in autoclave a 120 C per 20 minuti ad 1 atm Dopo la sterilizzazione, il terreno di coltura viene versato in contenitori sterilizzati

32 Fase 2: PRELIEVO E PREPARAZIONE DEGLI ESPIANTI 1. PREPARAZIONE E STERILIZZAZIONE DEL MEZZO DI COLTURA La base di partenza del processo di micropropagazione è l espianto, porzione di pianta che può essere rappresentata: - dalla sola cupoletta meristematica ( mm) - apice vegetativo di un germoglio - una gemma dormiente.

33 Fase 2: PRELIEVO E PREPARAZIONE DEGLI ESPIANTI Classificazione delle colture vegetali 1. PREPARAZIONE E STERILIZZAZIONE DEL MEZZO DI COLTURA Le colture vegetali si dividono in: Colture di organi che riguardano organi isolati che derivano da radici e apici, primordi fogliari, primordi e parti immature dei fiori e frutti immaturi; Colture di embrioni che riguardano embrioni isolati maturi o immaturi. Colture di calli che prendono origine da una disordinata proliferazione di cellule provenienti da espianti di organi vegetali.

34 Fase 2: PRELIEVO E PREPARAZIONE DEGLI ESPIANTI Gli espianti, prima di essere posizionati sul mezzo di coltura devo essere a loro volta sterilizzati; utilizzando prodotti cimici e metodologia tale da uccidere i microorganismi ma non il tessuto vegetale. La presenza di cere, peli, ecc possono rendere difficoltoso il contatto del disinfettante con il tessuto. In alcuni casi può essere consigliabile un prelavaggio accurato con acqua a cui si aggiunge un detergente 1. PREPARAZIONE E STERILIZZAZIONE DEL MEZZO DI COLTURA L alcol etilico al 70% non garantisce l eliminazione dei microorganismi ed è seguita dall uso dell ipoclorito; concentrazioni superiori sono tossiche per i tessuti superficiali

35 Fase 2: PRELIEVO E PREPARAZIONE DEGLI ESPIANTI 1. PREPARAZIONE E STERILIZZAZIONE DEL MEZZO DI COLTURA La scelta dell agente sterilizzante e il tipo di impiego dipendono dalla condizione del materiale di partenza: più il tessuto è giovane ed erbaceo, più blanda dovrà essere la sterilizzazione; al contrario, un tessuto legnoso a gemma dormiente può sopportare una sterilizzazione più pesante. Dopo avere immerso il materiale di partenza nella soluzione sterilizzante ed aver aspettato i relativi tempi, occorre sempre eseguire un risciacquo con acqua sterile, almeno due o tre volte, per eliminare eventuali residui del trattamento chimico. Per fare questo si deve utilizzare acqua distillata sterile, lasciano a bagno gli espianti per minuti nell ultima acqua di risciacquo. Il prelievo dell espianto deve avvenire sotto cappa a flusso laminare.

36 Fase 2: PRELIEVO E PREPARAZIONE DEGLI ESPIANTI Questa operazione è compiuta sotto cappe a flusso laminare orizzontale, in condizioni di asepsi I germogli delle giovani piante sono tagliate trasversalmente in modo da fornire talee di 5-6 cm dotate di un nodo e di una gemma ascellare (espianti). gli espianti vengono immediatamente collocati, in recipienti sterili (di solito vasi di vetro) contente il mezzo di coltura solidificato e sterilizzato. 1. PREPARAZIONE E STERILIZZAZIONE DEL MEZZO DI COLTURA Corso Micropropagazione Prof. O. Conti

37 Fase 2: PRELIEVO E PREPARAZIONE DEGLI ESPIANTI Una volta sterilizzato, il materiale vegetativo viene messo nel terreno di coltura, chiuso con il tappo sterile e parafilm; subito dopo il materiale viene posizionato nelle camere di crescita 1. PREPARAZIONE E STERILIZZAZIONE DEL MEZZO DI COLTURA

