Identificazione dei biotipi di batteri lattici intestinali a finalità probiotica nei vitelli a carne bianca e verifica in vivo della loro efficacia

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1 Identificazione dei biotipi di batteri lattici intestinali a finalità probiotica nei vitelli a carne bianca e verifica in vivo della loro efficacia

2 Sperimentazione condotta nell ambito del progetto di ricerca n. 820: Identificazione dei biotipi di batteri lattici intestinali a finalità probiotica nei vitelli a carne bianca e verifica in vivo della loro efficacia (PROVIT) finanziato con il Piano per la Ricerca e lo Sviluppo 2005 della Regione Lombardia, DG Agricoltura, d.g.r. 16/02/2005 N. 7/ A cura di: Carlo Cantoni, Simone Stella, Carla Bersani, Barbara Ripamonti, Silvia Pirani (VSA Ispezione degli Alimenti di origine animale) Antonella Baldi, Raffaella Rebucci (VSA Biotecnologie) Giovanni Savoini, Alessandro Agazzi, Guido Invernizzi (VSA Alimentazione Animale) Cinzia Domeneghini, Francesca Vitari, Paolo Stortini (VSA Anatomia) Hanno realizzato le attività sperimentali e lo studio: Università degli Studi di Milano Dipartimento di Scienze e Tecnologie Veterinarie per la Sicurezza Alimentare via Celoria, Milano Tel. 02/ Fax 02/ Istituto Zooprofilattico della Lombardia e dell Emilia Romagna Via Bianchi, Brescia Tel. 030/ Fax 030/ info@bs.izs.it Per informazioni: Regione Lombardia Direzione Generale Agricoltura U.O. Interventi per la competitività e l innovazione tecnologica delle aziende Struttura Ricerca e Innovazione Tecnologica Via Pola, Milano Tel. 02/ Fax 02/ Referente: Gianpaolo Bertoncini Tel. 02/ gianpaolo_bertoncini@regione.lombardia.it Copyright Regione Lombardia

3 Identificazione dei biotipi di batteri lattici intestinali a finalità probiotica nei vitelli a carne bianca e verifica in vivo della loro efficacia Quaderni della ricerca n. 88 luglio 2008

4 Identificazione dei biotipi di batteri lattici intestinali a finalità probiotica nei vitelli a carne bianca e verifica in vivo della loro efficacia Quaderni della ricerca n. 88 luglio 2008

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6 SOMMARIO Presentazione dell Assessore 1 1 INTRODUZIONE AL PROBLEMA AFFRONTATO 1.1 Stato dell arte dell allevamento del vitello a carne bianca I probiotici Probiosi nel vitello a carne bianca Cenni di anatomia dell intestino e meccanismi di assorbimento dei nutrienti 7 2 OBIETTIVO DEL PROGETTO E STEP OPERATIVI 10 Fase 1 Sperimentazione in vitro 3 PARTE SPERIMENTALE 3.1 Prelievo dei campioni fecali Isolamento dei batteri lattici di origine fecale Identificazione dei ceppi Valutazione delle qualità probiotiche 14 4 RISULTATI 4.1 Isolamento dei batteri lattici di origine fecale Valutazione delle qualità probiotiche Il formulato probiotico 26 Fase 2 Sperimentazione in vivo 5 INDAGINI SPERIMENTALI EFFETTUATE 27 6 PARTE SPERIMENTALE 6.1 Prove zootecniche Prove microbiologiche Valutazione delle lesioni polmonari Prove isto-anatomiche 33 7 RISULTATI 7.1 Prove zootecniche Prove microbiologiche Isolamento di Bacillus coagulans Valutazione delle lesioni polmonari Prove isto-anatomiche 49 8 ANALISI STATISTICA 52 9 CONCLUSIONI Fase 1 Sperimentazione in vitro 9.2 Fase 2 Sperimentazione in vivo 10 BIBLIOGRAFIA 57

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8 Presentazione La zootecnia da carne, in Lombardia, rappresenta una vera colonna portante dell intero sistema economico-produttivo, raggiungendo standard qualitativi molto elevati che uniscono al benessere ed alla capacità produttiva degli animali, anche una significativa attenzione verso le esigenze del consumatore. In tal senso, si rende indispensabile identificare strategie nutrizionali che possano coniugare le esigenze economiche degli allevatori con quelle di tutela dei consumatori, ponendosi obiettivi superiori al soddisfacimento dei bisogni di mantenimento e di produzione, ricercando sostanze in grado di migliorare lo stato di salute degli animali sottoposti ai normali regimi di stress dovuti all allevamento. Il vitello a carne bianca è, tra gli animali da reddito, quello maggiormente predisposto a sindromi da stress causate appunto dalle specifiche condizioni di allevamento e, di conseguenza, è frequentemente sottoposto a trattamenti con antibiotici: tali farmaci vengono oggi utilizzati a scopo esclusivamente terapeutico. Il loro impiego come promotori di crescita (APC), infatti, è vietato dal 1 gennaio 2006 (Dir.97/72/CE). Nel progetto di ricerca Identificazione dei biotipi di batteri lattici intestinali a finalità probiotica nei vitelli a carne bianca e verifica in vivo della loro efficacia, condiviso con il Dipartimento di Scienze e Tecnologie Veterinarie per la Sicurezza Alimentare (VSA) dell Università degli Studi di Milano, e presentato in questo Quaderno della Ricerca, è stato possibile isolare, identificare e sperimentare probiotici specie-specifici, cioè ottenuti direttamente dai vitelli a carne bianca, per migliorare lo stato igienico-sanitario dei vitelli oltre che per ottenere una massimizzazione dei parametri zootecnici. Nel gruppo campione, inoltre, è stato possibile diminuire i trattamenti antibiotici mirati, rispondendo all esigenza di ridurre l impiego di antibiotici al fine di contenere il fenomeno della antibiotico-resistenza da parte dei microrganismi patogeni, attualmente considerato, a livello mondiale, uno dei principali problemi della Sanità Pubblica che coinvolge in modo equivalente la medicina umana e quella veterinaria. Luca Daniel Ferrazzi Assessore all Agricoltura Regione Lombardia 1

