LA VALUTAZIONE INTEGRATA DEL RISCHIO ASSOCIATA ALLE ACQUE. Laboratorio di Chimica e Tossicologia dell Ambiente

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1 ISTITUTO DI RICERCHE FARMACOLOGICHE MARIO NEGRI Via Giuseppe La Masa, Milano MI Italy tel fax LA VALUTAZIONE INTEGRATA DEL RISCHIO ASSOCIATA ALLE ACQUE Laboratorio di Chimica e Tossicologia dell Ambiente Dott. Emilio Benfenati p.i. Marco Lodi

2 Schema a blocchi metodologico Monitoraggio relativo alla Qualità dell Acqua della Sorgente emissiva e dell Ambiente recettore Valutazioni Tossicologiche Computazionali Chimiche in SILICO Valutazioni Tossicologiche Sperimentali Biologiche in Vivo/Vitro Dimensionamento del peso tossicologico della sorgente I.T.F.M. (Indice Tox del Flusso di Massa) Valutazione del rischio tossicologico per l uomo e per l ecosistema I.T.R.A. (Indice Tox di Rischio Ambientale) Valutazione del danno ecotossicologico della sorgente e utilizzando organismi modello ( C.elegans- Alghe-Fitotest-Daphnia-Topo) Valutazioni degli effetti subcronici e cancerogeni della sorgente e del recettore acquoso sull uomo, utilizzando modelli cellulari umani (apparato Ematico,Epatico) Valutazioni di Tossicologia Medica Valutazione degli Indici Biologici di Esposizione sull uomo Studi di Proteomica, Metabolomica, e di Espressione Genica in organismi modello (cellule e/ o Celegans) o in campioni derivanti dal monitoraggio personale

3 Progetto FIRB RBIP/06993E_006 del Ministero dell Istruzione, dell Università e della Ricerca (MIUR).

4 L approccio ERICA comprende l applicazione di due indici tossicologici composti e indipendenti: ITFM = Indice tossicologico del flusso di massa, che traduce in termini tossicologici il flusso di massa emesso da una sorgente emissiva/immissiva ITRA = indice tossicologico di rischio ambientale, che valuta lo stato generale di salubrità ambientale di una area dovuto all impatto di inquinanti chimici generalmente emessi da sorgenti antropiche

5 L ITFM è uno strumento che permette di tradurre il flusso di massa complessivo di un processo produttivo in un flusso tossicologico basandosi sul concetto di equivalente di tossicità. Indice Tossicologico del Composto Indicatore ITCI = Quantità del composto chimico (massa/die) Equivalente di Tossicità (massa/die) La quantità del composto di interesse viene calcolata dai flussi di massa del processo, moltiplicando la concentrazione del composto nella matrice per il volume o peso di matrice emessa giornalmente. L equivalente di Tossicità (ET) è calcolato sulla base dei dati tossicologici pubblicati da enti riconosciuti a livello nazionale ed internazionale (ISS ISPSEL EPA) ; sono le dosi di riferimento per la protezione della salute umana. ITCI ITFM

6 Le formule utili per derivare ET dipendono dal tipo di composto analizzato. In particolare, si hanno 2 differenti equazioni: Equazione per gli agenti tossici DOSE senza effetti avversi (mg/kg per die) X PESO uomo (kg) Equazione per gli agenti cancerogeni ( 1E 6 / Probabilità Incremento di Tumori) (mg/kg per die) x Peso uomo (kg)

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8 L indice Tossicologico di Rischio Ambientale (ITRA) è uno strumento a più livelli basato principalmente su un approccio a 3 componenti: analisi del rischio per i recettori ecologici analisi del rischio per la salute umana destino ambientale del composto.

9 L analisi degli inquinanti si basa generalmente sul rapporto PEC/PNEC ovvero sul confronto tra la concentrazione ambientale (Predicted Environmental Concentration, PEC) e la concentrazione di non effetto (Predicted No Effect Concentration, PNEC). Qualità Ecologica EQ=PEC/PNEC Le dosi di riferimento derivano da database accreditati internazionalmente (ECOTOX, IRIS, ISS), dalla letteratura scientifica peer reviewed oppure sono state predette con modelli QSAR riconosciuti a livello internazionale.

10 I dati relativi alle proprietà chimico fisiche provengono da database accreditati o, nel caso di dati mancanti, vengono calcolati utilizzando modelli QSAR predittivi validati e utilizzati a livello internazionale (EPIsuite, ACD, DEMETRA, TOPKAT, HAZARD EXPERT, CAESAR, DEREK, DRAGON, SPARC, ANTARES).

