RIPRODUZIONE, PRODUZIONE, BENESSERE ANIMALE E SICUREZZA DEGLI ALIMENTI DI ORIGINE ANIMALE

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1 UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI SASSARI SCUOLA DI DOTTORATO IN RIPRODUZIONE, PRODUZIONE, BENESSERE ANIMALE E SICUREZZA DEGLI ALIMENTI DI ORIGINE ANIMALE Direttore Prof. Giovanni Garippa INDIRIZZO IN: Produzione e sicurezza degli alimenti di origine animale (XXIII CICLO) (coordinatore: Prof. Basilio Remo Floris) CARATTERIZZAZIONE CHIMICO-NUTRIZIONALE DELLA SANSA DI OLIVA MEDIANTE TECNICA NON INVASIVA NIRS (NEAR INFRARED REFLECTANCE SPECTROSCOPY) NELL OTTICA DEL SUO UTILIZZO IN ALIMENTAZIONE ANIMALE Docente Guida Chiar. mo Prof. Alessandro Zumbo Tutor Chiar. mo Prof Vincenzo Chiofalo Direttore Prof. Giovanni Garippa Tesi di dottorato del Dr. Giuseppe D Angelo ANNO ACCADEMICO

2 INDICE 1. INTRODUZIONE PAG Il comparto oleicolo PAG Produzione italiana di oliva PAG Fotografia del comparto olivicolo siciliano PAG Problematiche generali di impatto ambientale e smaltimento dei rifiuti PAG Tipologia del processo di estrazione dell olio PAG Le acque di vegetazione PAG Le sanse PAG Residui di potatura PAG La gestione dei reflui oleari: aspetti normativi PAG Costi di gestione e di smaltimento della sansa PAG Impiego delle sanse in alimentazione animale PAG Il NIRS (Near Infrared Spectroscopy) PAG La tecnica NIRS PAG La storia PAG Principi della spettroscopia NIR PAG. 36 1

3 2.4 Funzionamento della spettroscopia NIR PAG Strumentazione NIRS PAG Analisi quantitative mediante spettroscopia PAG La scelta del campione PAG La calibrazione PAG Impiego della spettroscopia NIR nel campo degli alimenti PAG SCOPO DELLA TESI PAG 48 4 MATERIALI E METODI PAG Descrizione dello strumento PAG Software di gestione PAG Controllo e funzionamento dello strumento PAG Prelievo dei campioni PAG Trattamento dei campioni PAG Organizzazione delle analisi in laboratorio PAG Sviluppo della calibrazione PAG Analisi statistica PAG RISULTATI E DISCUSSIONE PAG. 74 2

4 5.1 La curva di calibrazione PAG Confronto tra la metodica convenzionale AOAC e la metodica NIRS PAG Caratterizzazione nutrizionale PAG CONCLUSIONI PAG BIBLIOGRAFIA PAG. 81 3

5 1. INTRODUZIONE 1.1 Il comparto oleicolo europeo L'Unione europea, comprendendo i Paesi pionieri nella produzione di olio di oliva nella storia, è il principale produttore di olio di oliva nel mondo. Le statistiche mostrano che l 80,2% della produzione mondiale, pari a tonnellate è stato prodotto nei Paesi del Mediterraneo. Il settore olivicolo-oleario europeo sta affrontando oggi molti problemi che impongono un nuovo approccio produttivo. Infatti, nonostante il consumo mondiale di olio aumenti progressivamente (grazie al riconoscimento dei suoi benefici effetti sulla salute dei consumatori), poiché altri Paesi produttori, quali Turchia, Siria e Tunisia stanno incrementando la presenza e la competizione nei mercati, la posizione dominante dei produttori europei è fortemente minacciata. La coltivazione dell olivo ha sempre avuto una notevole importanza economica e sociale nei Paesi del Bacino del Mediterraneo. E, infatti, in Spagna, Italia e Grecia (Fig. 1) che si ottiene la maggior parte della produzione mondiale di olive, stimata intorno ai 10 milioni di tonnellate, di cui 9 milioni utilizzati per l estrazione dell olio di oliva. In Italia circa ton di olive sono destinate all industria di estrazione da cui si ottengono ton di olio, pari a circa al 25 % dell intera produzione mondiale. L industria frantoiana è caratterizzata dalla stagionalità e dall estrema dispersione delle aziende frantoiane. La lavorazione è eseguita in frantoi sparsi in tutto il territorio con capacità di trattamento medio-piccola che varia da 5 a 50 ton olive/d, (Pacifico, 1989; Di Giovacchino, 1996). 4

6 L'Italia, anche se ha molti più frantoi in totale (variando da a a seconda della fonte), ha ancora un numero elevato di impianti a pressione in attività. Il settore oleario italiano è caratterizzato da piccoli frantoi e si è sviluppato in forma artigianale, strettamente integrato con il turismo rurale e culturale. L'area coltivata in totale è di ha ed interessa produttori. La Grecia ed il Portogallo sono caratterizzati dalla piccola dimensione delle imprese e dal continuo impegno per modernizzare il settore. In Portogallo si stanno facendo grandi sforzi per migliorare la posizione nel mercato del proprio prodotto, sia attraverso l'intervento del Ministero dell Ambiente e del Ministero dell'agricoltura sia con l adozione di certificazioni di denominazione di origine. Attualmente, ci sono circa frantoi attivi. La Grecia, che ha un elevato numero di impianti di estrazione a pressione, è caratterizzata da un elevato numero di piccole aziende a conduzione familiare che variano sia per dimensione sia per attività. Si stima che attualmente siano in attività un totale di frantoi di cui un 70% di tipo a tre fasi ed il resto di tipo tradizionale. 1.2 Produzione italiana di olio di oliva E' importante conoscere la produzione di olio di oliva in Italia e soprattutto in Sicilia, in modo da avere un quadro più chiaro anche sulla produzione di sansa che viene prodotta in ogni campagna olearia. Su una media produttiva nazionale di milioni di quintali, più del 90% viene prodotto nelle regioni del Sud Italia, Puglia, Calabria e Sicilia hanno un'incidenza sulla produzione nazionale di circa il 90% di tutto l'olio di oliva che si produce ogni anno in Italia. La rimanente produzione è ripartita tra Toscana, Liguria, Umbria e Abruzzo. L'Italia è il secondo produttore europeo di olio di oliva con una produzione nazionale media di oltre 6 milioni di 5

7 quintali, due terzi dei quali extravergine e con ben 37 denominazioni (DOP) riconosciute dall'unione Europea. La struttura dell olivicoltura italiana negli ultimi anni risulta alquanto stabile. La superficie, riferita al 2009, investita a olivo da olio è pari a 1,16 milioni di ettari; tale area comprende anche la superficie ancora non in produzione (perché recentemente impiantata) che è di appena 20 mila ettari. Anche la produzione, sia raccolta sia totale, dopo il picco del 2004, risulta pur nella variabilità degli attacchi patogeni e nell alternanza produttiva delle diverse aree, alquanto stabile e pari, nel 2009, a 3,7 milioni di tonnellate, di cui appena 100 mila non raccolte. Le olive da olio rappresentano mediamente il 98% della produzione complessiva dell olivo, e conseguono una resa di trasformazione in olio di pressione appena inferiore al 18%. Come quella delle olive, anche la produzione di olio relativa al periodo è stabile, (Fig. 2) e pari per il 2008 a 0,61 milioni di tonnellate. Va ricordato che l olio italiano rappresenta circa un quarto (esattamente il 23,5%) di quello mondiale prodotto nel L analisi territoriale (Fig. 3) dei dati relativi al 2008 è molto interessante; si evidenzia infatti una forte concentrazione della superficie olivicola nel Mezzogiorno (78,8% del totale nazionale) a fronte di una discreta presenza nel Centro (18,8%) e di talune nicchie olivicole nel Nord (2,4%). Nel Mezzogiorno le principali regioni olivicole sono Puglia, Calabria e Sicilia, rispettivamente con 377, 192 e 159 mila ettari investiti a olivo; nel Centro primeggiano Toscana e Lazio, rispettivamente con 97 e 88 mila ettari. Nel Nord l unica presenza consistente riguarda la Liguria con 17 mila ettari. Nel 2008 è la Calabria che realizza sia la più elevata produzione media (5,5 ton per ettaro) sia la più consistente resa in olio (19,3%). 6

8 L indagine sulla struttura delle aziende agricole (SPA), che riguarda oltre 53 mila aziende, è la principale rilevazione agricola svolta in modo uniforme in tutti i Paesi dell Unione Europea; si tratta di una rilevazione campionaria svolta per intervista diretta che da risultati a livello regionale. Talvolta i risultati regionali divergono parzialmente da quelli conseguiti dalla Rilevazione sulle coltivazioni, che rappresentano il risultato di indagine estimativa molto dettagliata che fornisce dati a livello provinciale. L indagine SPA consente di analizzare la numerosità e le caratteristiche sia delle aziende sia dei loro conduttori e capi azienda. L ultima edizione della SPA è relativa al 2007 e determina ben 853 mila aziende olivicole di cui il 75,8% è localizzato nel Mezzogiorno, il 63,3% si trova in collina e il 14,8% in montagna. La superficie olivicola rappresenta circa un quinto (18,7%) della SAT (Superficie Agricola Totale) e un quarto (24,1%) della SAU (Superficie Agricole Utilizzate). Un terzo dei conduttori è formato da donne (33,7%). I conduttori presentano un età media elevata; infatti ben il 45,7% di essi ha almeno 65 anni mentre solo il 5,9% ha meno di 40 anni. Relativamente al titolo di studio, i capi azienda con licenza media o elementare costituiscono il 71,7% del totale. 7

9 1.3 Fotografia del comparto olivicolo siciliano La Sicilia è la terza regione italiana per superficie olivicola e per produzione di olio di oliva dopo Puglia e Calabria, e rappresenta la prima realtà a livello nazionale per la produzione di olive da mensa. Uno scenario che se da un lato rende l isola leader nel comparto, dall altro deve confrontarsi con una situazione di mercato poco confortante, infatti il prezzo dell olio nell ultima campagna è sceso intorno ai 3 euro/litro. Nel linguaggio quotidiano, è ormai molto diffusa l espressione: fare squadra, fare sistema e puntare alla qualità, ed anche nel comparto olivicolo sembra essere questa l unica risposta per potersi affermare e continuare a crescere ( Ricciardi, 2009). Il comparto olivicolo in questi ultimi anni rappresenta una realtà molto importante, così come testimoniato dai positivi orientamenti della domanda di mercato. In Sicilia il comparto olivicolo intercetta una superficie totale di ettari (Fig. 4) con una produzione di quintali, di cui q.li da mensa e q.li da olio (dati ISTAT, 2007). La provincia con la più alta percentuale di superficie olivetata risulta quella di Messina ( ha), seguita da Palermo ( ha), Agrigento ( ha) e Trapani ( ha). Per quanto concerne invece le produzioni (Fig.5), la provincia siciliana in cui si concentrano le maggiori produzioni olivicole è quella di Agrigento, con più di tonnellate di olive, seguita dalle province di Palermo, Catania e Trapani. Attualmente la coltura dell olivo conta 21 milioni di piante (dato AGEA, 1997/1998) e costituisce uno degli elementi che caratterizzano l agricoltura e il paesaggio siciliano. 8