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10 1. INTRODUZIONE AL PROBLEMA AFFRONTATO 1.1 STATO DELL ARTE DELL ALLEVAMENTO DEL VITELLO A CARNE BIANCA L Italia rappresenta, con Olanda e Francia, uno dei maggiori mercati per il commercio del vitello a carne bianca. Secondo gli ultimi dati disponibili diramati dall ISTAT e pubblicati da ASSALZOO nel 2006, la consistenza del bestiame per quanto riguarda la produzione di vitelli con età inferiore all anno e destinati alla macellazione è pari a capi con un incremento del 12,5% rispetto all anno precedente su un totale di bovini da carne presenti sul territorio nazionale. La produzione italiana annua di carne di vitello è di tonnellate, con un importazione di tonnellate ed un esportazione di 900 tonnellate, definendo un livello di auto-approvvigionamento pari all 88,5%. In quest ambito la Lombardia nel corso del 2005 si è attestata al quarto posto dopo Toscana, Lazio e Piemonte con la macellazione di vitelli ed un totale di circa tonnellate di carne prodotte, con un consumo procapite annuo di carne bovina, in costante crescita a partire dal 2001, pari a 20,9 kg ed un valore di quasi 130 milioni di euro. I vitelli a carne bianca comprendono normalmente i maschi delle razze da latte e le femmine eccedenti la rimonta delle razze da latte e a duplice attitudine. Tra gli animali da reddito il vitello a carne bianca risulta particolarmente predisposto a sindromi da stress causate dalle condizioni di allevamento (alimentazione ecc.): i primi giorni di vita e la fase di svezzamento sono un momento delicato per gli animali; circa il 70% delle perdite si verifica proprio entro i primi 15 giorni. Attualmente, per ovviare a tali problematiche, con le recenti leggi emanate per la regolamentazione di questo settore, si sta assistendo ad una lenta, ma inesorabile modificazione dei metodi di allevamento di questa specie. Il Decreto Legislativo 333 del 1 settembre 1998 a recepimento della Direttiva 97/2/CE è divenuto attuativo a partire dalla fine dell anno 2003: secondo la normativa cogente, i vitelli devono essere allevati in piccoli gruppi e l alimentazione lattea deve essere integrata con una quota di materiale fibroso. In concomitanza la resistenza dei microrganismi agli antibiotici è attualmente considerata, a livello mondiale, come uno dei principali problemi della sanità pubblica coinvolgendo sia la medicina umana che la medicina veterinaria. È stato ampiamente dimostrato come il loro utilizzo negli animali porti alla selezione di ceppi di batteri resistenti che hanno la possibilità di colonizzare l intestino e, conseguentemente, di essere eliminati con le feci contaminando l ambiente e gli alimenti derivati (Ricci A. & coll., 2003). In un recente lavoro sono stati testati, per quanto riguarda l antibioticoresistenza, ceppi di Escherichia coli ed Enterococchi isolati da contenuto intestinale di bovini. Per entrambi i microrganismi, i livelli più elevati di resistenza si evidenziavano in quelli provenienti da vitelli a carne bianca, il che è sicuramente da mettere in relazione con il massiccio uso di sostanze ad azione antimicrobica 3

11 in questa categoria di animali, utilizzati anche come promotori di crescita (Van den Bogaard AE., 2000; Direttiva 97/72/CE, 1997; Busani Luca & coll.,2003). Una delle principali problematiche che il settore deve affrontare, a seguito della messa al bando da parte della UE a partire dal gennaio 2006 dell uso di qualsiasi antibiotico promotore di crescita (APC), è quindi quella di identificare nuove strategie nutrizionali che possano coniugare le esigenze economiche degli allevatori con quelle a tutela dei consumatori per lo sviluppo e la competitività del mercato del vitello a carne bianca. In questa ottica si inseriscono gli alimenti funzionali che posseggono un valore aggiunto rispetto al semplice valore nutritivo. L uso di tali prodotti è particolarmente interessante nell animale giovane, dove l immaturità del sistema immunitario e dell attività digestiva lo rendono più facilmente esposto a patologie di varia natura. La ricerca si sta muovendo in questa direzione e restano tuttora ampi margini di studio. Tra le possibili soluzioni si stanno valutando anche gli effetti benefici che possono fornire i probiotici (Chang YoungHyo & coll, 2001). 1.2 I PROBIOTICI L'allevamento del vitello a carne bianca ha conosciuto negli ultimi anni una evoluzione ed una specializzazione tali da richiedere una alimentazione curata e supportata con una adeguata integrazione. Di primaria importanza è quindi la corretta alimentazione al fine di prevenire e, nel caso, contenere le patologie enteriche così frequenti in condizioni di allevamento intensivo. Il rivestimento interno del canale alimentare, la tonaca mucosa, è la prima linea di contatto con eventuali agenti patogeni, allergeni, tossine batteriche, ed è quindi necessario che ne sia mantenuta l integrità anatomica, in modo che possa svolgere la sua attività di barriera protettiva garantendo una buona funzionalità nel confronti della digestione e dell assorbimento dei nutrienti. I probiotici sono microrganismi vitali che, se somministrati in quantità adeguata, conferiscono un beneficio alla salute dell ospite (FAO/WHO, 2001; Holzapfel & coll., 1998; Fuller & coll., 1989). Essi influenzano positivamente l equilibrio microbico intestinale grazie alla produzione di acidi organici che riducono il ph dell intestino inibendo la crescita di batteri indesiderati, favoriscono la colonizzazione dell apparato digerente da parte della microflora autoctona e inibiscono la crescita di microrganismi potenzialmente patogeni. La loro abilità nell aderire agli enterociti impedisce l adesione dei patogeni enterici. Inoltre sono in grado di neutralizzare la produzione di enterotossine, di migliorare la capacità digestiva e di assorbimento, di potenziare le difese immunitarie attraverso un attività di immunostimolazione (Buddington & coll., 2001; Jensen, 1999) con aumento della sintesi di IgA (Hosono & coll.,1990; Fuller, 1990). In sostanza i ceppi probiotici sono quelli che 4