38 Fase 2: PRELIEVO E PREPARAZIONE DEGLI ESPIANTI Le camere di crescita 1. PREPARAZIONE E STERILIZZAZIONE DEL MEZZO DI COLTURA Le camere di crescita sono delle apposite aree dove avviene la regolazione di luce e temperatura La luce influenza il processo fotosintetico e di morfogenesi; i migliori effetti si ottengono con la luce bianca con luminosità ottimale tra 1000 e 3000 lux; in fase di radicazione sono necessari almeno 3000 lux; le condizioni standard sono: C Fotoperiodo 16 ore luce con lampade fluorescenti a luce bianca Il lux (simbolo lx) è l'unità di misura per l'illuminamento del S.I. Un lux è pari a un lumen per metro quadrato. Alcuni dati di illuminamento per dare un'idea di quanto vale un lux: la luce del Sole mediamente varia tra i lx (32 klx) e i lx (100 klx); sotto i riflettori degli studi televisivi si hanno circa lx (1 klx); in un ufficio luminoso si hanno circa 400 lx; la luce della Luna è pari a circa 1 lx; Corso Micropropagazione Prof. O. Conti

39 Fase 3: Proliferazione degli espianti 1. PREPARAZIONE E STERILIZZAZIONE DEL MEZZO DI COLTURA Una volta ottenuto un espianto sterile, viene stimolata la formazione di nuove gemme. La proliferazione, per germogliazione ascellare o avventizia, ha come scopo l ottenimento di un notevole numero di germogli nel più breve tempo possibile. Quando l espianto all interno della provetta ha iniziato a svilupparsi e a proliferare, è opportuno trapiantarlo in un contenitore più capiente che permetta di accelerare il processo propagativo. Il tutto avviene sotto cappa a flusso laminare, mediante l uso di pinze e bisturi passati in alcol e poi sterilizzati alla fiamma. Ogni giorni i germogli vengono selezionati e divisi, quindi trapiantati in un mezzo di coltura fresco. Il trasferimento in un nuovo substrato colturale è chiamato sub-coltura.

40 Fase 4: allungamento e radicazione dei germogli allungamento 1. PREPARAZIONE E STERILIZZAZIONE DEL MEZZO DI COLTURA Si tratta di una fase intermedia che ha lo scopo di predisporre i germogli radicazione. Risulta indispensabile solo nel caso in cui il materiale dopo ripetuti cicli di moltiplicazione, sia eccessivamente miniaturizzato per poter essere radicato; spesso però è indispensabile per ottenere germogli ben sviluppati, con stelo allungato e lamina fogliare distesa. L allungamento viene eseguito trasferendo i germogli in un sub-strato di coltura in cui viene ridotta la dose di citochinine rispetto al mezzo utilizzato in moltiplicazione aumentando quella di auxine. La fase di allungamento dura dai 10 ai 15 giorni in sala di crescita ad una temperatura di C. L intensità luminosa dovrebbe essere diminuita rispetto alla moltiplicazione in modo da ottenere un effetto di eziolatura che può favorire la fase della radicazione. Concentrazione ormonale esempio IBA (auxine) mg/lt BA (citochinine) mg/lt Moltiplicazione 1 1 Allungamento 1 0,2 Radicazione 2 0

41 Fase 4: allungamento e radicazione dei germogli Radicazione 1. PREPARAZIONE E STERILIZZAZIONE DEL MEZZO DI COLTURA La radicazione è quella fase della micropropagazione in cui si induce il processo di rizogenesi in un germoglio in vitro La radicazione (che in qualche specie è spontanea) deve essere indotta. L induzione avviene tramite l esposizione della parte basale del germoglio a concentrazioni variabili di auxina ed in assenza di citochinina che ne inibisce la formazione Concentrazione ormonale esempio IBA (auxine) mg/lt BA (citochinine) mg/lt Moltiplicazione 1 1 Allungamento 1 0,2 Radicazione 2 0

42 Fase 5: Acclimatamento e trapianto 1. PREPARAZIONE E STERILIZZAZIONE DEL MEZZO DI COLTURA In questa fase le piantine vengono tolte delicatamente dal substrato di coltura sottoponendo a - Lavaggio in acqua corrente - Trapianto in un substrato composto da torba e perlite - E necessario che le piantine non si disidratino troppo quindi si posizionano in ambiente senza correnti d aria, con umidità relativa del 90% (copertura con telone di plastica. - La temperatura non deve superare i C - Dopo circa 10 gg si scoprono gradualmente fino a portarle nelle condizioni di umidità relativa ambientali nei successivi 8-10 gg - Entro un mese dal trapianto, le piante possono essere traferite in pieno campo