10 A livello regionale in base al Censimento Generale dell'agricoltura del 2000 (ISTAT), le aziende olivicole ammontano a poco meno di , con un incremento rispetto al 1990 di oltre unità, concentrate soprattutto nelle provincie di Agrigento, Caltanissetta e Palermo. L olivicoltura siciliana è caratterizzata da un elevata polverizzazione, maggiormente accentuata nelle province di Messina, Catania e Palermo, testimoniata dal fatto che quasi il 70% delle aziende insiste su una superficie minore di due ettari. Solo il 6,2% delle aziende olivicole isolane possono infatti contare su superfici olivetate superiori ai 10 ettari, e sono maggiormente concentrate nelle province di Enna e Ragusa. (dati ISTAT, V Censimento Generale dell'agricoltura, 2000). La ricchezza dell olivicoltura siciliana è attestata dalle numerose varietà presenti ( Cerasuola, Nocellara del Belice e Biancolilla, nella Sicilia occidentale; Moresca, Tonda Iblea e Nocellara Etnea, nella Sicilia orientale) e dagli importanti premi ottenuti dagli oli isolani nei principali concorsi effettuati a livello nazionale ed internazionale. Ad oggi la Sicilia conta ben otto denominazioni di origine protetta (DOP) per la produzione di olio extra vergine di oliva Monti Iblei, Valli Trapanesi, Val di Mazara, Monte Etna, Valle del Belice, Valdemone, Colli Nisseni e Colline Ennesi (Tab.1). Le ultime due hanno ottenuto la protezione transitoria nazionale. Tra gli altri punti di forza si devono menzionare anche, il patrimonio genetico autoctono che permette di ottenere produzioni di elevata qualità, un ambiente pedoclimatico favorevole, (nonostante l ampia variabilità), una rilevante consistenza delle aziende in agricoltura biologica, ed una elevata estensione della superficie a denominazione di origine protetta. 9

11 La filiera presenta anche parecchi punti deboli, quali i limiti strutturali, non facilmente rimuovibili, le ataviche carenze professionali, in particolar modo sul fronte della capacità imprenditoriale in crescita, ma non ancora competitiva, un offerta molto frammentata, la carenza di piani di qualità, e obbiettivi strategici aziendali per migliorare la percezione della qualità nel consumatore, ma anche la scarsa consapevolezza del patrimonio olivicolo autoctono sotto l aspetto agronomico e l insufficiente conoscenza dei caratteri chimici e organolettici degli oli monovarietali delle cultivar autoctone, ed ancora una insufficiente azione a sostegno della immagine del prodotto siciliano e gli alti costi di produzione. A queste tante carenze la soluzione migliore è quella di produrre bene continuando a migliorare la qualità della produzione olearia e delle olive e puntare alla crescita professionale dell imprenditoria. Tutto questo richiede ovviamente una tutela della tipicità ed un miglioramento dei servizi alle imprese, con una particolare attenzione rivolta al trasferimento delle innovazioni e all assistenza tecnica, in modo da affrontare le sfide ed essere competitivi con la concorrenza dei Paesi della nuova olivicoltura (Catagnano, 2009). Negli ultimi anni, grazie alla promozione del legame olio-territorio siciliano che ha portato alla realizzazione delle Vie dell Olio, si è assistito ad un notevole sviluppo del turismo attraverso la costituzione di itinerari volti a coinvolgere le aziende produttrici e a promuovere, oltre alla conoscenza dei prodotti, anche la diffusione del valore ambientale, storico e paesaggistico delle zone di produzione. I dati relativi all import-export di olio siciliano tra il 2000 e il 2006 dimostrano una cospicua crescita delle esportazioni, principalmente verso gli Stati Uniti e la Spagna, sia in termini di prodotto (8,7 mila tonnellate nel 2006 contro le 2,2 mila 10

12 del 2000, con un incremento del 290%) che di valore (più di 31 milioni di Euro nel 2006 a fronte di poco meno di 7,5 milioni nel 2000, con una crescita percentuale del 317%). Per quanto concerne le importazioni, a fronte di quantità di olio importato (quasi esclusivamente da Spagna e Grecia) si registra, nel 2006, un incremento in valore del prodotto del 75% rispetto al 2000 a conferma della progressiva crescita registrata, negli ultimi anni, del prezzo dell olio sui mercati internazionali. Per quanto riguarda l attività di trasformazione nella campagna 2001/2002 risultavano attivi in Sicilia 653 frantoi divenuti 687 nella campagna 2004/05 con un incremento valutabile intorno al 5%. Di questi, il maggior numero risulta localizzato nelle province di Palermo (143) e di Messina (131). La capacità media di lavorazione delle strutture di trasformazione mostra una notevole crescita tanto che nella campagna 2004/05 sono state molite 404 mila tonnellate di olive contro le 216 mila della campagna 2001/02 con un incremento percentuale pari all 87% dovuto alla crescita delle potenzialità produttive dei frantoi che utilizzano tecniche di molitura ed impianti certamente più moderni ed automatizzati (impianti continui). La quantità di olio prodotto rispetto al totale delle olive molite (resa), evidenzia una certa riduzione (20,3% della campagna 2001/02 rispetto al 12,5% della campagna 2004/05) da attribuirsi, comunque, all andamento climatico e quindi al contenuto di acqua delle olive prodotte durante le due campagne considerate. Nelle seguenti tre tabelle è rappresentata la situazione olivicola a livello siciliano negli anni 2007 (Tab. 2), 2008 (Tab. 3) e 2009 (Tab. 4), in termini di: - superficie coltivata, - produzioni di olive da tavola e da olio, 11

13 - produzione totale di olio. 1.4 Problematiche generali di impatto ambientale e smaltimento dei rifiuti dell industria olearia "Viviamo in un pianeta inserito in una delicata ed intricata rete di relazioni ecologiche, sociali, economiche e culturali che regolano le nostre esistenze. Se vogliamo raggiungere uno sviluppo sostenibile, dovremo dimostrare una maggiore responsabilità nei confronti degli ecosistemi dai quali dipende ogni forma di vita, considerandoci parte di una sola comunità umana, e nei confronti delle generazioni che seguiranno la nostra. Il Vertice di Johannesburg 2002 rappresenta un'opportunità per l'impegno di costruire un futuro più sostenibile." Kofi Annan Segretario Generale ONU 12

14 Fra le difficoltà che l industria moderna, in particolare quella agro-alimentare, si trova a dover fronteggiare, il trattamento dei reflui occupa certamente un ruolo di primissimo piano. Il marcato carattere inquinante di taluni reflui unitamente agli elevati costi da affrontare per il loro efficace smaltimento, in ottemperanza alle normative vigenti, rendono la loro gestione particolarmente impegnativa. L industria olearia rappresenta, nel comparto agro-alimentare, una realtà fortemente penalizzata dai processi di smaltimento dei reflui. Lo smaltimento delle acque di vegetazione e delle sanse delle olive costituisce uno dei maggiori problemi ambientali nel bacino del Mediterraneo, in particolare per Paesi come la Spagna, l Italia, la Grecia, la Tunisia. 1.5 Tipologie del processo di estrazione dell olio Il processo di estrazione dell olio dalle olive, sia in continuo sia in discontinuo, schematizzato in figura 6, è riconducibile alle seguenti fasi: pulitura e lavaggio delle olive, frangiatura delle olive, gramolatura della pasta ed estrazione della fase oleosa dalla fase acquosa. La produzione di olio è caratterizzata dalla formazione di due principali sottoprodotti: le acque di vegetazione e la sansa. 13

15 La prima è una fase liquida torbida di colore marrone ad alto contenuto di composti organici quali zuccheri, grassi e polifenoli, la seconda, invece, solida umida costituita da bucce e semi di olive. L evoluzione della tecnologia di estrazione ha determinato una sensibile riduzione dell impiego degli impianti di estrazione discontinui a pressione, che richiedono molta manodopera, a favore di impianti continui trifasici che puntano all utilizzo del sistema centrifugo per la separazione delle fasi. 1.6 Le acque di vegetazione Il principale sottoprodotto della lavorazione delle olive è dato dalle acque di vegetazione (AV), che derivano dall acqua di costituzione della drupa e dall acqua impiegata per la diluizione della pasta delle olive e per il lavaggio delle macchine. I frantoi più moderni basati su tecniche estrattive continue per centrifugazione producono fino a 1,5 mc AV/t olive, quelli tradizionali basati su metodi discontinui per pressione intorno a 0,4 mc AV/t olive. Le tecnologie estrattive stanno evolvendo rapidamente e tale evoluzione risponde all obiettivo principale che è quello di ottenere acque col più basso contenuto di olio; negli impianti per pressione il risultato è di circa 2-8 g/l, corrispondente a circa 0,1-0,4 Kg /100 Kg di olive. L inconveniente legato alle ragguardevoli quantità di acqua di scarico è stato affrontato di recente con l introduzione di sistemi di centrifugazione cosiddetti a due fasi o a tre fasi, sistemi, comunque, a cui ma non mancano le controindicazioni (perdita di olio, eccessiva umidità della sansa inutilizzabile come combustibile). 14

16 Complessivamente in Italia in ogni campagna olearia, compresa nell arco di giorni a partire dal mese di novembre, si producono circa mc di AV, di cui oltre mc di AV nella sola Puglia (Pacifico, 1989; Di Giovacchino, 1996). La composizione delle AV cambia notevolmente a seconda del processo di estrazione dell olio (per pressatura o per centrifugazione), delle caratteristiche e qualità delle olive di partenza e della pratica adottata per la loro raccolta (pelatura meccanica o per scuotimento (Pacifico, 1989). La frazione acquosa delle olive è, in relazione alle caratteristiche del raccolto, circa il 40-50% del peso della drupa; l acqua aggiunta per il lavaggio delle olive corrisponde a circa il 5% del peso delle olive lavorate, mentre quelle di lavaggio degli impianti di estrazione rappresentano il 5-10% del peso delle olive. Pertanto risulta che il refluo prodotto nel processo di estrazione tradizionale dell olio corrisponde al 50-65% del peso delle drupe lavorate. Nel caso dei processi di estrazione centrifuga (impianti continui), la quantità specifica di refluo aumenta in relazione all aggiunta di acqua usata per la fluidificazione delle paste in fase di estrazione al fine di agevolare la fuoriuscita dell olio. Ne consegue che la produzione di refluo acquoso raggiunge valori che oscillano, in relazione alle caratteristiche della pasta ed alle condizioni di estrazione, tra volte il refluo ottenuto nel processo di estrazione tradizionale (Roig et al., 2006). Ciò comporta un maggior grado di diluizione delle acque di vegetazione a fronte di una maggiore portata da trattare. Processi mirati al miglioramento della qualità dell olio prevedono la modifica del ciclo di estrazione centrifuga da trifasico a bifasico, riducendo o eliminando l aggiunta di acqua, influenzando in tal modo l intera filiera olearia. Pertanto, gli 15