12 agiscono come riequilibratori intestinali, stante la loro effettiva capacità di inibire la colonizzazione dei germi intestinali putrefattivi, infiammatori e patogeni e di sostituirsi ad essi in ambito gastrointestinale (De Vrese & coll., 2007). Da tale riequilibrio nasce tutta una serie di benefici a ricaduta tipica dei probiotici, purché siano somministrati in quantità adeguata e per il tempo dovuto. Sulla base delle conoscenze finora acquisite dalla comunità scientifica internazionale sono stati definiti i criteri che permettono di selezionare un microrganismo ad uso probiotico (Gibson & coll., 2000): possibilità di prepararlo su larga scala ed in un formato facilmente utilizzabile; vitalità e stabilità delle cellule batteriche durante la preparazione e il successivo stoccaggio dei prodotti industriali nei quali verrà impiegato; sopravvivenza al passaggio attraverso il tratto gastrointestinale e quindi resistenza agli acidi gastrici e ai sali biliari ed arrivo nel piccolo intestino in numero ottimale di cellule vitali (circa 1 milione di unità/g di prodotto); capacità di adesione alla mucosa intestinale per un tempo sufficiente ad esercitare i propri effetti benefici sull ospite (Gismondo & coll., 1999; Morata de Ambrosini & coll., 1999); assenza di tossicità. Attualmente si utilizzano probiotici in coltura mista, scelti fra quelli ammessi dall UE. Questi sono isolati da diverse matrici, non necessariamente da contenuto intestinale. La capacità di insediarsi nel tratto gastroenterico e/o di modulare la risposta immunitaria non è condivisa da tutti i membri di una specie batterica, ma è un carattere proprio del singolo ceppo; per questo l autorizzazione all uso è rilasciata singolarmente. L allevamento intensivo degli animali da reddito ha reso indispensabile il ricorso ad additivi alimentari in grado di ridurre l azione di numerosi fattori che incidono negativamente sul costo di produzione. Il ricorso ai probiotici per migliorare le performance degli animali rientra in questo contesto ed è da tempo oggetto di studio. Sia gli uni che gli altri, seppure con modalità diverse, hanno come obiettivo quello di mantenere in condizioni di normalità ed efficienza la microflora intestinale, al fine di ottimizzare lo stato di salute dell animale ospite (Savoini & coll., 2005; Baldi & coll., 2005). Per i promotori di crescita di natura chemioantibiotica sono noti gli effetti positivi sulle performance degli animali, mentre per i probiotici sussistono ancora molte incertezze sui meccanismi di azione mediante i quali sono in grado di condizionare favorevolmente lo stato di salute. I probiotici possono operare in ambito intestinale con modalità diverse in funzione della loro capacità di colonizzare l intestino (microrganismi residenti o transitanti) e delle caratteristiche intrinseche a ciascuno di essi. È nota infatti la capacità di alcuni probiotici di agire in competizione con i batteri 5

13 patogeni. Non meno importante è anche l azione che altri probiotici possono svolgere nel lume intestinale producendo enzimi utili per l attività digestiva. Il principio della variabilità genetica e quindi della diversità dei ceppi nell ambito della stessa specie/subspecie, si applica a tutta la flora microbica intestinale: ad esempio la specie Lactobacillus acidophilus (batterio lattico), benché sempre commensale e mai patogena, sembra presentare ceppi specie-specifici. Ciò significa che alcuni ceppi sarebbero più adatti a colonizzare l intestino umano, altri colonizzerebbero più facilmente quello di pollo, altri quello di maiale, ecc. In aggiunta, ogni ceppo di L. acidophilus, nonostante l affinità, si differenzia da un altro per una miriade di sfumature genetiche, fisiologiche, metaboliche, ecc., tutti fattori che hanno importanza quando si devono selezionare i microrganismi per uso probiotico. 1.3 PROBIOSI NEL VITELLO A CARNE BIANCA L uso di probiotici per migliorare le performance degli animali da reddito è noto ormai da tempo e il loro interesse ha subito un incremento in seguito all abolizione degli antibiotici a scopo auxinico dal gennaio In alimentazione animale vengono utilizzati tali prodotti come additivi nella pratica zootecnica, per mantenere l equilibrio della flora intestinale al fine di garantire una migliore efficienza alimentare e produttività, tutelando allo stesso tempo, per la loro sicurezza, l ambiente e il consumatore. La normativa di riferimento per l autorizzazione dell immissione sul mercato e l utilizzazione degli additivi per mangimi e delle premiscele per mangimi è il Regolamento (CE) 1831/2003, che ha lo scopo di istituire una procedura comunitaria. Come ampiamente spiegato nel paragrafo precedente, i probiotici esplicano la propria azione a livello intestinale con un effetto sulla flora microbica, sulle cellule intestinali dell epitelio (integrità della barriera intestinale) (Nabuurs & coll., 2001; Soderholm & Perdue, 2001; Bontempo & coll., 2006; Di Giancamillo & coll., 2008) e sul sistema immunitario (immunomodulazione locale) (Blecha & coll., 1984; Sheridan & coll., 1994). Il mantenimento dell equilibrio a livello intestinale è una problematica che può risultare ancor più sentita in alcun forme di allevamento come quella del vitello a carne bianca in cui per i regimi alimentari a cui gli animali sono sottoposti e per la gestione degli stessi, l integrazione della dieta con probiotici può risultare ancor più interessante. Il vitello a carne bianca, durante le prime settimane di vita, è soggetto a dismicrobismi gastro-intestinali che si ripercuotono negativamente sulla funzionalità digestiva, sulla produttività e sulla sicurezza sanitaria delle carni macellate (Timmerman & coll., 2005). Le cause delle disbiosi sono da ricercarsi nelle condizioni di allevamento, di alimentazione ma anche nell utilizzo di antibiotici a scopo terapeutico nella comune pratica zootecnica. Attualmente si utilizzano come additivi dei 6

14 probiotici in coltura mista, scelti fra quelli ammessi dall UE che spesso non provengono dalla specie animale alla quale verranno poi somministrati, con conseguente perdita dell ormai riconosciuto effetto specie-specifico. Tradizionalmente il loro impiego nell allevamento dei vitelli a carne bianca è riferito principalmente ai lattobacilli e bifidobatteri, i quali, quando somministrati in sufficienti quantità, manifestano un impatto positivo sulla salute (Fumiaki & coll., 1995; Brooks & coll., 2001). Questi microrganismi trovano anche particolare applicazione nel prevenire o comunque limitare i sintomi dello stress da svezzamento: si tratta di una sindrome patologica definita, nota per la sua influenza sulla stabilità dell ecosistema microbico. Va osservato che la letteratura attuale riferisce in merito ai favorevoli benefici dell impiego dei probiotici soltanto in animali più giovani, più facilmente esposti agli stress ambientali e nutrizionali. La selezione di ceppi lattici naturalmente residenti nel canale digerente dei vitelli a carne bianca permette di potenziare l effetto barriera nei confronti dei batteri patogeni, proteggendo in questo modo la mucosa intestinale dalle infezioni. L aggiunta di probiotici consente un più corretto sviluppo della flora microbica intestinale; ne risulta un migliore stato di gut health (sanità della mucosa gastro-enterica), che porta di conseguenza ad una migliore capacità di assimilazione dei nutrienti (Giardini & Villa, 2007). Lo scopo generale che si vuole ottenere con la probiosi nei vitelli è il mantenimento di una buona igiene digestiva del vitello, che si ripercuote positivamente sullo stato di salute intestinale e generale. In particolare si riducono l incidenza, la gravità e la durata degli episodi diarroici e talvolta dei problemi respiratori (Timmerman & coll., 2005), con conseguente diminuzione dei trattamenti antibiotici. 1.4 CENNI DI ANATOMIA DELL INTESTINO E MECCANISMI DI ASSORBIMENTO DEI NUTRIENTI L'intestino tenue, così chiamato perché di calibro sottile, è l'organo centrale per la digestione e l'assorbimento delle sostanze nutritive ed è costituito da tre porzioni: duodeno, digiuno ed ileo. La tonaca mucosa è caratterizzata dalla presenza di estroflessioni della stessa, i villi intestinali, che posseggono un epitelio costituito da cellule (gli enterociti) dotate di piccoli prolungamenti (microvilli) che costituiscono una struttura ad elevato potere assorbente. Queste strutture presentano dunque una ampia superficie disponibile per l assorbimento delle sostanze nutritive. Alla base dei villi si aprono come invaginazioni tubulari le strutture ghiandolari dette cripte intestinali, anch esse rivestite da un epitelio le cui cellule possiedono microvilli per aumentare le capacità assorbenti (Fig. 1). 7

