Resina a scambio ionico HyperCel STAR AX
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1 Life Sciences USD 231(2) Resina a scambio ionico HyperCel Resina cromatografica a scambio anionico ad alte prestazioni, utilizzabile a medie ed elevate conducibilità Resina cromatografica a scambio anionico, idonea per applicazioni su scala industriale, progettata per essere utilizzata a medie ed elevate conducibilità (tra 2 e 1 ms/cm), tipicamente con soluzioni madre biologiche non diluite (ad esempio surnatanti per colture di cellule di mammifero, E. coli, plasma ed altri), utilizzabile per la purificazione di proteine idonea sia per cromatografia positiva che negativa. Filtration. Separation. Solution.SM
2 La resina cromatografica a scambio anionico HyperCel, prodotta su larga scala, soddisfa il fabbisogno degli utilizzatori industriali ed i requisiti delle autorità regolatorie. Un file di supporto normativo (RSF) è a disposizione degli utenti per assisterli nello sviluppo delle procedure di validazione. Questo tipo di resina offre: ` ` Elevata capacità di legame dinamico (DBC) a bassi tempi di permanenza (2 minuti o inferiori) ` ` Captazione diretta delle proteine o rimozione delle impurità da materie prime biologiche non diluite a conducibilità moderate o elevate ` ` Eccellenti proprietà di flow rate per il rapido trattamento delle materie prime biologiche ` ` Specifica selettività in un ampio range di conducibilità (2 1 ms/cm) ` ` Migliore economia di processo La resina HyperCel è composto da una matrice rigida di cellulosa, che garantisce eccellenti valori di flusso e che genera una contropressione di modesta entità, compatibile con le esigenze di produzione di proteine su scala industriale. La resina è disponibile in un ampia gamma di formati, come ad esempio le piastre a 96 pozzetti AcroPrep ScreenExpert concepite per lo screening precoce di resine idonee alla purificazione delle proteine, o anche le pratiche colonne preimpaccate PRC da 1 ml e da ml, progettate per la rapida ottimizzazione dei metodi di purificazione, lo screening selettivo o per produzioni su piccola scala. Per utilizzo industriale, la resina HyperCel viene fornita sotto forma di slurry in una soluzione 1 M di NaCl contenente % (v/v) di etanolo o come panello umido (il materiale adsorbente del panello umido facilita il trasferimento della resina, evitando l agitazione e la sospensione di grossi volumi di materiale). L adsorbente HyperCel presenta una stabilità chimica che garantisce un semplice ed efficace clean-in-place (CIP) nonché un facile stoccaggio. Per CIP standard, si consiglia un trattamento con NaOH tra, ed 1 M, mentre lo stoccaggio a lungo termine è possibile in soluzione di NaOH tra e mm. Tabella 1 Proprietà principali Dimensione media delle particelle Legante a scambio ionico Capacità di legame dinamico 1 Normale range operativo della conducibilità delle materie prime biologiche Condizioni di pulizia consigliate 2 μm Ammina primaria > mg BSA/mL con un range di ph da 7, a, e conducibilità di 1 ms/cm 2 1 ms/cm 1 M NaOH L impaccamento ed il disimpaccamentog della resina cromatografica HyperCel è molto facile da eseguire in laboratorio, in pilota ed in produzione. La resina presenta inoltre eccellenti proprietà di flusso, compatibili con i requisiti dei processi di produzione più avanzati. L impaccamento della resina può essere effettuato con economici buffer standard. Ad esempio, una colonna di mm i.d. x 1 mm di altezza impaccata con buffer di NaCl mm può funzionare con una contropressione inferiore a 1, bar (22 psi) (Figura 1). L impaccamento è riproducibile sia che si tratti delle colonne di laboratorio che di quelle destinate alla produzione su grande scala ( mm i.d.). Valori tipici di N/m > piatti e fattori di asimmetria (AF) sono: 1,<AF<1,. Figura 1 Pressione vs Flow rate della resina HyperCel Pressione (bar) Velocità lineare (cm/h) Colonna: mm i.d. x 1 mm di altezza del letto. Buffer di impaccamento: NaCl mm Caratteristiche e vantaggi Elevata capacità di legame dinamico in un ampio intervallo di conducibilità operative: evita la diluizione delle materie prime biologiche e semplifica le lavorazioni del downstream Figura 2 Capacità di legame dinamico vs. Tempo di contatto in funzione di ph e Conducibilità della resina HyperCel Conducibilità Tempo di contatto = 1 min Tempo di contatto = 2, min Tempo di contatto = min ,2 7, 7,7,2, 7 7,2 7, 7,7,2, 7 7,2 7, 7,7,2, ph ph ph Colonna:, cm I.D. x cm di altezza letto (~1 ml). Campione: BSA mg/ml in buffer di equilibrazione composto da Tris-HCl 2 mm, ph 7,,. Conducibilità 3 ms/cm. Tempo di contatto: 1 min (,2 1 ml/min). I numeri indicano la capacità di legame per la BSA in mg/ml di resina Stabilito utilizzando una soluzione di BSA da mg/ml in Tris-HCl 2 mm, NaCl di,1 M con un tempo di contatto di 2 minuti. 