17 impianti di estrazione olearia si stanno, attualmente, specializzando secondo direzioni che prevedono sempre una riduzione sensibile nell immissione dell acqua durante il processo di lavorazione. I suddetti sistemi innovativi di estrazione centrifuga bifasica prevedono che la pasta olearia possa essere frazionata in due sole fasi, olio e sansa molto umida, oppure in tre fasi e cioè olio, sansa meno umida e piccole frazioni di acqua. Benché i processi bifasici di estrazione dell olio non producano grandi quantità di acque di vegetazione essi risultano, dal punto di vista ambientale, meno adeguati dei processi trifasici; infatti la sansa prodotta nel processo bifasico contiene sia le frazioni solide delle olive sia il carico organico e l acqua delle acque di vegetazione, risultando non idonea al tradizionale smaltimento per combustione. Si viene inoltre quasi a raddoppiare l ammontare di sansa prodotta che peraltro non può essere utilizzata per l estrazione dell olio con esano (olio di sansa) per l elevato contenuto in umidità (58-62%). Nel processo continuo trifasico, mediante gli impianti tradizionali, si ottengono una sansa con umidità accettabile (48-54%) ed elevate quantità di acqua di vegetazione. Le AV hanno un colore che va dal rosso al nero, secondo lo stato di degradazione dei componenti fenolici delle olive. L'aspetto è torbido, l odore è di olio di oliva ma può essere anche molesto se si sono avuti fenomeni di irrancidimento o peggio di fermentazioni anaerobiche (Hamdi, 1993). Le AV contengono, in soluzione ed in sospensione, numerosi componenti, soprattutto organici di origine vegetale e possono essere considerati esenti da microrganismi e virus patogeni nonché da sostanze organiche e inorganiche xenobiotiche potenzialmente inquinanti e/o tossiche (Balice et al., 1990). 16

18 Nella tabella 5 sono riportate le caratteristiche chimico-fisiche delle AV provenienti da impianti tradizionali e continui a tre fasi (Pacifico, 1989). Tabella 5 Composizione delle acque di vegetazione Dall'analisi dei dati si rivela l'estrema variabilità, dal punto di vista quantitativo, della composizione delle AVO mentre, sotto l'aspetto qualitativo, la loro composizione è identica, data la loro stessa origine e natura. 17

19 Il colore scuro (da bruno a nero) dell acqua di vegetazione è dovuto alla presenza di un pigmento di natura catecolmelaninica costituito da un polimero, a diverso peso molecolare, che si forma dagli o-difenoli di cui il refluo è ricco, ed in particolare dall oleocianina per azione della fenolossidasi in presenza di aria. Il valore del ph, comunque basso, dipende soprattutto dalla varietà e dallo stato sanitario e di maturazione delle olive. Il ph può diminuire in seguito a causa delle fermentazioni che avvengono naturalmente nelle acque stesse; in particolare il ph è determinato dal contenuto di acidi organici quali malico, citrico, tartarico, succinico e ossalico. La frazione organica contiene zuccheri, tannini, composti fenolici, polialcoli, pectine, lipidi e sostanze azotate e determina l'elevato potere inquinante delle acque di vegetazione caratterizzate da valori di COD (domanda chimica di ossigeno) e BOD5 (domanda biologica di ossigeno) molto alti (Feria, 2000; Borja, 1997): COD g/l, BOD g/l. Gli zuccheri sono le sostanze organiche che prevalgono, in particolare gli zuccheri fermentescibili quali glucosio (70%), mannitolo (14%), fruttosio (10%), saccarosio (5%), galattosio (1%). Per quanto riguarda la componente azotata sono stati riscontrati tutti gli aminoacidi in particolare l'acido glutammico e la prolina (Salvemini, 1985). Bisogna inoltre tener presente che durante lo stoccaggio in vasconi di lavaggio, dove le AVO sostano per tempi più o meno lunghi prima dello smaltimento, la concentrazione di alcuni composti organici facilmente fermentescibili diminuisce per l'azione dei microrganismi aerobi ed anaerobi, il ph generalmente aumenta, mentre il BOD5 tende a diminuire, così come la quantità di solidi sospesi che tendono a sedimentare. 18

20 1.7 Le sanse Dalla lavorazione delle olive in aggiunta alle AVO si ottengono altri sottoprodotti: la sansa vergine proveniente da impianti a pressione e da impianti centrifughi a tre fasi e la sansa umida proveniente dai sistemi centrifughi a due fasi (Amirante et al., 1993). Di norma da 100 Kg di olive si ottengono circa 50 Kg di sansa. La sansa vergine viene normalmente ceduta al sansificio per l'estrazione mediante solvente (esano) dell'olio residuo dopo un'opportuna essiccazione. I sansifici recuperano dalla sansa circa il 3% di olio. Recentemente al problema dello smaltimento delle acque di vegetazione altamente inquinanti, si aggiunge quello delle sanse. Con la crisi dell olio di sansa e dei sansifici, attualmente le sanse vengono ritirate senza nessun corrispettivo e costituiscono un prodotto da smaltire. Le sanse vergini provenienti dagli impianti continui, specie quelli a due uscite, a dispetto di quelle provenienti da impianti per pressione sono caratterizzati da un livello di umidità di gran lunga superiore rispetto a quello delle sanse provenienti dagli impianti a pressione con notevole incremento dei costi di essiccazione per il sansificio. Parlando della media italiana, il 75% delle sanse prodotte viene inviato ai sansifici, il 20% viene sparso su terreno agrario, il resto (5%) viene impiegato per la realizzazione di compost (http://www.legno-olivo.biz/sansa.html). È di fondamentale importanza infatti che la sansa venga prontamente essiccata, al fine di evitare il suo deterioramento e per arrestare le fermentazioni ad opera dei 19

21 microrganismi presenti che potrebbero portare a processi biologici alternativi dannosi per la qualità dell'olio di sansa, come ad esempio un innalzamento dell'acidità. Il valore della sansa d'oliva dipende anche dal contenuto d'olio residuo e dal tenore d'umidità; le sanse provenienti da impianti tradizionali e da quelli centrifughi a tre fasi risultano migliori delle sanse umide in quanto hanno una più bassa concentrazione d'acqua ed un più alto contenuto d'olio (Tab. 6 e 7) (CNR- MURST, 2004). Tabella 6 Caratteristiche della sansa da impianto tradizionale Tabella 7 Caratteristiche della sansa umida da impianto centrifugo a due fasi 20

22 Dall'estrazione dell'olio di sansa vergine si ottiene, come sottoprodotto, la sansa esausta, che viene usata soprattutto come combustibile. L'olio di sansa viene successivamente raffinato per essere utilizzato ai fini alimentari in miscela con olio vergine d'oliva (Ministero delle Politiche Agricole e Forestali, 2001). 1.8 Residui di potatura Inoltre, la coltivazione dell olivo produce i residui di potatura che sono attualmente trascurati e considerati come uno scarto. Questo aumenta i costi per il trattamento dei sottoprodotti e comporta un più pesante costo economico e ambientale. Ultimamente, è insorto un nuovo problema: l aumento dei costi di produzione dovuto alla situazione corrente di prezzi in aumento dell'elettricità, assolutamente necessaria per la produzione. Gli attori di tutti i gruppi coinvolti concordano sulla necessità di un approccio più sostenibile agli schemi produttivi affinché, senza trascurare la produttività, l impatto ambientale sia tenuto in considerazione. In tale ottica, negli ultimi anni la ricerca si è impegnata ad individuare le possibilità di ulteriori usi dei sottoprodotti, acque reflue dei frantoi e sansa, e le iniziative per offrire soluzioni all'industria olearia. Anche se sforzi considerevoli sono stati fatti per trasferire i risultati ottenuti nella pratica, finora la maggior parte delle associazioni di produttori locali manca di una guida chiara adattata alle loro necessità negli specifici campi. 21

23 Il problema dello smaltimento dei reflui dell industria olearia è particolarmente avvertito nei paesi del mediterraneo. Il 50% delle spese di produzione dell olio dipendono dallo smaltimento dei reflui. Una potenziale via di smaltimento dei reflui oleari è rappresentata dalla fertirrigazione, essendo i reflui oleari ricchi di elementi minerali e componenti organici in grado di umificare il terreno. A tal proposito, il legislatore italiano ha emanato il Decreto Legislativo 574/96 in cui regola lo smaltimento delle acque di vegetazione mediante l utilizzo della tecnica della fertirrigazione. In esso vengono limitati i quantitativi di acque di vegetazione spargibili per unità di superficie nell arco di un anno a 50 m 3 per ettaro, per frantoi a processo discontinuo, e ad 80 m 3 per ettaro, per frantoi a processo continuo trifasico. Sono disponibili molte evidenze discordanti dei possibili effetti negativi che l applicazione dei reflui oleari tal quali, sia freschi, in uscita dai frantoi, che dopo un certo periodo di lagunaggio, ha sul suolo e sui comparti ambientali limitrofi, quali le acque profonde e superficiali, nonché sulla biomassa naturale del suolo. Il fatto che l applicazione di reflui oleari tal quali, cioè non sottoposti ad alcun trattamento correttivo e/o migliorativo, abbia dato e possa dare risposte sul suolo e sulle colture così diverse e contraddittorie, anche in funzione delle modalità e delle dosi di spandimento, non deve sorprendere se si considera che i potenziali siti di applicazione di tali reflui sono caratterizzati da elevata eterogeneità chimico-fisicobiologica, differente pratica agronomica e composizione della flora, differente clima e piovosità. Inoltre l elevata salinità e acidità delle acque di vegetazione associata all alto contenuto di sostanze polifenoliche ad effetto fitotossico, limitano la loro applicazione nella fertirrigazione. 22

24 1.9 La gestione dei reflui oleari: aspetti normativi La gestione delle acque di vegetazione dei frantoi è stata regolata per lungo tempo dalla Legge Merli (Legge 10 maggio 1976, n. 319) che assimilando le AV alle acque reflue di altra provenienza ne proibiva lo spargimento sui terreni agrari in relazione all elevato carico organico, decretando l obbligo di provvedere alla depurazione o di ricorrere allo smaltimento in discarica. Dopo numerosi decreti la materia è stata regolamentata ex novo dalla Legge 11 novembre 1996, n.574 recante norme in materia di utilizzazione agronomica delle acque di vegetazione e di scarichi dei frantoi oleari e dal Decreto Ministeriale del 6 luglio 2005 che stabilisce i criteri e le norme tecniche generali per l utilizzazione agronomica delle acque di vegetazione e delle sanse umide. In base alla Legge n.574/1996 le sanse umide e le acque di vegetazione, residuate dalla lavorazione meccanica delle olive che non hanno subito alcun trattamento né ricevuto alcun additivo possono essere oggetto di utilizzazione agronomica attraverso lo spargimento controllato su terreni adibiti ad usi agricoli. Tale spargimento, inoltre, deve essere realizzato assicurando un idonea distribuzione ed incorporazione delle sostanze sui terreni in modo da evitare di mettere in pericolo l approvvigionamento idrico e di nuocere alle risorse viventi ed al sistema ecologico. Sono comunque esclusi: i terreni posti a distanza inferiore a dieci metri dai corsi d acqua; i terreni situati a distanza inferiore a duecento metri dai centri abitati; i terreni investiti da colture orticole in atto; i terreni in cui siano localizzate falde; 23