15 In condizioni normali è presente un equilibrio dinamico tra le cellule epiteliali prodotte dalle cripte intestinali e quelle che sfaldano alla sommità dei villi al fine di assicurare un normale ricambio dell epitelio, ma questo equilibrio può essere alterato, anche fortemente, in condizioni patologiche o fisio-patologiche. Figura 1: struttura dell intestino tenue (fonte: Le condizioni di stress, così frequenti negli allevamenti intensivi, possono causare una diminuzione dell assunzione di cibo che, a sua volta, può determinare un calo della massa e della componente mucosale dell intestino tenue che ha come esito una grave atrofia dei villi con iperplasia delle cripte. Le alterazioni in senso diminutivo a livello dei villi possono causare importanti limitazioni nell assorbimento dei nutrienti-chiave, che normalmente vengono impiegati per massimizzare la crescita dei tessuti periferici, soprattutto i muscoli scheletrici. L intestino crasso ha anch esso una funzione di assorbimento, soprattutto di elettroliti, acqua ed acidi grassi a corta catena; esso è costituito da: cieco, colon (ascendente, traverso, discendente) e retto. La mucosa dell intestino crasso si differenzia da quella del tenue in quanto non sono presenti i villi intestinali ma solo le cripte. L intestino è dotato inoltre di una struttura specificamente deputata alla difesa locale (figg. 2 e 3), il GALT (Gut-Associated Lymphoid Tissue, Tessuto Linfatico Associato all Intestino) costituito da follicoli linfatici isolati oppure aggregati a formare voluminosi ammassi, chiamati placche di Peyer. I follicoli linfatici sono ammassi rotondeggianti di un particolare tessuto connettivo, il tessuto linfatico, così chiamato perché ospita un numero elevatissimo di cellule difensive, tra le quali si annoverano i linfociti, le plasmacellule ed i macrofagi. Del GALT 8

16 fanno inoltre parte numerose cellule difensive che non si aggregano a formare follicoli ma che rimangono isolate. La risposta difensiva intestinale inizia a livello delle placche del Peyer, dove cellule specializzate (cellule M) situate nell epitelio intestinale sovrastante trasportano gli antigeni dal lume al connettivo sottostante. Figura 2: Struttura della parete dell intestino tenue (fonte: In questa sede i macrofagi fagocitano gli antigeni e li presentano ad una particolare classe di linfociti, i linfociti T helper CD4-positivi che, a loro volta, stimolano i linfociti B. Questi ultimi, provenienti dalla circolazione linfatica, penetrano nella tonaca mucosa e si differenziano in plasmacellule produttrici di immunoglobuline di classe G o A (IgG, IgA). Figura 3: Meccanismo della stimolazione immunitaria intestinale (fonte: 9

17 2. OBIETTIVO DEL PROGETTO E STEP OPERATIVI L obiettivo del progetto è quello di verificare se la somministrazione nei vitelli a carne bianca di batteri lattici intestinali specie-specifici a funzionalità probiotica permetta di ottenere migliori effetti sia dal punto di vista zootecnico che sullo stato di salute degli animali. Identificare i cloni probiotici già presenti nell ambiente intestinale e somministrarli può avere un effetto di compensazione delle disbiosi molto più efficace di quello ottenuto tramite semplice somministrazione di probiotici non specie-specifici. Per raggiungere l obiettivo generale sono stati creati più obiettivi specifici: Fase 1 sperimentazione in vitro Identificare i biotipi di batteri lattici (linee clonali specie-specifiche) maggiormente presenti nella flora intestinale del vitello a carne bianca in modo da avere un primo quadro generale dei lattobacilli presenti. Selezionare i biotipi, tra quelli isolati, che presentano migliori qualità probiotiche. Fase 2 - sperimentazione in vivo Somministrare in vivo i ceppi isolati per valutarne l efficacia. Questo approccio di studio intende ampliare due campi fondamentali: aumentare la conoscenza della flora lattica intestinale del vitello a carne bianca; valutare i benefici ottenuti dalla somministrazione di probiotici autoctoni (specie-specifici). 10

18 3. PARTE SPERIMENTALE FASE 1 SPERIMENTAZIONE IN VITRO IDENTIFICAZIONE DEI BIOTIPI DI BATTERI LATTICI INTESTINALI DEL VITELLO A CARNE BIANCA E SELEZIONE DEI CEPPI PROBIOTICI DA SOMMINISTRARE IN ALLEVAMENTO Figura 4: Prelievo in allevamento dei campioni fecali Prelievo dei campioni fecali Per il nostro studio abbiamo scelto at random: - 40 vitelli a carne bianca (di circa 50 giorni) di razza Frisona (per il 95%) incrociata con le razze Blu Belga e Simmental (per il 5%), provenienti da 4 diversi allevamenti situati nella provincia di Brescia (8-12 per allevamento). Per quanto riguarda la dieta essi hanno ricevuto un alimentazione lattea addizionata, a partire dall 8-10 giorno dopo il ristallo, con un alimentazione solida integrata gradualmente. Il prelievo fecale è stato effettuato in triplo per ottenere un campione omogeneo. I campioni sono stati poi trasportati in laboratorio in appositi contenitori (Fekal enteric plus, Oxoid) a temperatura refrigerata e analizzati entro le 24 ore Isolamento dei batteri lattici di origine fecale I campioni fecali (10 g) sono stati omogenati mediante Stomacher e processati secondo il metodo delle diluizioni seriali in soluzione salina: 0,1 ml di ogni diluizione sono stati inoculati su MRS agar (deman Rogosa Sharpe, Oxoid) per l isolamento di Lactobacillus spp., M17 agar (Oxoid) per l isolamento di Lactococcus spp. e Beerens Agar (Oxoid) per l isolamento di spp. Le piastre per la ricerca dei Lattobacilli e dei Bifidobatteri sono state poste ad incubare in condizioni di anaerobiosi a 37 C per ore, mentre le piastre di M17 sono state poste ad incubare in aerobiosi a 37 C pe r ore. Per ogni piastra che 11