2. Iniezione di volumi di colonna (CV) con NaOH da, a 1 M, tempo di contatto: 1 ora. 2
3 È stato effettuato uno studio basato sul Design of Experiment (DoE), per valutare l impatto di differenti valori di ph (da 7, a,), diverse conducibilità (da 3 a ms/cm) e diversi tempi di permanenza (da 1 a minuti) sulla capacità di legame dinamico per BSA, utilizzata come modello. I dati ottenuti evidenziano l impatto del ph e della conducibilità sulla DBC per la BSA della resina cromatografica HyperCel STAR AX. Il cromatogramma illustrato nella Figura 2 mostra che la resina raggiunge una DBC elevata (> mg/ml) in un ampia gamma di ph e conducibilità a tempi di permanenza brevi, permettendo ottimali flessibilità di processo e produttività. Figura 3 Capacità di legame dinamico della resina HyperCel per HSA da plasma diluito e non diluito. HSA mg/ml HyperCel 7 ms/cm 11 ms/cm DEAE DEAE su gel rigid rigido agarose di agarosio La Figura 3 evidenzia la DBC per l HAS della resina HyperCel rispetto ad una tradizionale resina a scambio anionico funzionalizzata con DEAE su supporto rigido di agarosio, a conducibilità corrispondenti a plasma non diluito (11 ms/cm) e diluito (7 ms/cm). I dati evidenziati nella Figura 3 confermano che la DBC è influenzata in maniera minore da conducibilità comprese nel range tra 7 11 ms/cm rispetto alle resine tradizionali. Ciò permette di caricare direttamente il plasma non diluito sulla resina HyperCel. Insieme ad eccellenti caratteristiche di flusso a a basse contropressioni (Figura 1), è possibile lavorare direttamente e velocemente ingenti volumi di materie prime biologiche aumentando la produttività del processo nel suo insieme e limitare il rischio di degradazione proteica. L elevata capacità di legame facilita le attività di produzione, poiché consente l utilizzo di colonne di volume ed ingombro ridotti, permettendo un ulteriore diminuzione del volume di buffer richiesto, garantendo risparmi in termini di attrezzature e ridotti costi d investimento per l acquisto delle resine. Eccellente selettività ed efficienza di separazione su un ampia gamma di conducibilità Figura Separazione di un mix di proteine sulla resina HyperCel a ms/cm. mau 6 Citocromo C Transferrina Albumina Gradiente di conducibilità 3 6 ml Colonna preimpaccata HyperCel PRC da 1 ml; mix da µl (2 mg/ml citocromo C, mg/ml transferrina umana, mg/ml albumina di siero bovino [BSA]). Carico: 2 mm Tris-HCl ph,, ms/cm. Eluizione: gradiente % 2 mm Tris-HCl, ph, + 1 M NaCl. La selettività della resina è un parametro chiave per la discriminazione fra la proteina target e i contaminanti nella materia prima biologica. Lo screening della selettività della resina è di fondamentale importanza e deve essere effettuato nelle fasi iniziali dello sviluppo di processo. La rapidità dello screening e l ottimizzazione delle condizioni possono essere ottenute utilizzando una colonna preimpaccata PRC Pall da 1 ml. Una volta selezionata la chimica appropriata, le condizioni di utilizzo possono essere ottimizzate in una colonna PRC da ml raddoppiandone l altezza. Due colonne da ml possono essere collegate in serie per elevare il letto della colonna fino a cm di altezza e modellare con maggior precisione le condizioni reali su scala pilota o per processi in scale-down. Le colonne da 1 ml possono anch esse essere collegate in serie. Grazie alle differenze a livello di struttura dei granuli, alla chimica del legante ed alla specifica densità di carica ionica, come evidenziato nella Figura, l efficienza di selettività e di separazione della resina HyperCel è mantenuta in un ampio intervallo di conducibilità. Applicazioni ed esempi Le applicazioni comprendono la captazione diretta delle proteine ricombinanti, anticorpi monoclonali e policlonali, derivati del plasma o altri biofarmaci. Grazie alla capacità di catturare direttamente le proteine da flussi di alimentazione non diluiti, la resina HyperCel può essere utilizzata anche per la rimozione dei contaminanti (ovvero proteine CHO della cellula ovarica di criceto cinese), prima dello step di purificazione della molecola target, vale a dire prima della dello step di cattura su Proteina A dell anticorpo monoclonale. 3