25 terreni gelati, innevati, saturi d acqua e inondati; terreni con pendenza superiore al 15% privi di sistemazione idraulico agraria; boschi, giardini ed aree di uso pubblico ed aree di cava. L utilizzo agronomico dei residui oleari deve essere inoltre condizionato da un attento controllo della composizione chimica di tali reflui, al fine di individuare eventuali sostanze tossiche o nocive e quindi evitare fenomeni di inquinamento del terreno che possano dar luogo ad alterazioni irreversibili (Amirante, 1998; Amirante et al, 1999). Per quanto riguarda lo stoccaggio delle acque di vegetazione e delle sanse in base al Decreto Ministeriale del 6 luglio 2005 è vietata la miscelazione con effluenti zootecnici, agroindustriali o con i rifiuti di cui al D.Lgs n. 152/06. Il criterio guida per la fissazione da parte delle regioni del periodo di stoccaggio è quello di impedire gli spargimenti fino a quando perdurano le piogge e fino a quando i terreni si presentano saturi d acqua, al fine di tutelare i corpi idrici superficiali e sotterranei. I contenitori di stoccaggio devono quindi avere capacità sufficiente a contenere le acque di vegetazione nei periodi in cui l impiego agricolo è impedito da motivazioni agronomiche, climatiche o da disposizioni normative; essi devono altresì essere adeguatamente impermeabilizzati, mediante materiale naturale o artificiale, e coperti al fine di evitare fenomeni di percolazione ed infiltrazione. In qualche caso le scelte aziendali si sono orientate verso il trattamento con calce e decantazione dei fanghi smaltiti come rifiuto, oppure la sedimentazione lamellare con flocculazione e ossidazione del refluo, l ossidazione biologica e la 24

26 correzione del ph. I reflui trattati vengono conferiti al depuratore o ritirati da ditte autorizzate. Le sanse vengono generalmente cedute ai frantoiani che dispongono di aree per lo stoccaggio temporaneo di solito coperte, spesso impermeabilizzate, talvolta dotate anche di barriere di contenimento in qualche caso invece, non sono attivate precauzioni di alcun genere. La cessione al sansificio non sempre è possibile perché molti di essi hanno sospeso l attività per le mutate condizioni di mercato Costi di gestione e di smaltimento della sansa L eventuale assoggettamento della sansa alla disciplina dei rifiuti comporterebbe notevoli costi, non agevolmente sopportabili dai frantoi, specie se di minori dimensioni. Si pensi, ad esempio, oltre ai costi di trasporto e smaltimento/recupero, anche ai costi inerenti all osservanza delle norme dettate in tema di documentazione per i produttori di rifiuti speciali. Tali costi non sempre dipendono dal regime comunitario dei rifiuti, essendo talora conseguenza di scelte puramente nazionali assunte nel relativo recepimento (come la Corte di giustizia ha già avuto modo di evidenziare). Sebbene appaia arduo immaginare proposte di modifica normativa volte a migliorare tale aspetto per i soli frantoi (anche a causa dei problemi che ne deriverebbero con riguardo ai principi di eguaglianza e ragionevolezza) risulta evidente che la tematica non potrà e non dovrà essere ignorata dal legislatore nazionale. Si pensi, ad esempio, all obbligo di trasportare i rifiuti con veicoli adibiti 25

27 esclusivamente a tale scopo; tale obbligo applicato a materie naturali e non pericolose come la sansa può risultare davvero sproporzionato e privo di senso. Lo stoccaggio ed il trasporto delle sanse umide è regolato dall articolo 6 del Decreto Ministeriale del 6 luglio I costi di smaltimento per la sansa di olive si aggirano intorno ai 70 euro/ton., il prezzo è variabile in base alla qualità delle sanse; a tal proposito, il parametro che più viene considerato e monitorato è l acidità. Prima di essere impiegata per il compostaggio la sansa, viene infatti sottoposta ad analisi per verificarne lo stato ed eventualmente, se necessario, viene trattata. Ci sono delle apposite ditte che si occupano dello smaltimento delle sanse. Attualmente le sanse vengono per lo più inviate ad aziende di compostaggio che si occupano di produrre ammendanti destinati al comparto agricolo. Solitamente il trasporto, se non per distanze eccessivamente lunghe, non incide sul costo di smaltimento, in caso di percorsi lunghi la spesa per il sansificio può gravare di circa 20 euro in più sul costo complessivo Impiego delle sanse in alimentazione animale Le difficoltà incontrate in merito allo smaltimento dei rifiuti e la conoscenza delle caratteristiche qualitative della sansa hanno portato da tempo gli studiosi ad intraprendere delle strade alternative e delle soluzioni economicamente valide che consentono il recupero di una notevole quantità di sottoprodotti e che riducono i problemi di degrado ambientale. 26

28 Tra le diverse soluzioni un interesse particolare è stato ed è rivolto all impiego dei residui dell industria olearia nel settore zootecnico, sia nell ambito dell alimentazione dei ruminati che dei monogastrici. L impiego di sanse in alimentazione animale risale al 1935 (Maymone et al., 1935); nei periodi successivi e sino agli inizi degli anni 70, il problema dell impiego alimentare dei sottoprodotti oleari non è stato più attenzionato, molto probabilmente per fatti legati alle tecnologie di lavorazione delle olive poco evolute, o per la poca attenzione che in quegli anni veniva rivolta alle problematiche relative all impatto ambientale, all inquinamento, cioè a tutti quegli aspetti che oggi sempre più vengono considerati per la tutela del territorio e per la salute dell uomo. Oggi infatti, sia per le conoscenze più approfondite in ambito delle tecniche produttive impiegate per la coltivazione dell olivo, che hanno sensibilmente aumentato le rese di olive prodotte per ettaro di terreno, sia per l evoluzione dei sistemi di estrazione, che hanno permesso di velocizzare i tempi di estrazione riducendone i costi, la produzione di olio e di conseguenza di prodotti da smaltire, in particolar modo acque di vegetazione e sanse, hanno sollevato problemi delicati legati allo smaltimento. E in questo contesto che la zootecnia offre alcune soluzioni degne di nota. A tal proposito, parlando di utilizzo di sottoprodotti dell industria olearia in alimentazione animale, si deve però tener conto del modesto valore nutritivo della sansa pari a UFL (Nefzaoui,1991), direttamente legato all elevato tenore in fibra poco digeribile (Maymone et al., 1961). L indigeribilità è dovuta in parte al fatto che i composti cellulosici, così come quelli azotati, sono legati con la lignina e la cutina e non possono venire a contatto 27

29 con gli enzimi cellulosolitici e proteolitici che operano durante la digestione, ed in parte all elevato contenuto di polifenoli tannici che bloccano l attività degli enzimi ruminali. Di contro, non si deve trascurare il valido contenuto energetico, apportato dai lipidi. In ogni caso la somministrazione ai ruminanti di sansa deve essere fatta nella maniera più razionale possibile per evitare ripercussioni negative sulle fermentazioni ruminali (Devendra et al., 1974). Pieralisi et al. (1985) e Lanzani et al. (1988), hanno sviluppato un metodo basato sulla dispersione delle Acque di Vegetazione (AV), nelle sanse reflue di lavorazione e sulla successiva essiccazione della massa risultante. Le sanse arricchite, così ottenute, differiscono dalle convenzionali per una maggiore concentrazione di tutti i componenti inizialmente presenti nelle AV, soprattutto olio; inoltre, sfruttando l azione antifermentativa dei fenoli e dei polifenoli, sia le sanse che l olio contenuti nelle AV presentano caratteristiche fisico-chimiche ed organolettiche migliori. Bontempo et al. (1993) hanno condotto una prova utilizzando questa tipologia di prodotto nell alimentazione della pecora, per valutare l effetto che queste sanse arricchite avessero sulla produzione quantitativa e qualitativa del latte. I risultati ottenuti da questi studi, sono apparsi molto interessanti, in quanto la conservabilità delle sanse durante l intera prova è stata buona, ed inoltre non si è manifestata alcuna riduzione dell appetito da parte degli animali né ripercussioni negative sulla salute e sullo stato sanitario degli animali stessi. Per quanto riguarda le produzioni, è stato osservato che la maggior quota energetica introdotta nella dieta con la sansa ha contribuito ad innalzare la produzione di latte. Di contro però, la quantità di grasso del latte è diminuita, ma 28

30 questo era un dato atteso, in quanto quantità e percentuale di grasso e proteine sono inversamente proporzionali alla produzione di latte (effetto diluizione). Comunque, gli Autori non escludono che la diminuzione della percentuale di grasso nel latte, possa essere attribuita alla presenza di acidi grassi a lunga catena, acido oleico in particolare di cui è ricca la sansa, i quali possono aver influito negativamente con le fermentazioni cellulosolitiche ruminali, riducendo in tal maniera la produzione di acido acetico e butirrico, precursori del grasso del latte (Devendra et al. 1974). Tra gli aspetti positivi, sono stati evidenziati anche una migliore condizione corporea degli animali ed una maggior persistenza della curva di lattazione. A tal proposito si ricordi che un ottimo stato nutrizionale è positivamente correlato all attività produttività (Bauman et al., 1980; Taylor et al., 1991) e riproduttiva (Butler et al., 1992) L impiego di sanse nell alimentazione dei piccoli ruminanti pertanto, deve essere visto nell ottica di una parziale sostituzione sia della fonte fibrosa (fieno in particolare), che della fonte lipidica, soprattutto quando, a causa degli elevati costi, non è possibile procedere alla grassatura dei mangimi. Un altro studio, sempre sulle caratteristiche quali-quantitative del latte di pecora, è stato portato avanti da Chiofalo et al. (2004) i quali introducendo la sansa nell alimentazione della pecora hanno appurato che la stessa influenzava positivamente la produzione di latte senza modificarne la composizione chimica e l attitudine alla trasformazione casearia, elemento quest ultimo di grande importanza considerato che il latte ovino è destinato interamente alla trasformazione in formaggio. 29

31 Un altro punto di notevole interesse, è stata la valutazione dell aspetto economico, il mangime con l integrazione di sansa ha avuto infatti, un costo minore del 20% circa, rispetto al mangime classico, traducendosi in un forte risparmio economico per l allevatore (Liotta et al., 2001a). Altri studi sono stati condotti, sull introduzione della sansa vergine denocciolata nella dieta di agnelloni, per valutarne la digeribilità e l effetto nutritivo (Accardi et al.,1979). Da una prova condotta in campo, è emerso che durante i primi giorni della somministrazione gli agnelli alimentati con sansa hanno avuto un rallentamento nella crescita, mentre invece sia lo stato di salute che il comportamento degli animali non hanno subito variazioni. Dai dati ottenuti appare che, nonostante si siano ottenuti buoni indici di conversione, l effetto dell utilizzazione delle sanse è apparso inferiore rispetto a quanto ci si attendeva. Nonostante la denocciolatura, fase molto importante poiché riduce la percentuale di lignina presente nel prodotto, sono rimasti presenti parecchi frammenti di nocciolo, che essendo durissimi e spigolosi possono aver determinato microscopiche lesioni, e quindi uno stato subpatologico responsabile dell abbassamento dell utilizzazione nutritiva della razione (Accardi et al.,1979). Anche Dattilo et al. (1995), hanno somministrato la sansa di olive ad agnelli di razza Sarda, analizzando le performances in vitam, post mortem e la composizione acidica delle carni. I risultati ottenuti sono apparsi soddisfacenti. Sempre sugli agnelli sono state condotte dalla Sezione di Zootecnia del Dipartimento MOBIFIPA della Facoltà di Medicina Veterinaria di Messina diverse 30