19 presentava colonie ben isolate sono state prelevate quelle risultate morfologicamente differenti e poste in MRS brodo (Oxoid). I brodi sono stati incubati in anaerobiosi per 48 ore prima di essere nuovamente seminati sui rispettivi terreni colturali per verificare la purezza degli isolati. Le colonie selezionate (in totale 160) sono state conservate mediante sistema cryovials (Microbank TM, Pro-Lab Diagnostics) e poste a 70 C per evitare di effettuare ulteriori passaggi microbici al fine di evitare di favorire eventuali mutazioni che potrebbero portare a modificazione clonale Identificazione dei ceppi Sequenziamento del gene 16S rrna Questa metodica permette di identificare e differenziare specie e ceppi batterici integrandosi con le altre tecnologie adibite a questo scopo (PCR, RFLP, PGFE, Ribotyping, ecc.). È un sistema biomolecolare di identificazione batterica che consiste nell analisi filogenetica del gene per l RNA ribosomale 16S mediante la tecnica del sequenziamento del DNA. Metodologia di identificazione 1. Ottenimento delle sequenze con il sistema MicroSeq 500 (16S rdna PCR & Sequencing Kits, Applied Biosystem) che consente l amplificazione e il sequenziamento di 500 bp dell RNA ribosomale 16S. 2. Sequenziamento mediante il sequenziatore automatico (GA3130 Applied Biosystems). 3. Identificazione della sequenza mediante confronto con la banca dati MicroSeq ID (MicroSeq ID Analysis Software v1.0 for microbial identification of bacteria and fungi, Applied Biosystems) che contiene più di 1400 sequenze di riferimento, tra cui quelle di 46 specie di Lattobacillus e di 37 specie di Streptococcus, e ricerca (per ogni sequenza) dell omologia mediante confronto con la banca dati Blast. Criteri di identificazione 1. Se i risultati della ricerca in MicroSeq ID e in Blast coincidono è considerata valida l identificazione di specie fornita da MicroSeq ID. 2. Se i risultati non coincidono: è considerata valida l identificazione di specie di Blast se la specie identificata in Blast non è presente anche in MicroSeq ID; è considerata valida l identificazione di specie di MicroSeq ID se la specie identificata in Blast é presente anche in MicroSeq ID (perché le sequenze di riferimento che si trovano in quest ultima sono validate e garantiscono un grado di affidabilità maggiore). 12

20 Ribotipizzazione Cenni generali La ribotipizzazione automatica che si ottiene con il RiboPrinter System (DuPont Qualicon) è un sistema di fingerprinting genetico dei microrganismi che permette di identificarli e caratterizzarli in modo estremamente sicuro e veloce, discriminando accuratamente non solo i generi e le specie, ma anche i singoli ceppi. La ribotipizzazione (ribotyping) utilizza dei frammenti di acidi nucleici derivati dalla digestione del genoma batterico con un enzima di restrizione. Il metodo consente la caratterizzazione e l identificazione dei batteri mediante ibridazione di una sonda ribosomiale sui frammenti di DNA separati in base al peso molecolare. Ne risulta una specifica impronta, detta "RiboPrint pattern" che visualizza la distribuzione normalizzata di frammenti di DNA di varie dimensioni del genoma di ceppi diversi di microrganismi. Lo strumento analizza il pattern di ogni campione e lo confronta con altri pattern archiviati nella Banca dati fornita col sistema. Se si verifica una corrispondenza (percentuale di similarità > 95%), il campione è identificato e gli viene assegnato un nome tassonomico; in caso contrario l impronta viene comunque archiviata senza un nome preciso oppure con un codice di identificazione dato dall utilizzatore. Quando, successivamente, lo stesso microrganismo sarà processato, il sistema sarà in grado di riconoscerlo. Il sistema confronta i campioni con un database per consentire l identificazione di genere, specie e ceppo. Per eseguire la caratterizzazione lo strumento raffronta il campione in esame con ognuno dei campioni già precedentemente processati. La caratterizzazione è indipendente dall identificazione. Tutti i campioni sono caratterizzati automaticamente. I risultati del confronto statistico dicono immediatamente all utilizzatore se il microrganismo in questione è già stato analizzato. I risultati dell analisi di più di ceppi, hanno dimostrato che i frammenti di RNA ribosomale (rrna) sono altamente conservati a livello di genere e specie. Ciò permette di identificare il genere e la specie della maggior parte dei batteri in base a una data e specifica combinazione di questi frammenti. Due o più specie appartenenti allo stesso genere condividono una certa quantità di DNA codificante rrna, ma ognuna contiene bande conservate (frammenti di rrna) presenti in una precisa posizione solo in quella specie, mentre sono assenti nelle altre. I frammenti non conservati polimorfici invece rappresentano i caratteri per differenziare i biotipi. Criteri di identificazione I microrganismi processati che presentavano una similarità superiore allo 0.85 con un clone registrato in banca dati sono stati identificati direttamente dallo strumento mediante assegnazione della specie e di un Ribotipo (DUP). Il Ribogruppo è invece attribuito dallo strumento a tutti i campioni analizzati, anche a quelli non identificati: ogni volta che un ceppo viene ribotipizzato il suo profilo è confrontato con 13

21 tutti i microrganismi processati fino a quel momento. Se la similarità fra due ceppi risulta superiore allo 0.93 è assegnato il medesimo codice identificativo (figura 5). Altri ceppi possono anche essere aggiunti a ribogruppi esistenti se la loro similarità rispetto al profilo medio del Ribogruppo è > Sfruttando quindi l informazione del Ribotipo e del Ribogruppo sono stati identificati la maggior parte dei ceppi microbici. Per i batteri che, pur appartenendo al medesimo Ribogruppo non sono stati riferiti ad alcun Ribotipo, si è effettuata l identificazione mediante sequenziamento rrna 16S (esempio: S. macedonicus e S. bovis). I profili ottenuti da tutti i ceppi analizzati sono stati esportati e sottoposti ad analisi cluster mediante l uso di un programma software che ha eseguito l analisi della variabilità utilizzando l UPGMA (unweighted pair group method using average linkages): il risultato di tale elaborazione è stata la creazione di grafici chiamati dendrogrammi (ad es. figura 9). Ribotipo e ribogruppo Ribotipo >0.85 Ribogruppo >0.95 Figura 5: Differenziazione fra ribotipo e ribogruppo e relativa identificazione o caratterizzazione del ceppo analizzato La selezione dei cloni da testare per le qualità probiotiche è stata effettuata scegliendo all interno delle specie maggiormente isolate il clone più numeroso Valutazione delle qualità probiotiche Nel corso del presente progetto è stato considerato un pool di parametri atti a caratterizzare l attività probiotica in vitro dei ceppi isolati dal contenuto fecale di vitelli a carne bianca, 14

