Circuiti sintetici II Memorie ed Oscillatori

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1 Università degli studi di Siena Dipartimento di Chirurgia e Bioingegneria Circuiti sintetici II Memorie ed Oscillatori Simone Furini Gruppo Nazionale di Bioingegneria XXIX Scuola Annuale BIOLOGIA SINTETICA, Bressanone, Settembre 2010 Memorie ed Oscillatori in Natura Differenziamento cellulare Memoria di stimoli passati Ritmo circadiano Sincronizzazione con il ciclo giorno-notte Sincronizzazione con l ambiente Oscillazioni a livello cellulare Bressanone GNB

2 Fattori di trascrizione Equazioni Memorie a retroazione positiva Memorie a mutua inibizione Oscillatori ad anello Oscillatori a rilassamento Ruolo della modellistica matematica nella fase di progettazione di circuiti sintetici Fattore di Trascrizione Proteina che regola il rateo di trascrizione di uno o più geni ATTIVATORI REPRESSORI 1 α 0 + α 1+ x x 50 n α 0 + α x n x n n + x 50 Bressanone GNB

3 Circuito a Retroazione Positiva Gene x posto sotto il controllo di un promotore, P, regolato dai prodotti del gene x stesso Il circuito ha due possibili stati di equilibrio ON= gene x altamente espresso, il promotore P lavora nella regione di massima trascrizione, ed il circuito si mantiene ad alti livelli di concentrazione di x OFF= gene x espresso a livello basale, il ramo di retroazione resta inattivo, ed il circuito si mantiene a livelli basali di concentrazione di x Determinare le condizioni in cui il sistema ha due punti di equilibrio stabile (Memoria Binaria) Punti di Equilibrio dx Rateo di sintesi Velocità di degradazione dt = dx dt = α x n x n n + x + α 0 βx 50 dx dt = 0 α 0 β + x = α β x n x n n + x 50 Bressanone GNB

4 Quali sono le condizioni che garantiscono 3 intersezioni (2 punti di equilibrio stabile)? 1) Cooperatività del legame attivatore-operatore n > 4x 50 α β 2) Rateo di sintesi basale 3) Affinità attivatore-operatore βx 50 α < α 0 < βx 50 α 0 β < x 50 < α 0 + α β Bressanone GNB

5 S = segnale esterno in grado di regolare la forza della retroazione positiva IPOTESI SEMPLIFICATIVA è possibile controllare direttamente il valore di x 50 Le cellule si dividono un due popolazioni, rispettivamente ad alta e bassa fluorescenza (ON/OFF) Le fluoerescenza varia in modo continuo nella popolazione, con valore medio dipendente dalla concentrazione di doxiciclina Bressanone GNB

6 In assenza di doxiciclina il circuito è nello stato OFF. La retroazione positiva non è attiva OFF ( x 50 > x 50 ) A seguito dello stimolo di doxiciclina compare il secondo stato stabile, ma la transizione allo stato ON non è mai completa (x 50 nella regione di bistabilità) Le transizioni allo stato ON in presenza di doxiciclina sono complete e irreversibili Maturazione Ovociti di Xenopus Uscita dalla fase di arresto G2, e completamento della prima divisione meiotica IRREVERSIBILE COMPLETO Bressanone GNB

7 Memoria a Mutua Inibizione Il circuito può avere due stati stabili ON/OFF= elevata concentrazione dei prodotti del gene x, la sintesi del gene y è inibita OFF/ON= elevata concentrazione dei prodotti del gene y, la sintesi del gene x è inibita S R Output 0 0 Memorizza stato precedente 1 0 Q = Q = Stato proibito Modello Matematico dx dt = dy dt = Rateo di sintesi(y) Velocità di degradazione Rateo di sintesi(x) Velocità di degradazione dx dt = α x 1+ y β n xx y 50 dy dt = α y 1+ x m β y y x 50 Bressanone GNB

8 Punti di Equilibrio dx dt = 0, dy dt = 0 ( ) ( ) n α x = x /β x 1+ y / y 50 α y /β y y = 1+ x / x 50 ( ) ( ) m Determinare i valori dei parametri che garantiscono la presenza delle tre condizioni di equilibrio 1) Cooperatività dei legami repressore-operatore E necessario che il legame repressore-operatore sia di tipo cooperativo n, m > 1 Bressanone GNB

9 Repressore Lac 2) Ratei di sintesi e velocità di degradazione Uguagliando i coefficienti angolari delle rette tangenti nei punti di equilibrio è possibile ricavare gli intervalli nello spazio dei parametri in cui il sistema è bistabile Bressanone GNB

10 α x β x = α y β y Rami di retroazioni bilanciati Controllo del Circuito In assenza di stimoli esterni il sistema memorizza lo stato Bressanone GNB

11 IPTG Oscillatori ad Anello x ON y OFF z ON x OFF y ON dx dt = dy dt = dz dt = α 1+ z n x α 1+ x n y α 1+ x n z Questo sistema di equazioni differenziali non presenta oscillazioni auto-sostenute, per nessuna combinazione dei parametri Il comportamento oscillatorio è legato alla presenza di ritardi lungo l anello di retroazione Bressanone GNB

12 Ritardi nella Sintesi Proteica La produzione di proteina attiva richiede un intervallo temporale significativo Folding Oligomerizzazione Fosforilazione IPOTESIL unico ritardo significativo è la sintesi di mrna m i = concentrazione mrna del gene i p i = concentrazione proteina codificata dal gene i Ý m i = p Ý i = Rateo Trascrizione Rateo Degradazione mrna Rateo Traduzione Rateo Degradazione proteina dm i dt dp i dt = α 1+ p j n m i = β( p i m i ) i = x, y,z j = z, x, y Bressanone GNB

13 Punti di Equilibrio dm i dt dp i dt i = x, y,z = α 1+ p j n m i = β( p i m i ) dm dt = dp dt = 0 j = z, x, y IPOTESI SEMPLIFICATIVA I parametri n, α e β sono gli stessi per i tre blocchi del circuito All equilibrio le concentrazioni di mrna e proteina devono essere le stesse per Ie tre componenti Il sistema ha un unico punto di equilibrio p = α 1+ p n Analisi Stabilità dm i dt dp i dt i = x, y,z = α 1+ p j n m i = β( p i m i ) j = z, x, y det(λi A) = 0 Ricerca Autovalori Linearizzazione nell intorno del punto di equilibrio β fisso, α variabile dm i dt = d α n dp j 1+ p j dp i dt = β ( p m i i) i = x, y,z eq m i j = z, x, y Coppia di autovalori complessi coniugati a parte reale positiva Bressanone GNB

14 Analisi Stabilità (A) (B) (A) (B) (C) (C) Ratei di sintesi elevati Elevata cooperatività del legame operatore-repressore Bressanone GNB

15 Multivibratore Astabile Maggiore resistenza al rumore rispetto all oscillatore ad anello Bressanone GNB