32 prove riguardanti la sansa (Chiofalo et al., 2001; Liotta et al.,2001b Chiofalo et al., 2002). Una di queste ha riguardato l impiego di Vitamina E in agnelli alimentati con sansa d oliva, e la valutazione degli effetti sul profilo metabolico (Liotta et al., 2001a). Da tale lavoro è emerso che l impiego della sansa di olive non ha causato problemi di ordine metabolico e sanitario. Dopo le diverse prove effettuate sugli ovini, con risultati più che incoraggianti, si sono volute estendere le indagini ad altre specie animali, in modo da verificare l effetto e l eventuale impiego anche su monogastrici, che possiedono un sistema digerente totalmente differente dai poligastrici. E stata infatti utilizzata la sansa di olive sia nell alimentazione del coniglio che del pollo, utilizzando tutte le cautele del caso, visto che i monogastrici utilizzano poco o quasi per niente la fibra, frazione che è molto presente nella sansa. Per questo motivo e per facilitarne l impiego, la sansa è stata disidradata e parzialmente denocciolata. Leto e Giaccone (1981), hanno condotto una prova sui conigli, mettendo a confronto due miscele diverse, una preparata con l integrazione di sansa e l altra con il fieno di sulla, alimento molto diffuso ed impiegato negli allevamenti siciliani. La sansa oltre all importante tenore in lipidi, ha un sufficiente contenuto proteico, comparabile al fieno di sulla che di contro è povero in estratto etereo. La fibra potrebbe essere responsabile di una più intensa peristalsi, dal momento che il tubo digerente, con questa dieta, è risultato a fine prova di 40 g inferiore rispetto all inizio. Tale differenza si è tradotta in un maggiore incremento del peso 31

33 vivo netto, ed anche gli indici di conversione sono risultati più vantaggiosi nei conigli alimentati con sansa. Da un analisi della composizione acidica del grasso di deposito perirenale è emersa una notevole diversità tra i due gruppi, evidenziando una maggiore quantità di acido oleico nel gruppo sansa rispetto al gruppo sulla dove si è riscontrata una maggiore incidenza di altri acidi grassi. Da non sottovalutare anche l aspetto economico, infatti la differenza di prezzo tra i due alimenti era di circa il 60%, con la sansa che sul mercato aveva un prezzo più basso e sicuramente più conveniente per gli allevatori. Le conclusioni sono state che un alimento dalle caratteristiche chimiconutrizionali come quelle possedute dalla sansa, può simulare una grassatura indiretta del prodotto. Da questo punto di vista, alcuni autori hanno mostrato dei pareri discordanti; infatti esperimenti condotti dimostrano che la grassatura determinerebbe una diminuzione dell incremento ponderale, dell indice di conversione, e del consumo di alimento (Parigi Bini, 1968; Chiericato et al., 1972; Parigi Bini et al., 1974). Il risultato positivo osservato da Leto e Giaccone (1981), potrebbe essere attribuito alla natura dei grassi impiegati, trattandosi appunto di olio nella prova citata, mentre altri autori nelle loro prove hanno trattato grassi prevalentemente saturi e di origine animale. In un altra prova condotta da Kadi et al., (2004), è stato osservato che introducendo la sansa di olive in una dieta per conigli in sostituzione totale dell erba medica, del mais e dell orzo, e aumentando di contro la percentuale di farina di estrazione di soia, alcuni parametri sono risultati molto interessanti; in particolare: 32

34 - resa alla macellazione, maggiore nel gruppo alimentato con sansa, - peso del fegato più basso nel gruppo sansa, - peso del tratto digestivo pieno, più basso nel gruppo sansa, - costo della dieta più basso nel gruppo sansa Questo studio, come peraltro quello precedentemente visto con l impiego della sulla, testimonia l importanza della sansa di olive non solo come fonte nobile di lipidi, ma anche come fonte fibrosa, in alternativa ai foraggi che, in alcune aree geograficamente svantaggiate, non sono sempre disponibili durante l arco dell anno. Un prodotto come la sansa può rappresentare quindi una valida alternativa, e ridurre i disagi per gli allevatori legati alla produzione, alla conservazione, o eventualmente all acquisto di un buon fieno. L effetto positivo dell introduzione di sansa in alimentazione animale, ha riguardato anche il settore avicolo. In un lavoro svolto sull alimentazione dei broiler (Rabayaa et al., 2001), sono messe a confronto alcune diete, in cui la sansa sostituiva il mais nelle percentuali di 2,5%; 5%; 7,5%; e 10%. Da questa prova si è visto che la sostituzione con la sansa fino al 7,5%, fornisce degli enormi vantaggi, sia in termini di peso alla macellazione dei polli, sia in termini di costi (Rabayaa et al., 2001). 33

35 2. IL NIRS (Near Infrared Spectroscopy) 2.1 La tecnica NIRS Il NIRS nasce nel 1800 con gli esperimenti di Herscel, ma per due secoli circa questa scoperta resta solo come approfondimento di conoscenza dello spettro elettromagnetico. E solo nel 1973, che la spettroscopia NIR viene utilizzata per i prodotti agricoli, soprattutto per misurare umidità e proteine nei cereali. Negli anni 90, la spettroscopia NIR è diventata così ampiamente diffusa da trovare pratiche applicazioni in quasi tutte le industrie possibili. Al giorno d oggi ha abbandonato lo status di tecnica spettroscopica dormiente e si identifica tra le maggiori tecniche analitiche utilizzate per determinare le proprietà chimiche dei prodotti del settore agro-alimentare. Essa si va sempre più affermando per i più svariati fini scientifici quali ad esempio l individuazione di sofisticate adulterazioni e si dimostra capace con la sola esplorazione del campo spettrale, di risolvere problemi analitici complessi, grazie allo sviluppo di strumentazione e applicazione di tecniche chemiometriche. I vantaggi della tecnica NIRS sono rappresentati dal fatto che è relativamente costosa, poco inquinante se paragonata alle tecniche chimiche tradizionali, ed è in grado di eseguire contemporaneamente e rapidamente un gran numero di determinazioni a partire da un unico campione, riducendo anche i problemi legati al campionamento. Tra i metodi non distruttivi applicati in agricoltura, la spettroscopia nel vicino infrarosso (NIRS) è probabilmente la più utilizzata ed in continua espansione. 34

36 La letteratura in cui viene applicata la tecnica NIRS è in continua crescita tanto che, negli ultimi anni, sono stati pubblicati migliaia di articoli sia scientifici che applicativi su riviste scientifiche internazionali. Il settore agroalimentare è sicuramente quello in cui la tecnica è maggiormente diffusa; circa il 70% delle applicazione derivano da questo ambito. Le filiere più significative dove la tecnica NIRS è applicata sono quelle: lattiero-casearia, ortofrutticola, zootecnica, mangimistica, cerealicola, vitivinicola, olearia. Le ultime tre filiere, inoltre, grazie a strumenti NIRS online, possono essere monitorate durante tutte le varie fasi di produzione con determinazione in tempo reale dei parametri di interesse. 2.2 La storia La spettroscopia NIR è una tecnica non distruttiva che consente di analizzare virtualmente più componenti di qualsiasi matrice. Copre l intervallo di lunghezze d onda adiacenti il medio infrarosso e si estende fino al visibile. Storicamente la scoperta della regione NIRS, avvenuta nel 1800, è attribuita a Herschel che, separando lo spettro elettromagnetico con un prisma, verificò un aumento significativo della temperatura verso e oltre il rosso, nella regione che viene denominata vicino infrarosso. Sebbene un numero di esperimenti fosse stato fatto nei primi anni 20, fu solo alla metà degli anni 60 che la spettroscopia NIR trovò applicazioni pratiche. Nel 1976 fu Karl Norris del Dipartimento dell Agricoltura Americano che riconobbe le potenzialità di questa tecnica analitica e introdusse la moderna spettroscopia NIR come tecnica per il controllo della qualità e dei processi 35

37 industriali, grazie all introduzione di efficienti tecniche chemiometriche di gestione dei dati e allo sviluppo di nuove configurazioni di spettrofotometri basati su sonde a fibre ottiche (Williams et al., 1982). 2.3 Principi della spettroscopia NIR La (ASTM) definisce la regione NIRS dello spettro elettromagnetico come l intervallo di lunghezza d onda tra nm corrispondendo a un numero d onda tra cm -1. Le bande di assorbimento più significative sono attribuite agli overtoni e alle combinazioni di vibrazioni fondamentali relative ai gruppi funzionali CH, NH, OH. Le chiavi di lettura che determinano le proprietà degli eventi e degli spettri, per esempio la frequenza e l intensità delle bande di assorbimento NIRS sono l anarmonicità e la risonanza di Fermi, le cui basi fisiche e conoscenze più approfondite possono essere trovate in letteratura (Ciurczak, 2000; Bokobza, 2002). Le bande di assorbimento NIRS sono molto ampie e sovrapposte e sono volte più deboli delle loro corrispondenti bande di assorbimento nel medio-ir. Tali caratteristiche restringono fortemente la sensibilità nel senso della spettroscopia classica, e questo rende necessario l uso della chemiometria, e cioè di applicazioni matematiche alla chimica analitica (Williams P.C., 2001; Givens et al., 1998). Vengono in pratica, costruiti dei modelli matematici che mettono in relazione gruppi chimici funzionali o molecole di determinati costituenti dell alimento, con gli assorbimenti energetici della regione nel vicino infrarosso dello spettro, compresa tra i nm. In questa regione, sono misurate le vibrazioni degli 36

38 atomi di idrogeno legati ad atomi quali azoto, ossigeno, carbonio e ossigeno legato al carbonio. Gli assorbimenti dell energia elettromagnetica seguono la legge di Lambert-Beer, che descrive le proprietà di interazione di una sostanza con la radiazione elettromagnetica, in relazione alla concentrazione di un particolare costituente. Poiché molte materie prime risultano opache alla luce, la tecnica NIRS usa la radiazione riflessa (riflettanza) invece che quella trasmessa attraverso il campione (trasmittanza). La trasmittanza nel vicino infrarosso (NIT) può comunque essere utilizzata per caratterizzare materie prime e alimenti. Il basso coefficiente di assorbimento della tecnica NIR, tuttavia, permette una penetrazione più alta e profonda, e un aggiustamento dello spessore del campione. Questo aspetto rappresenta un vantaggio analitico della tecnica NIR rispetto alla NIT, poiché permette un analisi diretta di campioni fortemente assorbenti e con elevato effetto di scattering, quali ad esempio i liquidi torbidi e i solidi, sia in trasmittanza che in riflettanza senza la necessità di ulteriori trattamenti. Gli spettri IR si presentano come una serie di bande più o meno dettagliate, secondo lo stato fisico del campione. Gli spettri di campioni allo stato condensato, ossia liquidi o solidi, (come nel caso della carne), appaiono generalmente più semplici degli spettri di campioni gassosi. Nei solidi, infatti, non avvengono rotazioni molecolari e nei liquidi, a temperatura ambiente, le molecole si urtano prima di aver compiuto una rotazione completa. Informazioni più dettagliate sulla teoria dell assorbimento e sugli effetti di scattering sia in riflettanza diffusa che trasmittanza possono essere trovati negli articoli di Burger (1998) e Olinger et al. (2001). 37