22 considerando le loro caratteristiche funzionali. Sulla base delle linee guida stabilite dall Unione Europea, si sono così valutate proprietà quali: 1. Resistenza ad un basso ph gastrico, al succo gastrico e al succo pancreatico, fondamentale per il raggiungimento dei probiotici nella sede intestinale in forma attiva e vitale. 2. Produzione di acidi organici, importante per l azione battericida nei confronti dei patogeni. 3. Adesione all epitelio intestinale è considerato uno dei requisiti preliminari per la colonizzazione dei probiotici a livello intestinale al fine di esercitare il loro effetto benefico. Valutazione della resistenza al ph gastrico e alla bile Al fine di valutare la capacità degli isolati di sopravvivere ai succhi gastrici e al fluido intestinale, sono state condotte due prove in parallelo, trattando i batteri con succo gastrico artificiale (NaCl 125mmol/l, KCl 7mmol/l, NaHCO 3 45mmol/l, pepsina 3g/l) a ph=3.0 e a ph=7.0 come controllo al fine di valutare il solo effetto dato dalla variazione del ph e dalla presenza di pepsina. Il monitoraggio delle colonie vitali è stato effettuato mediante diluizioni seriali 1:10 in PBS sterile e semina su piastre di MRS agar dopo 0, 90 e 180 min sotto costante agitazione a temperatura ambiente. Dopo180 min, il succo gastrico è stato eliminato per centrifugazione e al pellet batterico è stato aggiunto il fluido intestinale artificiale (pancreatina 0.1% w/v, bile 0.3% w/v) a ph=8.0. Il monitoraggio è stato realizzato mediante diluizioni seriali e semina su piastre di MRS agar a t = 0, 90 e 180 minuti (corrispondenti a t = 180, 270 e 360 min dell intero esperimento). Nella figura 6 è schematizzata la metodologia adottata. Aliquote batteriche pure alla concentrazione di 10 8 CFU/ml Aggiunta di succo gastrico artificiale (pepsina) (ph3 e ph7 come controllo) Aggiunta di fluido intestinale artificiale (pancreatina e bile) (ph8) Tempi monitorati 0 min Figura 6: Test di resistenza al ph acido, al succo gastrico ed al fluido intestinale. 15

23 Sono state quindi create due tipi di curve: in una è possibile valutare la resistenza del ceppo all acidità del succo gastrico ed alla pepsina; nell altra, limitando la variazione del ph, vengono valutati solo gli effetti causati dalla pancreatina e dalla bile. Produzione di acidi organici La produzione di acidi organici (propionico, acetico, lattico, butirrico, iso-butirrico) è stata determinata tramite analisi gascromatografica. Lo strumento utilizzato è un gas-cromatografo Perkin Elmer Autosystem XL fornito di rivelatore FID. Valutazione della capacità adesiva in vitro Come modello in vitro dell epitelio intestinale è stata utilizzata la linea cellulare Int-407. Tali cellule sono di derivazione embrionale umana (2 mesi) e di origine ileo-digiunale. Utilizzando tale linea, è possibile costruire un modello in vitro dell epitelio intestinale, formato da un monostrato di cellule accoppiate da giunzioni strette e caratterizzate dalla presenza di una complessa struttura extracellulare. Possiedono inoltre microvilli corti e sparsi lungo l intera superficie cellulare. La valutazione dell adesione è stata effettuata in modo diretto su vetrino Chamber-Slide (Nunc Lab-Tek) con successiva colorazione di Giemsa. I batteri adesi sono stati visualizzati mediante un sistema microscopico (ingrandimento 100X ad immersione) collegato a software per analisi d immagine Image Vision (Media Cybernetics). L adesione è stata valutata in 20 campi microscopici casuali determinando la media dei batteri adesi per 100 cellule epiteliali ± deviazione standard (Gopal et coll., 2001). La metodologia adottata è schematizzata nella figura 7. Int-407: linea intestinale embrionale umana Step 1 Chamber slide (Nunc Lab-Tek ) Step 3 Colorazione di Giemsa Incubazione: 1 h 37 C, 5% CO 2 Step 2 Aggiunta di aliquote batteriche pure alla concentrazione di 10 8 CFU/ml diluite in DMEM (ph 5.0e ph 7.0) Ingrandimento:100x (immersione olio) Figura 7: Test di adesione al monostrato cellulare intestinale INT

24 L adesione all epitelio è stata valutata in diverse condizioni di ph. È infatti noto che il lume intestinale risulta essere basico mentre a livello dell epitelio si assiste ad una riduzione dei valori di ph. Come controllo negativo interno della metodologia considerata, si è utilizzato il ceppo di longum in quanto in nessuna delle condizioni considerate esso presentava un apprezzabile adesione (<10 batteri adesi per campo microscopico). Come controllo positivo si è utilizzato il ceppo di Bacillus coagulans in quanto in ogni condizione considerata presentava un adesione >100 batteri adesi per campo visivo. 17

25 4. RISULTATI FASE 1 SPERIMENTAZIONE IN VITRO IDENTIFICAZIONE DEI BIOTIPI DI BATTERI LATTICI INTESTINALI DEL VITELLO A CARNE BIANCA E SELEZIONE DEI CEPPI PROBIOTICI DA SOMMINISTRARE IN ALLEVAMENTO Isolamento dei batteri lattici di origine fecale Tutti i ceppi isolati dai campioni fecali sono stati sottoposti a ribotipizzazione per un totale di 145 analisi: per alcuni microrganismi è stata ottenuta direttamente l identificazione microbica mentre i ceppi microbici per i quali il RiboPrint non ha fornito alcuna identificazione di specie sono stati sottoposti a sequenziamento 16S rrna. I risultati sono riassunti nel grafico seguente: longum Streptococcus bovis Streptococcus macedonicus/bovis Lactobacillus animalis Streptococcus macedonicus Pediococcus spp. Lactobacillus paracasei ssp. paracasei Lactobacillus salivarius ssp. salicinius Bacillus coagulans Lactobacillus ruminis Lactobacillus fermentum Lactobacillus reuteri 5% 4%3% 3%2%2% 2% 2% 9% 9% 14% Lactobacillus delbrukii, Lactobacillus delbrukii ssp. lactis, Lactobacillus paracasei ssp. tolerans, Lactobacillus salivarius ssp. salivarius, Lactobacillus murinus e Streptococcus hominis (percentuale di identificazione < 1%) 45% Figura 8: Specie microbiche isolate dai campioni fecali di vitelli a carne bianca L identificazione di longum è stata confermata mediante sequenziamento 16S rrna. B. longum è risultato essere la specie batterica predominante tra i microrganismi isolati (44.6%) con un elevato numero di cloni diversi, come evidenziato nel dendrogramma seguente: Figura 9: Dendrogramma relativo ai ceppi isolati di B. longum e L. animalis (non è riportata la specie poiché alcune identificazioni non hanno ottenuto un indice di similarità > 0.85). Al gruppo VII è stato assegnato il Ribotipo DUP 13603; al gruppo XV DUP La freccia indica L. animalis DUP