11 I livelli ambientali degli inquinanti analizzati sono usati come input per il calcolo della Dose Cronica Giornaliera (Chronic Daily Intake, CDI) CDI = Conc.Inq. X (ContactRateMatrixx ExpFreq x ExpDuring) (Peso corporeo x Tempo mediazione x ConvFact gg hh) L equazione generale è adattata alle diverse vie di esposizione del recettore attraverso l utilizzo di parametri espositivi descrittivi.

12 La CDI è utilizzata per il calcolo dell indice di qualità umana (Human Quality Index, HQ) e dell indice di rischio cancerogenico (Cancer Risk, CR) attraverso le equazioni: HQ = CDI/RfD (dose di riferimento per gli effetti tossici) CR = CDI x SF (Slope factor _FattoreProbabilitàIncerementoTumori )

13 Eco Alghe Daphnie C.Elegans Fitotest sulle acque Sui terreni irrigati Human Influenza della proliferazione cellulare Citotossicità Genotossicità Cancerogenesi chimica In modelli cellulari di interesse tossicologico (fegato, intestino, sangue) e su modelli specifici (es. per EDCs, per cancerogenesi)

14 12 punti di campionamento: 8 sul Lago di Garda, 2 sul fiume Mincio, 2 Depuratore di Peschiera (in e out);

15 Caratterizzazione chimica degli EDCs Estrazione in fase solida (SPE con cartucce in polystyrene divinylbenzene) Electrospray ionization liquid chromatography tandem mass spectrometry (ESI LC MS/MS) analysis with C8 column. Presenza di nonilfenolo, bisfenolo A ed erbicidi triazinici in tutti i punti di campionamento; Estrone ed estradiolo riscontrate nei due punti di campionamento del depuratore e nel Mincio; Concentrazioni paragonabili a quelle di altri corpi idrici europei.

16 Valutazioni computazionali in silico Analisi del rischio Uomo: ingestione cronica accidentale di acqua durante la balneazione, calcolo della dose cronica giornaliera e dell indice di rischio per gli effetti tossici; Eco: calcolo del quoziente di Rischio (HQ = PEC/PNEC) per alghe, daphnidi e pesci (fathead minnow, rainbow trout, zebrafish, common carp e medaka). Utilizzo di database internazionali (IRIS e ECOTOX); Utilizzo di modelli QSAR nelcasodidatimancanti.

17 Nessuna criticità per il rischio di effetti tossici nell uomo (Soglia di rischio HI =1, HI max nei punti di campionamento ) Criticità per il rischio di effetti tossici negli organismi acquatici (soglia di rischio HQ = 1) terbutilazina e desetil atrazina sono i composti con maggior impatto ecologico nelle condizioni da noi applicate

18 Valutazioni sperimentali Biologiche_Modelli in vitro Cellule epatiche (HepG2) utilizzate per lo studio della tossicità dei campioni di acqua tal quale mediante saggio di proliferazione cellulare a 72 ore (MTS assay). L acqua campione è stata utilizzata per diluire il medium di coltura concentrato (10X) 1 ml di medium + 9 ml di acqua campione. Nessun effetto citotossico registrato. Stimolazione della proliferazione nei campioni di Malcesine, Garda e per le acque di ingresso al depuratore

19 Valutazioni sperimentali Biologiche_Modelli in vitro Valutazione della proliferazione indotta dagli estratti contenenti EDCs in concentrazione non citossicitàsu cellule di tumore alseno responsive all estradiolo (E SCREEN assay). Gli estratti hanno indotto proliferazione significative nel modello utilizzato con effetti proliferativi paragonabili o superiori a quelli ottenuti con estradiolo puro nel range 1 10 pm. Possibile presenza di altri agenti stimolanti non identificati dall analisi chimica Una ulteriore caratterizzazione chimica ha evidenziato livelli significativi di Galaxolide e Tonalide, composti potenzialmente EDCs.

20 L interpretazione dei dati Valutazioni finali vengono effettuate dal gruppo di lavoro interdisciplinare relativamente ai diversi aspetti indagati con riferimento allo stato di salubrità dell ecosistema e danno dei recettori esposti.

21 Ringrazio per il contributo il nostro gruppo di lavoro formato da: Emilio Benfenati, Diego Baderna, Fabrizio Natolino, Andrea Colombo, Federico Teoldi, Luisa Diomede, Eva Negri Grazie a ecocenter_ecoreasearch per averci voluto nel gruppo di lavoro Pro Acqua