39 Gli assorbimenti da parte di atomi o molecole, tipici di alcuni costituenti degli alimenti, descrivono in uno spettro, ottenuto graficando il log 1/R contro le lunghezze d onda, delle bande dovute alla sovrapposizione di assorbimenti minori. Tali bande, caratteristiche di alcune lunghezze d onda, sono dovute all assorbimento della radiazione elettromagnetica che, alle lunghezze d onda della regione spettrale del vicino infrarosso, provoca invece dei salti energetici quantizzati da stati fondamentali a stati eccitati, tipici di radiazioni a più alta energia, degli assorbimenti definiti come bande di combinazione e di overtones. Tali bande d assorbimento sono dovute a movimenti degli atomi nelle molecole, definiti come stretching e bending (stiramenti e piegamenti) che possono risultare simmetrici o non simmetrici lungo l asse del legame. Tali bande di overtones e di combinazione risultano molto sensibili e quindi dipendenti dalle proprietà chimiche e strutturali delle molecole. Ad esempio proteine che formano complessi con carboidrati o fibre, avranno differenti energie di assorbimento, rispetto alle proteine libere. La chemometria, che coinvolge una trasformazione matematica dei dati di riflettanza ed il calcolo dei coefficienti di correlazione ad ogni lunghezza d onda, seleziona contemporaneamente quelle lunghezze d onda che meglio corrispondono ai costituenti dell alimento oggetto di studio. In conclusione, la chemometria non fa altro che correlare dei dati analitici reali, determinati attraverso la chimica classica, a valori di energie di assorbimento a determinate lunghezze d onda dello spettro della radiazione elettromagnetica. Sono stati suggeriti diversi trattamenti matematici per manipolare i dati di riflettanza, e ciò indica che non ne esiste un unico ideale. 38

40 I dati spettrali, prima di procedere con la calibrazione vera e propria, possono essere pretrattati allo scopo di migliorare le prestazioni della calibrazione stessa. Le correzioni comunemente usate prevedono la SNV-detrending (Standard Normal Variate-detrending), MSC (Multiplicative Scatter Correction) e la derivatizzazione. Il detrending agisce riducendo sia l effetto light scattering dovuto alle dimensione delle particelle del campione, che la curvatura lineare e quadratica di ogni spettro riconducendo quest ultimo, pur mantenendo le sue caratteristiche, ad uno spettro target il quale può successivamente essere trattato come gli altri. Il trattamento matematico di derivata prima o seconda è di solito impiegato per amplificare assorbimenti, in determinate regioni spettrali, che possono spiegare differenze analitiche. La calibrazione di uno strumento che lavora in spettroscopia NIR si serve dell analisi multivariata dei dati spettrali attraverso modelli di regressione multipla dei valori di assorbanza (variabili X) connessi con i valori di riferimento (variabili Y) derivanti dalla chimica umida. Inizialmente sono state utilizzate due comuni variazioni della regressione multipla: la step-up e la stepwise. Successivamente sono stati sviluppati metodi alternativi di calibrazione, tra i quali Principal Component Regression (PCR), Partial Least-Squares regression (PLS) successivamente modificato in (MPLS) Modified Partial Least-Squares e l Artificial Neural Network (ANN). Non esiste un modello di calibrazione migliore in assoluto da usare in tutte le situazioni, ma la MPLS è risultata superiore alla regressione lineare multipla (MLR), poiché implica una standardizzazione delle variabili nella regressione ogni qualvolta che ciascun fattore viene calcolato. 39

41 2.4 Funzionamento della spettroscopia NIR Fig.7 - Assorbimento nel vicino infrarosso citarla nel testo Spettroscopia significa osservazione dello spettro. Questo tipo di analisi ha il suo fondamento nell interazione tra le radiazioni elettromagnetiche e la materia da analizzare. Le radiazioni del medio infrarosso (Fig.7) forniscono quanti di energia che causano cambiamenti nello stato energetico delle vibrazioni molecolari. Un campione irradiato assorbe l energia selettivamente in funzione della specifica frequenza di vibrazioni delle molecole presenti, creando così lo spettro di assorbimento. Lo spettro del medio infrarosso di un campione può consistere in un picco di bande di assorbimento dal quale è possibile identificarne tutti i componenti. A causa del forte rumore degli strumenti, lo spettro MIR (Midle Infrared Reflectance) non è utilizzato per le predizioni quantitative. La regione del NIR contiene bande di assorbimento corrispondenti a sovratoni e combinazioni delle vibrazioni fondamentali che avvengono nel MIR. Le vibrazioni fondamentali 40

42 riguardano legami -OH,- CH e - NH, caratterizzati dalla larga anarmonicità tipica del leggero atomo di idrogeno. Il NIR presenta insiemi di bande piuttosto complessi, che possono essere correlati, ma con difficoltà, ad un numero ristretto di gruppi funzionali XH n (-OH, -CH, -NH); l interpretazione di questi spettri richiede l impiego del computer (Cozzi et al., 2001). Tutti i legami organici hanno bande di assorbimento nella regione del NIR, mentre i minerali possono essere rilevati esclusivamente in complessi organici e nei chelati, oppure per i loro effetti sui legami dell idrogeno (Fig.8). Fig. 8 - Vibrazioni delle molecole dell acqua La Tecnica NIRS (Near Infrared Reflectance Spectroscopy) è un metodo di analisi secondario che sfrutta alcune proprietà fisiche della materia ed in particolare l interazione di questa con le radiazioni del vicino infrarosso. Questa tecnica si avvale della specifica capacità di ogni composto chimico di assorbire, trasmettere o riflettere la radiazione luminosa. 41

43 La combinazione delle proprietà assorbenti, combinate con quelle di dispersione dell energia luminosa, determina la diffusa riflettanza della luce, che contiene informazioni sulla composizione chimica del campione (Fig.9). Fig.9 Spettro relativo alla composizione chimica del campione Il tempo impiegato per una singola analisi varia da pochi secondi a pochi minuti. Questo metodo consente una rapida indagine di numerosi campioni con una notevole diminuzione di tempo e di costi rispetto alle tecniche tradizionali. I vantaggi della tecnica sono riconducibili principalmente: alla semplicità delle operazioni di preparazione del campione, alla varietà di analisi che è possibile effettuare, alla possibilità di riutilizzare il campione e all assenza di reagenti. Al contrario, si presentano di notevole complessità: la scelta del giusto algoritmo da utilizzare per l interpretazione dei dati e l accurata procedura di calibrazione della sofisticata attrezzatura; rappresenta inoltre uno svantaggio la dipendenza dai metodi chimici tradizionali ed il fatto che tale metodo è applicabile solo alla determinazione dei macrocomponenti del campione. 42

44 2.5 Strumentazione NIRS La spettrofotometria IR si basa sull assorbimento da parte di molecole o, più in generale, di composti delle radiazioni con lunghezze d onda comprese fra 0,78 μm (limite del visibile) e 100 μm. Quest ampia gamma spettrale viene suddivisa in tre regioni principali: - IR vicino (o NIR, Near Infra Red) da 0,78 a 2,5 μm - IR medio (o MIR, Mid Infra Red) da 2,5 a 50 μm - IR lontano (o FIR, Far Infra Red) da 50 a 100 μm Uno spettrofotometro NIR è generalmente composto da una sorgente di luce, un monocromatore, un campionatore o una intefaccia per la presentazione del campione e un detector per la misura in riflettanza e trasmittanza; il tutto viene gestito da un PC. La sorgente di luce è in genere una lampada alogena al tungsteno. I detector possono essere al silicio, al solfito di piombo (PbS) e all'arsenurio di indio e gallio (InGaAs). I detectors al silicio sono veloci, poco rumorosi, piccoli e altamente sensibili dalla regione visibile a 1100nm. I detectors a PbS sono più lenti ma molto diffusi poiché sono sensibili da 1100 a 2500nm e hanno un buon rapporto segnale disturbo. Il più costoso è il detector InGaAs che unisce la velocità e le caratteristiche dei detector al silicio utilizzando però l intervallo di lunghezza d onda del detector a PbS. Esistono varie configurazioni ottiche che possono essere usate per separare la regione spettrale policromatica NIRS in frequenze monocromatiche. Una descrizione dettagliata dei diversi principi possono essere trovati in vari testi (Workman et al. 2001, McCarthy et al. 2001, Kawata, 2002). 43

45 2.6 Analisi quantitativa mediante spettroscopia Prima che uno spettrofotometro NIR possa fare una analisi quantitativa è necessario sviluppare una calibrazione specifica per la matrice da analizzare usando metodi multivariati. Il processo di calibrazione principalmente prevede i seguenti passaggi: 1. Selezione di un numero di campioni rappresentativo, 2. Acquisizione degli spettri e determinazione dei valori di riferimento, 3. Modello multivariato relativo alle variazioni spettrali dei valori di riferimento delle proprietà analitiche del parametro di interesse, 4. Validazione del modello mediante cross validation, o validazione esterna La scelta del campione Per l analisi di nuovi campioni è necessario creare nuove curve di taratura specifiche, per le quali bisogna disporre di un adeguato e rappresentativo numero di campioni. Idealmente, il set di calibrazione dovrebbe avere la più ampia variabilità possibile dei costituenti e la migliore uniformità dei campioni. Un metodo proposto è quello delle componenti principali PCA, (Principal Components Analisys), metodo per il quale si scelgono i campioni in base al loro spettro e mediante l impiego di due algoritmi: il primo algoritmo serve per escludere i campioni con spettro anomalo (H<3, dove H è la distanza standardizzata 44

46 di Mahalanobis), il secondo è applicato ai campioni rimanenti, eliminando quelli con spettro troppo simile (H<0.6 ) La calibrazione L approccio chemiometrico è diffusamente utilizzato per mettere in relazione le proprietà fisico-chimiche dei campioni da analizzare con l assorbimento di radiazioni, nell intervallo di lunghezza d onda del NIRS. Le informazioni cercate devono quindi essere parallelamente determinate con una tecnica indipendente. Il primo passo consiste nella realizzazione di un esperimento di calibrazione, che comporta la creazione di un set di riferimento tramite la collezione di campioni che devono contenere tutte le possibili variazioni che si potrebbero trovare nei campioni sconosciuti. Una volta ottenuto un adeguato e rappresentativo numero di curve di taratura, bisogna scegliere una metodologia statistica adeguata per ottenere la calibrazione. La più classica è la regressione lineare semplice. Nel caso siano coinvolti un maggior numero di variabili, si utilizza la regressione lineare multipla che permette l ottenimento di stime più precise. In entrambi i casi l elevato grado di intercorrelazione tra assorbanze a diverse lunghezze d onda crea difficoltà. Migliori risultati si ottengono con il metodo PCR (Principal Component Regression) o con il sistema MPLS (Modified Partial Least Square); entrambi si basano sulle informazioni dell intero spettro, costruendo fattori che catturano tutta la possibile variabilità dei dati sperimentali. Ottenuta la curva di calibrazione, si dovrà procedere alla sua validazione realizzandola all inizio su un set di campioni noti, per procedere poi con nuovi campioni. In particolare, si può ricorrere alla validazione incrociata, escludendo di volta in volta dalla calibrazione un gruppo di 45

47 campioni selezionati per costruirla, per poi reinserirli nel passaggio successivo fino a che tutti i campioni siano stati considerati sconosciuti. Già da anni sono applicati sistemi rapidi di analisi utilizzando la tecnica NIR, che consente in tempi molto rapidi (da pochi secondi a qualche minuto) di predire la composizione chimica di un campione. Metodiche chimico-fisiche, in grado di eseguire contemporaneamente e rapidamente un gran numero di determinazioni a partire da un unico campione si vanno sempre più affermando. Il crescente successo della spettroscopia NIR nell'analisi non distruttiva, attraverso la determinazione di componenti di materiali senza estrazione ma con la sola esplorazione del campo spettrale, deriva dalle ampie possibilità dimostrate da questa tecnica di risolvere problemi analitici complessi, grazie allo sviluppo della strumentazione e all'applicazione di procedimenti chemiometrici sempre all avanguardia. 2.7 Impiego della spettroscopia NIR nel campo degli alimenti La spettroscopia di riflettanza nel vicino infrarosso (NIRS) è una tecnica utilizzata, ormai di consueto, per la valutazione della qualità nutrizionale di un ampia gamma di alimenti. I principi della tecnica furono sviluppati da Norris, (1976), una trentina di anni fa, gettando le basi per una nuova branca della chimica analitica applicata in campo agricolo. Per la prima volta, infatti nel 1976, Norris e i suoi collaboratori applicarono la tecnica nella valutazione della qualità dei foraggi (Norris et al.,1976). La tecnica NIRS possiede una precisione molto alta ed è divenuta rapidamente di ampio utilizzo nei laboratori; i vantaggi sono rappresentati dal fatto che è una 46