26 Pearson correlation (Opt:1.56%) [0.0%-100.0%] VCA VCA la2*/20(13/12) 4*/17 apt */36 mrs 2006 species species species I II la3*/8(28/12) 2 4*/35 apt 2006 la2/34(12/12) 2 la17(6/12) 2005 la4*/1(28/12) 2 species species spp spp species III IV V la3*/17(28/12) la16apt(6/12) 2 la40 (12/12) 20 species spp spp VI la15apt(6/12) 2 la3*/20(28/12) la3*/42(28/12) spp species species VII 3*/41 mrs 2006 la3*/23(28/12) species species 2/ la2*/28(13/12) species species VIII 2/ */2 mrs 2006 species species IX la3*/37(28/12) la2/11(12/12) 2 species spp X la3*/25(28/12) la2*/6(13/12) 2 la7(6/12) 2005 la2*/21(13/12) species species spp species XI XIII XII XIV la2*/22(13/12) la4 (12/12) 200 species spp 2*/4 apt / / species species species XV la2*/18(13/12) species 2*/ la19(6/12) 2005 species spp XVI la3*/3(28/12) 2 la3*/9(28/12) 2 species species XVII la3*/36(28/12) la2/12(12/12) 2 la2*/26(13/12) la2*/25(13/12) species spp species species XVIII la3*/7(28/12) 2 4*/11 mrs 2006 species species IX XX la2*/14(13/12) Lactobacillus animalis la3*/35(16/12) la Lactobacillus Lactobacillus animalis animalis la3*/32(16/12) Lactobacillus species la3*/29(16/12) Lactobacillus animalis la3*/29(28/12) Lactobacillus animalis la3*/10(28/12) Lactobacillus animalis 3*/31 mrs 2006 la3*/27(16/12) Lactobacillus Lactobacillus animalis animalis la3*/40(16/12) Lactobacillus animalis la3*/15(28/12) Lactobacillus animalis 19

27 Per quanto riguarda i bifidobatteri, se consideriamo una similarità tra i diversi ceppi processati superiore all 80% possiamo identificare 20 raggruppamenti clonali: i più numerosi sono il DUP (gruppo VII) e il DUP (gruppo XV). Tale dato mette in risalto l alta variabilità clonale di B. longum. L. animalis è risultato essere un microrganismo poco diversificato poiché identificato con 2 soli ribotipi: DUP 5009 e DUP Gli altri batteri lattici presenti in percentuale elevata nei campioni fecali sono stati: Streptococcus bovis e Streptococcus macedonicus (figura 10). Pearson correlation (Opt:1.56%) [0.0%-100.0%] VCA VCA / / la3*/38(16/12) la22(12/12) 05 la20(12/12) 200 la la19(12/12) 200 la21 (12/12) 20 la27(12/12) 200 la24(12/12) 200 la4*/10(28/12) la la23(12/12) 200 la la4*/6(28/12) 2 la3 C 2005 la2(6/12) 2005 la4*/5(28/12) la3*/33(16/12) la8(12/12) 2005 la2*/1(13/12) 2 2/32 05 la2/38(12/12) 2 la4*/3(28/12) 2 la2*/18(13/12) la3*/12(28/12) la3*/1(13/12) 2 la3*/30(16/12) Figura 10: Dendrogramma relativo ai ceppi isolati di Streptococcus bovis/macedonicus (S. macedonicus è indicato con una freccia a lato). Streptococcus macedonicus non è risultato presente nella libreria del RiboPrint ; si è quindi proceduto ad un ulteriore identificazione mediante sequenziamento del 16S rrna con l uso di primer specifici confermando quindi la caratterizzazione effettuata mediante 20

28 ribotipizzazione e evidenziando due cloni di S. macedonicus molto distanti filogeneticamente fra loro. Dai risultati ottenuti sono stati selezionati per lo step successivo i seguenti cloni batterici, basandoci principalmente sulla loro prevalenza: o Lactobacillus animalis DUP 5009 o Streptococcus macedonicus (identificato mediante sequenziamento) o longum DUP o Lactobacillus salivarius ssp. salicinius DUP o Lactobacillus paracasei ssp. paracasei DUP o Bacillus coagulans Ribogroup S-1 Per quanto riguarda B. longum, è stato selezionato un microrganismo appartenente al gruppo XV risultato fra i due più numerosi. Si è scelto di non testare altri bifidobatteri poiché essi sono particolarmente delicati e richiedono notevole attenzione nella fase di conservazione del prodotto commerciale. Si è effettuata la valutazione probiotica di Streptococcus macedonicus e non di Streptococcus bovis poiché quest ultimo viene descritto in letteratura come agente di acidosi ruminale e come potenzialmente patogeno per l uomo (Tafe & coll., 2007). Infine è stato selezionato, anche se presente in bassa percentuale, B. coagulans perchè la sua capacità di formare spore risulta una caratteristica promettente per la somministrazione per via orale di un probiotico Valutazione delle qualità probiotiche Valutazione della resistenza al ph gastrico e alla bile Nelle figure 11, 12, 13 e 14 sono riportati i grafici relativi alla vitalità espressa come LogUFC (unità formanti colonia)/ml dei ceppi considerati dopo trattamento con succo gastrico e fluido intestinale artificiali. Considerando i risultati relativi a L. animalis (figura 11), si può vedere come il trattamento con succo gastrico a ph = 3.0 non provochi una riduzione significativa della concentrazione batterica e come l andamento della vitalità sia paragonabile al trattamento con succo gastrico a ph = 7.0. Anche dopo l aggiunta del fluido intestinale a ph = 8.0, le colonie contabili rimangono pressoché costanti. L andamento di questo ceppo risulta sovrapponibile al comportamento del ceppo di Bacillus coagulans (dati non mostrati). Per quanto riguarda L. salivarius ssp. salicinius (figura 12), il numero delle colonie visibili e contabili in seguito all aggiunta del succo gastrico a ph 3.0 e 7.0, rimane costante fino a 180 min. La variazione del ph da 3.0 a 8.0 successiva all aggiunta del fluido intestinale causa una riduzione significativa (P < 0.001) della vitalità batterica (8.65 ± 0.03 LogUFC/ml t = 0 vs 7.95 ± 0.02 LogUFC/ml t = 270 ph = 3.0). Nella curva di controllo a ph = 7.0 invece non è visibile questa variazione, per cui il ceppo risulta essere molto sensibile all alcalinizzazione 21