4 . Applicazione 1. Cattura diretta dell albumina dal plasma non diluito L obiettivo è valutare la resina HyperCel come primo passaggio in una sequenza di purificazione, articolata su due passaggi, per la cattura dell albumina sierica umana (HSA) da plasma non diluito (conducibilità11 ms/cm). La resina HyperCel è stata utilizzata nella prima fase di cattura, seguita dallo scambio cationico ortogonale su resina S HyperCel, senza aggiustamento del ph o della conducibilità del plasma. Il plasma purificato non diluito (ph 7,6, 11mS/cm), è stato caricato con DBC di 3 mg/ml (vedere la Figura 3). Il Design of Experiment (DoE) con piastre da 96 pozzetti (Piastre per filtrazione avanzata AcroPrep di Pall) è stato applicato per stabilire le condizioni ottimali per ottenere il miglior rapporto di resa/purezza (un esempio di ottimizzazione delle condizioni di lavaggio/eluizione è evidenziato alla Figura ). Tali condizioni sono state poi trasferite nell ambito della cromatografia su colonna con colonne Pall PRC preimpaccate (Figura 6). Figura Impatto delle condizioni di lavaggio (W) ed eluizione (E) sulla Purezza di HAS e Resa dell eluizione (in percentuale) su resina HyperCel (DoE su piastre per filtrazione a 96 pozzetti) Figura 6 Trasferimento delle condizioni accertate nelle piastre a 96 pozzetti su colonna PRC preimpaccata HyperCel da 1 ml. mau 2 1 FT da caricamento di plasma purificato Lavaggio 1 Lavaggio 2, ph 7,, ms/cm FT W1 W2 Eluizione, ph,, 2 ms/cm E Albumina IgG Transferrina Albumina ml FT W1 W2 E P P = Plasma Le condizioni definite nelle piastre a 96 pozzetti sono state applicate alla cromatografia su colonna con plasma non diluito utilizzando una colonna HyperCel PRC preimpaccata da 1 ml. Il cromatogramma (Figura 6) e l analisi SDS-PAGE delle frazioni hanno confermato che la maggior parte dei contaminanti è stata eliminata mediante lavaggio ad alta conducibilità, il che ha permesso di ottenere una frazione HAS pura al 99% con un solo passaggio con una resa del 9%. Inoltre, come evidenziato nella Figura 3, la resina HyperCel utilizzata nella fase di cattura con plasma non diluito presentava una DBC >3 mg/ml, oltre 2 volte superiore a quella della resina su gel d agarosio DEAE di tipo tradizionale testato in condizioni analoghe. za (%) i limite 3, d. 2, Conducibilità del lavaggio (ms/cm) Conducibilità dell eluizione (ms/cm) 1 3 Condizione di lavaggio ottimale, 6, 6, 7, 7, Gradiente di ph di lavaggio Condizione di eluizione ottimale 3,,,,, Gradiente di ph dell eluizione Purezza (%) < > 9 Valori limite E ph 3, E cond. 2, Resa (%) < > 9 Valori limite W ph 7, W cond. 2, Conducibilità dell eluizione (ms/cm) 3 L HSA è stata eluita mediante Resa (%) semplice diminuzione del ph (,), senza aggiunta di sale, permettendo < il caricamento diretto su una 6 colonna per scambio cationico Condizione 6 ortogonale (adsorbente S HyperCel). di eluizione 9 > 9 ottimalequest ultima fase di pulizia sulla resina S HyperrCel ha permesso di ottenere una frazione purificata di HSA eluito a ph 7, con purezza Valori limite >99% e capacità intorno W ph a 6 mg/ml 7, (Tabella 2). W cond. 2, Tabella 2 3,, Purificazione,, in due fasi,di albumina sierica umana da plasma non diluito Gradiente di ph dell eluizione Caricamento Capacità Resa Purezza (mg/ml) Cattura su resina HyperCel Polishing su resina S HyperCel Plasma non diluito > 3 mg/ml 9% 99% Eluizione a ph, da resina HyperCel 6 mg/ml 9% > 99% La Figura mostra che la resa in HAS è influenzata prevalentemente dalle condizioni di eluizione (zona ottimale: ph 3,,2 e conducibilità 2 27 ms/cm), mentre la purezza è influenzata principalmente dalle condizioni di lavaggio (lavaggio ad alta conducibilità a >1 ms/cm aumenta la purezza).