48 tecnica rapida, poco costosa, non richiede reagenti chimici, non produce prodotti di scarto, non crea problematiche di sicurezza e salute, non richiede grandi quantità né particolare preparazione del campione (solo una macinazione ed essiccazione) e non necessita di personale particolarmente addestrato una volta che le calibrazioni sono state sviluppate (Pla et al., 1997). Tutto ciò ha consentito la diffusione e l applicazione di tale metodica in molti settori di mercato: farmaceutico, tessile, chimico, cosmetico, dei biocarburanti, settore ultimamente sempre più in espansione, agro-alimentare. Nell ambito del settore agro-alimentare, il NIRS ha trovato un ampia collocazione, in quello delle carni; infatti quasi tutte le specie animali sono state studiate usando questo metodo al fine di determinare la composizione chimica della carne di coniglio (Masoero et al., 1994), pollo, agnello e anatra, etc. Le previsioni sono affidabili per i principali componenti della carne quali sostanza secca, proteine e lipidi. Altri usi che si possono fare sono: la determinazione qualitativa di un prodotto (Murray et al., 2001), l identificazione di una specie in base alla carne analizzata (Mc.Elhinney et al., 1999), l identificazione del tipo di alimentazione che è stata fornita all animale (Berzaghi et al., 2005), il tipo di conservazione che ha subito il prodotto (Windham et al., 1995). Il principale svantaggio della spettroscopia NIR è l alto costo iniziale dello strumento e la sua dipendenza dalla chemiometria, che ha portato a definire il NIRS con l ingiusto appellativo di black box, per la scarsa comprensione di come gli spettri NIRS potessero essere messi in relazione con la composizione del campione. 47

49 3. SCOPO DELLA TESI Alla luce dell importante ruolo che la Sicilia ricopre in termini di produzione di olio di oliva, e, da un attenta analisi sui delicati problemi legati allo smaltimento dei prodotti di scarto provenienti dall industria olearia, l obiettivo di questa tesi è stato quello di applicare l innovativa e rapida tecnica analitica NIRS allo studio della sansa di oliva, attraverso l impostazione di una curva di calibrazione in grado di determinare i principali parametri chimici composizionali di questo sottoprodotto. Scopo di questa tesi, è stato anche quello di mettere a confronto i risultati relativi ai parametri composizionali di campioni di sansa ottenuti con la metodica NIRS, e con le metodiche convenzionali AOAC al fine di evidenziare la corretta impostazione della curva di calibrazione. Infine, nell ottica di utilizzare questo sottoprodotto in ambito zootecnico quale fonte di importanti principi nutritivi a costi contenuti, si è voluto utilizzare la curva di calibrazione sviluppata per caratterizzare campioni di sansa di oliva ottenuti con due diversi metodi di estrazione a freddo e a pressione. 48

50 4. MATERIALI E METODI 4.1 Descrizione dello strumento L attività del dottorato in fase di avvio ha evidenziato la disponibilità sul mercato di due modelli, il Modello 5000 con un campo di misura NIR di nm ed il Modello 6500 con un campo di misura NIR di nm. Si è scelto di acquistare il secondo modello per avere un campo di misura NIR più ampio e per poter utilizzare in studi futuri anche l intervallo compreso tra i 400 ed i 700 nm che ricade nella regione del visibile; tuttavia è stato osservato che sotto i 1200 nm le bande di assorbimento sono troppo deboli e l analisi qualitativa per riflettanza risulta difficile, la stessa cosa vale anche per la regione superiore ai 2500 nm, in questo caso le bande di assorbimento sono così forti che le analisi risultano impedite. (AA.VV., 1989) Per lo sviluppo di nuove curve di taratura specifiche per l analisi della sansa di olive è stato quindi utilizzato il NIR 6500 FOSS. Questo strumento consente di determinare in modo rapido i valori chimici di materie prime, semilavorati, fieni, insilati e mangimi. Lo strumento è configurato con un sistema per la misura NIR in riflessione mediante tazzina rettangolare adatta ad analisi su prodotti macinati. 4.2 Software di gestione Lo strumento è fornito di un software di gestione funzionante in ambiente Windows denominato ISI (InfraSoft Iternational) e di un campione di controllo 49

51 standard. Tale campione di controllo ed il software Clone-1 TM hanno permesso di standardizzare fra loro diversi strumenti consentendo l uniformità dei risultati. Il sistema utilizza in software ISIscan TM ed è equipaggiato con il software WINISI III TM. Il programma ISIscan TM viene utilizzato per analisi di routine, il programma WINISI III TM viene utilizzato per lo sviluppo di nuove calibrazioni, la manutenzione di quelle esistenti e la gestione di reti con più apparecchi. 4.3 Controllo e funzionamento dello strumento Il funzionamento dello strumento NIR prevede, prima di effettuare qualsiasi analisi un accensione di almeno un paio di ore prima dell utilizzo, affinché la lampada sia ben calda, al fine di avere un fascio di luce omogeneo e costante durante l analisi. Le analisi sono state programmate affinché la prima lettura venisse sempre effettuata su una cella chiamata check cell, fornita insieme allo strumento, ove veniva posto il materiale di riferimento, e del quale si conoscevano i parametri relativi a : umidità, proteina grezza, lipidi grezzi, fibra grezza, e ceneri grezze. Nell arco di tre anni di attività del dottorato sono stati programmati controlli periodici sul NIR e settimanalmente sono stati eseguiti tre test, chiamati rispettivamente, instrument respons, wavelenght accuracy e photometric repeatability necessari ed indispensabili per monitorare lo stato delle componenti della sorgente luminosa ed avere precisione nell ottenimento dei risultati analitici. Considerato che i risultati erano il valore delle analisi e dei risultati, finalizzati alla creazione di un archivio di dati relativi a campioni di sansa di oliva del mercato 50

52 siciliano e calabrese, si è operato in collaborazione con il laboratorio NIRS, del Dipartimento di Scienze animali della Facoltà di Medicina Veterinaria dell Università di Padova, diretto dal professore Paolo Berzaghi, che vanta un esperienza pluriennale nel settore. 4.4 Prelievo dei campioni Per le procedure di calibrazione sono stati prelevati N.100 campioni di sansa di olive provenienti da diversi oleifici e frantoi presenti in Sicilia ed in Calabria. Il prelievo dei campioni è stato suddiviso in due fasi, il primo è stato programmato nella campagna oleicola 2008/2009 e l altro nella campagna 2009/ 2010; i campionamenti sono stati effettuati nei mesi di ottobre-gennaio, periodo in cui sia in Sicilia che in Calabria avviene la raccolta e la lavorazione delle olive. Sono stati campionati 50 campioni per ciascuna annualità. Nella campagna olearia 2010/2011, sono stati prelevati N.100 campioni di sansa utilizzati per la loro caratterizzazione mediante tecnica NIRS. Preventivamente, i protocolli di campionamento sono stati inviati agli oleifici che hanno campionato differenti partite di olive; tutto ciò ha permesso di campionare diversi lotti di sansa lavorati contemporaneamente. Tutti gli operatori hanno mostrato grande interesse al progetto di ricerca. Il prelievo dei campioni rappresenta una delle fasi più impegnative e laboriose per creare una curva di calibrazione ex-novo, come in questo caso quella creata sulla sansa di olive, poiché è fondamentale disporre di campioni differenti fra di 51

53 loro, in modo da fornire allo strumento dati analitici differenti e realizzare una curva robusta. Proprio per poter disporre di un data-set iniziale quanto più diversificato possibile, i campioni sono stati prelevati da impianti che utilizzano metodi di estrazione dell olio differenti e nello specifico: un sistema più evoluto di estrazione a due fasi che ha come sottoprodotto una sansa con una umidità superiore al 60%, ed un metodo di estrazione per pressione, più utilizzato soprattutto in passato e nelle aree più interne, che ha come sottoprodotto una sansa con un tenore di umidità intorno al 40%. Le differenze tra sanse prodotte da questi due sistemi di estrazione, sono apparsi evidenti già ad una prima ispezione visiva; infatti, le sanse ottenute col metodo per pressione sono risultate essere molto più grossolane rispetto alle altre ( Fig. 10). Figura 10 - Sansa ottenuta con sistema di estrazione a pressione (a sinistra), sansa in uscita dall impianto a due fasi (a destra). 52

54 Differenze interessanti e significative nella composizione chimica di questi sottoprodotti si sono registrate soprattutto nella fase analitica. 4.5 Trattamento dei campioni Le aliquote di sansa di olive prelevate sono state messe in appositi contenitori per alimenti (sacchetti di plastica o vaschette) (Fig.11), sottovuoto e refrigerate, in modo da conservare inalterate le caratteristiche di partenza. Figura 11 - Vaschette di sansa prelevate in oleificio Il protocollo sperimentale nella sua fase iniziale ha previsto l esecuzione al NIRS di n.3 letture su n. 2 campioni di sansa differenti aventi un tenore in umidità pari al 68% ed al 6%. Questa operazione è stata eseguita per poter acquisire i dati relativi agli spettri dei campioni, che successivamente sono stati inviati, al laboratorio NIRS di Padova che ha provveduto a standardizzare lo strumento. 53

55 Le letture sui campioni sono state eseguite preparando la tazzina, fornita insieme allo strumento con la quantità di sansa da sottoporre alla lettura, in modo da verificare la ripetibilità del dato (Fig.12, Fig.13 e Fig.14). In questa fase, la preparazione della tazzina ha previsto una accurata ed omogenea collocazione della sansa all interno della cella al fine di evitare la presenza di vuoti, per fare in modo che il fascio luminoso potesse investire il campione nella sua interezza. Alcuni test in fase di analisi hanno evidenziato infatti, che spazi vuoti producono delle alterazioni nella lettura, riportando informazioni che non appartengono al campione bensì alla tazzina, e di conseguenza non si ha la dovuta corrispondenza tra lo spettro del campione e l analisi eseguita in laboratorio. Figura 12 - Preparazione della tazzina 54

56 Figura 13- Chiusura della tazzina Figura 14 - Inserimento della tazzina nello strumento Il processo di analisi sullo strumento accuratamente standardizzato, ha trovato successivo riscontro presso il laboratorio NIRS dell Università di Padova che disponeva di una curva di calibrazione per la sansa di oliva in grado tuttavia di poter determinare solo i parametri relativi al contenuto di umidità e lipidi grezzi. 55