29 più che all aggiunta del fluido intestinale. L. paracasei ssp. paracasei (figura 13), ha un comportamento simile a L. salivarius ssp. salicinius. Anche in questo caso il numero delle colonie vitali in seguito all aggiunta del succo gastrico rimane costante all aggiunta del fluido intestinale (t = 180 min). La variazione del ph da 3.0 a 8.0 successivamente all aggiunta del fluido intestinale causa una riduzione significativa (P < 0.001) della concentrazione batterica, da 8.38 ± 0.14 LogUFC/ml (t = 0) a 7.06 ± 0.03 LogUFC/ml (t = 360, ph = 3.0). Anche questo ceppo risulta sensibile all alcalinizzazione in quanto non si assiste a nessuna diminuzione della vitalità batterica nella curva di controllo. Streptococcus macedonicus (figura 14) risulta essere il ceppo testato maggiormente sensibile. In seguito all aggiunta del succo gastrico a ph = 3.0 si assiste ad un calo della vitalità fino all azzeramento. Anche nella curva di controllo a ph = 7.0, si può notare una diminuzione molto significativa (P < 0.001) nella conta batterica causata dal tempo (8.58 ± 0.04 LogUFC/ml t = 0 vs 8.36 ± 0.01 LogUFC/ml t = 180) e dall aggiunta del fluido intestinale (8.58 ± 0.04 LogUFC/ml t = 0 vs 7.63 ± 0.02 LogUFC/ml t = 360). Il test di resistenza effettuato su longum non ha fornito risultati significativi in quanto necessita la messa a punto di metodi di indagine più laboriosi al fine di assicurare il mantenimento delle strette condizioni di anaerobiosi necessarie per la vitalità di questo specifico ceppo. LogUFC/ml Tempo (min) ph3 ph7 Figura 11: Effetto del succo gastrico e del fluido intestinale su L. animalis: la freccia indica l aggiunta del fluido intestinale ph = 8.0 a 180min 22

30 10 9,5 9 LogUFC/ml 8,5 8 7,5 * * ph3 ph7 7 6, Tempo (min) * P<0.001 Figura 12: Effetto del succo gastrico e del fluido intestinale su L. salivarius ssp. salicinius: la freccia indica l aggiunta del fluido intestinale ph=8.0 a 180min 10 9,5 9 LogUFC/ml 8,5 8 7,5 7 6,5 * * ph3 ph Tem po (m in) * P<0.001 Figura 13: Effetto del succo gastrico e del fluido intestinale su L. paracasei ssp. paracasei: la freccia indica l aggiunta del fluido intestinale ph=8.0 a 180min LogUFC/ml * * * ph3 ph7 1 0 * * * * Tempo (min) * P<0.001 Figura 14: Effetto del succo gastrico e del fluido intestinale su Streptococcus macedonicus: la freccia indica l aggiunta del fluido intestinale ph = 8.0 a 180min 23

31 Produzione di acidi organici L analisi degli acidi organici prodotti dai vari ceppi dopo 24 ore di crescita in anaerobiosi e microaerofilia, ha fornito i risultati esposti nella figura 15 indicati in mmol/l. Come standard di riferimento per i campioni analizzati sono state utilizzate soluzioni standard commerciali di acidi grassi volatili e acido lattico (Superchrom). La media della produzione di acido propionico risulta essere pari a ± mmol/l per tutti gli isolati. Per la produzione di acidi acetico e lattico è possibile osservare un effetto legato al ceppo, al tempo ed alla condizione di crescita in anaerobiosi o in microaerofilia, e per il quale potrebbe esistere una correlazione positiva con l attività antimicrobica dei probiotici contro i patogeni. Numerosi studi hanno associato l attività antagonista dei probiotici nei confronti dei patogeni alla produzione di acidi organici ed al successivo abbassamento del ph (Mishra & Lambert, 1996; Ouwehand, 1998). In modo particolare, l acido acetico possiede capacità inibitoria maggiore dell acido lattico (Ouwehand, 1998). I ceppi che producono acido acetico in maggiore quantità sono L. salivarius spp salicinius e L. paracasei spp. paracasei in microaerofilia seguiti da L. animalis e Bacillus coagulans in anaerobiosi. I maggiori produttori di acido lattico risultano L. animalis in anaerobiosi e L. salivarius spp. salicinius - L. paracasei ssp. paracasei in microaerofilia. Gli acidi butirrico ed isobutirrico e l etanolo sono invece presenti solo in tracce in tutti i ceppi testati (dati non mostrati). mmol/l Acido acetico L. animalis Bacilllus coagulans L. salivarius ssp salicinius L. paracasei ssp paracasei Anaerobiosi Microaerobic Acidolattico L. animalis Bacilllus coagulans L. salivarius L. paracasei ssp salicinius ssp paracasei Anaerobiosi Microaerofilia Figura 15: Produzione di acidi organici (mmol/l) da parte dei ceppi batterici testati 24

32 Valutazione della capacità adesiva in vitro I ceppi più adesivi risultano L. animalis e L. paracasei ssp. paracasei (tabella1, figura 16). L adesione di L salivarius ssp. salicinius risulta invece maggiore a ph acido. Tabella 1: Quantificazione dei batteri adesi alle cellule della linea Int-407. I dati sono presentati come numero medio di batteri adesi su 20 campi microscopici ± deviazione standard L. salivarius ssp. salicinius ph 7.0 L. salivarius ssp. salicinius ph 5.0 L. animalis ph 7.0 L. animalis ph 5.0 L. paracasei ssp. paracasei ph 5.0 e ph 7.0 Int-407 < ± ± ± 10 > L. animalis ph 7 2 L. animalis ph 5 Controllo negativo: B. longum 3 L. paracasei ssp. paracasei ph 7 4 L. paracasei ssp. paracasei ph 5 Controllo positivo p H5: B. coagulans Figura 16: Immagini acquisite con software Image Vision. Ingrandimento 100X ad immersione (sono cerchiati i batteri adesi in singolo e in aggregato) L utilizzo di metodologie scientificamente controllate che diano risultati statisticamente significativi e riproducibili, nonostante le difficoltà nel caratterizzare attendibilmente i ceppi probiotici usando metodiche in vitro, rimane un primo passo usufruibile nella scoperta di nuovi candidati probiotici (Annuk & coll., 2003; Sangalli & coll., 2004). I metodi considerati nella presente ricerca si sono rivelati semplici e veloci da utilizzare per un primo screening delle caratteristiche funzionali di un probiotico e soprattutto si sono dimostrati efficaci nel selezionare alcuni ceppi di batteri isolati dal contenuto fecale di vitelli, come possibili candidati probiotici. Anche se i risultati ottenuti in vitro non possono essere considerati lo specchio di un comportamento analogo in vivo, essi rappresentano una prima indicazione della loro abilità come probiotici (Fernandez et al., 2003). L insieme dei parametri da noi considerato si è rivelato un valido strumento discriminante l attività probiotica dei batteri isolati, considerando anche un ceppo batterico dalle note capacità 25