5 Applicazione 2. Rimozione di CHOPs prima della cattura su Proteina A dell anticorpo monoclonale (MAb) L obiettivo di questo studio è stato valutare l impatto di uno step di prepurificazione mediante resina HyperCel prima della convenzionale cattura dell anticorpo monoclonale (MAb), proveniente da coltura di cellule di mammifero su Proteina A, (Figure 7). Il contenuto di CHOPs per i due modelli di purificazione evidenziati nella Figura 7 è stato comparato tramite analisi ELISA. Figura 7 Schema di purificazione Mab convenzionale ed alternativo inclusa la fase di prepurificazione su resina HyperCel. CCS CHOP: 13. ppm La fase di prepurificazione può avere effetti positivi sull economia di processo estendendo la durata di utilizzo di una costosa colonna per con Proteina A, utilizzata come fase standard per la cattura del MAb. Informazioni per l ordine Resina HyperCel Codice ml ml ml L L 197- L HyperCel modalità FT CHOP: 362. ppm Colonne preimpaccate HyperCel PRC Codice Proteina A (modalità legame/ eluizione) Proteina A (modalità legame/ eluizione) Colonna PRC x HyperCel, 1 ml PRCSTARAX1ML CHOP: ppm CHOP: 3.3 ppm Colonna PRC x HyperCel, ml PRCSTARAXML, Le piastre di resina HyperCel Contenuto CHOP x (ppm) 3, 3 2, 2 1, 1 Piastre AcroPrep ScreenExpert: resina per scambio anionico HyperCel Codice 96WPSTARAX, 13 CCS 36 HyperCel 33 Proteina A HyperCel + Proteina A I dati mostrano che utilizzando la resina HyperCel prima della Proteina A si ottiene una maggiore riduzione in termini di CHOP (> volte). A causa di questo effetto sinergico, a partire da un contenuto iniziale di proteine della cellula ospite (HCP) di 13. ppm, il livello finale di CHOP si è ridotto a ~ ppm (riduzione di 3-Log), con un recupero del 9% in termini di Mab.
6 Corporate Headquarters Port Washington, NY, USA Numero verde (USA) Tel European Headquarters Fribourg, Switzerland +1 () Tel LifeSciences.EU@pall.com Asia-Pacific Headquarters Singapore Tel sgcustomerservice@pall.com Filtration. Separation. Solution.SM Visitate il nostro sito Web biopharm@pall.com Uffici internazionali Pall Corporation ha uffici e stabilimenti in tutto il mondo, in Paesi quali: Argentina, Australia, Austria, Belgio, Brasile, Canada, Cina, Francia, Germania, India, Indonesia, Irlanda, Italia, Giappone, Corea, Malesia, Messico, Paesi Bassi, Nuova Zelanda, Norvegia, Polonia, Porto Rico, Russia, Singapore, Sud Africa, Spagna, Svezia, Svizzera, Taiwan, Tailandia, Regno Unito, Stati Uniti e Venezuela. I distributori si trovano in tutti i più importanti paesi industrializzati del mondo. Per individuare l ufficio o il distributore Pall a voi più vicino, si prega di visitare il sito Le informazioni fornite in questa letteratura sono state revisionate in relazione all accuratezza al momento della pubblicazione. I dati del prodotto potrebbero esser soggetti a modifiche senza preavviso. Per informazioni aggiornate consultare il proprio distributore Pall locale o contattare Pall direttamente. 13, Pall Corporation. Pall,, AcroPrep, e HyperCel sono marchi di fabbrica di Pall Corporation. La indica un marchio registrato negli Stati Uniti e TM indica un marchio riconosciuto dal diritto consuetudinario. Filtration. Separation. Solution. è un marchio di servizio di Pall Corporation. 3/13, PDF, GN13.66 USD 231 (2)
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