57 Il rapporto di collaborazione con l Università di Padova ha previsto di effettuare, in strumenti di lettura identici, analisi che, con procedure similari, ma in condizioni differenti imputabili all usura della lampada, alla rumorosità delle componenti, all ubicazione dello strumento in laboratorio e ad altre molteplici variabili, potessero fornire dei risultati analitici sovrapponibili; da quanto detto è scaturita l esigenza di standardizzare gli strumenti, presenti presso l Università di Messina e di Padova in modo da avere l uniformità dei risultati e creare un unico strumento standard. L attività di ricerca ha messo in evidenza la problematica legata alla standardizzazione degli strumenti NIR, con riscontri che interessano la stessa calibrazione, che può generare analisi non accurate se eseguita su strumenti non standardizzati. Un peso maggiore assume la standardizzazione se si considera che preparare una calibrazione ex-novo per uno strumento è dal punto di vista economico dispendioso e richiede lunghi periodi di lavoro, inoltre una calibrazione realizzata con uno strumento non può essere trasferita tal quale su un altro. Esistono altre differenze, oltre a quelle già menzionate che possono generare dei risultati non accurati, attribuibili alla geometria interna dello strumento (posizionamento degli specchi, reticolo olografico, vibrazioni, voltaggio, cella di contenimento del campione, ecc.) e alle condizioni di laboratorio in cui è posto lo strumento (temperatura, preparazione del campione). Shenk et al. (1985) dimostrarono che le equazioni per predire la proteina, l NDF, L ADF, la lignina e IVDMD (In Vivo Dry Matter Digestibility) di leguminose ed erbe potevano essere usate su strumenti dello stesso modello con un grado di accuratezza accettabile. 56

58 In generale, il trasferimento di calibrazioni tra strumenti senza standardizzazione produce risultati inaccettabili; ciò mette in evidenza che tutte le tecniche di calibrazione devono beneficiare di questa pratica (Dardenne et al., 2002). Durante l attività di ricerca è stato riscontrato che le variazioni che possono avvenire tra due strumenti sono principalmente di due ordini: 1. lo spostamento dei picchi (peaks shift); 2. il differente assorbimento nello spettro. Alcuni approcci metodologici correggono solo il primo problema, altri entrambi separatamente o all unisono. Faern (2001) distingue tre approcci fondamentali: costruire una calibrazione robusta che possa esser trasferita senza standardizzazione; aggiustare gli spettri provenienti da uno strumento affinché siano comparabili efficacemente con quelli di un altro strumento; aggiustare una calibrazione esistente affinché sia funzionale su un nuovo strumento. Questi approcci possono essere utilizzati singolarmente o in combinazione. La calibrazione con i parametri di umidità e lipidi grezzi, sviluppata dall Università di Padova, trova ampia applicazione presso gli oleifici, poiché in base al contenuto in acqua, ma soprattutto di olio presente nelle sanse, si può 57

59 controllare e monitorare costantemente il corretto funzionamento dell impianto di estrazione, ed apportare i dovuti accorgimenti nel caso si riscontrassero dei valori anomali nelle sanse. L interesse a determinare ulteriori parametri da introdurre nella calibrazione già esistente, nasce dal voler caratterizzare la sansa di olive tramite questa metodica innovativa, nell ottica di un utilizzo sempre maggiore di questo sottoprodotto nel settore della mangimistica. Infatti, come è noto, in un qualsiasi alimento utilizzato nella dieta di un animale, è necessario conoscere il valore chimico nutrizionale principalmente, in termini di energia, proteina e fibra, in modo da poter formulare delle razioni in grado di soddisfare i fabbisogni nutrizionali per ciascuna categoria di animale. A tal fine il volere determinare con il NIRS i più importanti parametri composizionali della sansa risulta di grande interesse. La programmazione ha previsto che tutti i campioni di sansa prelevati venissero letti al NIRS utilizzando la calibrazione messa a punto dal laboratorio NIRS di Padova, conservando gli spettri a cui quindi sono stati associati le analisi fatte con le metodiche convenzionali nel laboratorio dell Università di Messina. L utilizzo di questa calibrazione ha permesso di conoscere la quantità di umidità e lipidi grezzi nei campioni, e soprattutto ha permesso di fare una prima considerazione sul funzionamento della calibrazione, relativa ai sudetti parametri. È stato possibile osservare infatti, che sui campioni di sansa aventi un elevata umidità (superiore al 60%), i valori ottenuti di umidità e lipidi apparivano molto soddisfacenti, in quanto i risultati erano perfettamente sovrapponibili alle analisi eseguite con le metodiche convenzionali. 58

60 Inoltre, ancora prima di eseguire le analisi in laboratorio, due indici: GH (Global H number) ed NH (Neighborhood H number), sono stati particolarmente attenzionati; questi indici forniscono alcune indicazioni orientative sul campione. Il GH indica la distanza dalla media (centro) della popolazione rispetto al campione sottoposto a lettura, il valore da non superare è 3; nel caso in cui invece tale valore venisse superato significa che il campione letto non rientra tra la popolazione dei campioni iniziali; più semplicemente vuol dire che tra i campioni che formano il dataset di partenza non ce n è nessuno che presenta le caratteristiche rilevate. L NH invece, indica la distanza tra il campione letto ed il campione della popolazione più vicino, tale valore è preferibile sia inferiore ad 1, il valore consigliato è 0.6 (Fig.15). Figura 15 Rappresentazione grafica di GH ed NH. 59

61 Lo strumento è stato impostato in modo che contemporaneamente alla lettura del campione, insieme ai parametri presenti in calibrazione, espressi in percentuale, si rilevassero anche i valori di GH ed NH. Quando questi non rientravano nei limiti consigliati, lo strumento li segnalava rispettivamente con un carattere nero se la differenza era minima, con carattere rosso se la differenza era notevole; in questo caso si parla di campioni anomali, meglio definiti col termine di outliers. Riuscire ad avere questa informazione in tempo reale, rappresenta un grande vantaggio, poiché si conoscono istantaneamente tutti i parametri riguardanti la composizione chimica del campione letto e nel caso in cui gli indici si dovessero discostare dai valori consigliati, il campione deve essere analizzato in laboratorio per far si che ai risultati ottenuti dalle analisi vengano associati gli spettri; in tal modo si irrobustisce la calibrazione, ed il successivo campione con caratteristiche chimiche simili, non sarà considerato più un outlier. 4.6 Organizzazione delle analisi in laboratorio L attività svolta ha previsto che per ogni aliquota di sansa in arrivo nel settore accettazione del laboratorio del Consorzio di Ricerca Filiera Carni (CoRFilCarni) dell università di Messina, venisse fatta una scheda di campionamento sulla quale inserire tutti i dati relativi al campione (Fig. 16): 60

62 Figura 16 - Scheda di campionamento generica A ciascun campione è stato assegnato un codice interno di laboratorio in modo da poterne facilitare l identificazione e la rintracciabilità durante le fasi analitiche e l elaborazione dei dati. Considerato l elevato numero di determinazioni da eseguire su ciascun campione, si è resa indispensabile una precisa organizzazione dell attività analitica che è stata pianificata, attraverso la stesura di un cronogramma, insieme agli operatori del laboratorio di analisi CoRFilCarni. L attività analitica è stata gestita, tenendo conto delle esigenze del laboratorio e soprattutto della natura del campione, suscettibile a repentini ed immediati cambiamenti. La gestione dei campioni è stata laboriosa; infatti, tutti i campioni con umidità superiore al 15% prima di poter essere analizzati seguendo le metodiche ufficiali, sono stati sottoposti a trattamento in stufa per una notte a 65 C, in modo da essere idonei ai successivi trattamenti analitici (Fig. 17 e 18). 61

63 A tal proposito, il punto 4.3 del Regolamento (CE) N.152/2009 della commissione del 27 gennaio 2009, fissa i metodi di campionamento e di analisi per i controlli ufficiali degli alimenti per animali, e riporta che: gli alimenti solidi, il cui contenuto di umidità è elevato e rende difficile la macinazione, devono essere preessicati in un recipiente appropriato (ad esempio una piastra di alluminio di 20x12 cm, con bordo di 0.5 cm); il tutto deve essere lasciato in stufa e fatto essiccare ad una temperatura compresa tra i C sino a che il contenuto di umidità non sia portato ad un valore tra l 8 ed il 12%. Togliere il prodotto dalla stufa e lasciarlo raffreddare non coperto in laboratorio per un ora. Figura 17 - Sansa fresca prima del passaggio in stufa 62

64 Figura 18 - Sansa dopo trattamento in stufa a 65 C Nella fase di lavorazione dei campioni, è stato riscontrato che la condizione migliore per l essiccazione si è ottenuta stratificando il campione fresco con uno spessore inferiore ad 1 cm, in quanto si è osservato che, per spessori superiori, l essiccazione avveniva solo in maniera parziale. Per rendere ancor più omogeneo il prodotto, è stato utilizzato il molino Foss Tecator AB Cyclotec 1093, (Fig. 19) studiato per la macinazione rapida ed uniforme di una grande varietà di mangimi, cereali, semi, foglie, fieno, sottoprodotti agroindustriali ed altri prodotti. Tale apparecchiatura è stata progettata per un impiego esclusivo in laboratorio. 63

65 Figura 19 - Molino Foss Nell operazione di macinazione il campione è stato fatto rotolare contro un anello di macinazione abrasivo da una girante che ruota alla velocità di circa giri/ min. Il prodotto macinato, passa attraverso una piccola griglia dalle dimensioni dei fori di 1mm che ne controlla le dimensioni, e viene inviato in un flacone mediante separatore a ciclone. Figura 20 - Sansa macinata e trasferimento nel barattolino 64

66 La rotazione della girante genera un flusso di aria che serve sia come mezzo di trasporto ma soprattutto come refrigerante al fine di mantenere inalterate le caratteristiche del prodotto. La corrente d aria esce dal ciclone attraverso un diffusore, e le rimanenti particelle di polvere vengono raccolte da un filtro. Sul campione, raccolto all interno di un contenitore sterile (Figg. 20 e 21) identificato dal codice assegnato subito dopo aver completato la fase di campionamento, sono state effettuate le analisi definite all inizio dell attività di ricerca e nello specifico: Umidità, Proteine grezze, Lipidi grezzi, Fibra grezza, Ceneri grezze, NDF, ADL, ADF, ph ed Acidità, utilizzando la metodiche analitiche ufficiali. Figura 21 - Campioni con i rispettivi codici, pronti per le analisi 65

67 Il ph, è stato determinato su 29 campioni che presentavano un contenuto di umidità >50%; non è stato possibile eseguire tale analisi su campioni con umidità < 50%. La misurazione del ph della sansa su campioni con umidità > 50%, ha permesso di fare delle interessanti considerazioni legate al metodo e all epoca di raccolta e alla conservazione delle olive. Tutti i processi analitici sono stati definiti in collaborazione con gli operatori del laboratorio CoRFilCarni, che in quanto accreditato SINAL (oggi ACCREDIA), segue delle procedure specifiche per la gestione dei campioni. Riguardo la determinazione dell acidità, poiché è stato utilizzato il metodo che prevede la determinazione dell acidità sull olio, Regolamento (CEE) n. 2568/91, Allegato II, si è reso necessario effettuare l estrazione dei lipidi dal campione di sansa. La determinazione quantitativa del contenuto in umidità è stata effettuata misurando la differenza di peso del campione prima e dopo l essiccamento in stufa a 103 C per 4 ore, secondo la metodica approvata dal Reg CE 152/2009 del 27/01/20090GU CE L 54 26/02/2009 All III Met A. La determinazione quantitativa delle proteine grezze è stata effettuata determinando il contenuto di azoto totale dell alimento con procedimento Kjeldahl, e cioè titolando l azoto presente nel campione in seguito alla sua mineralizzazione e moltiplicando per un fattore di correzione pari a 6.25, secondo quanto riportato nella metodica AOAC ed 18th-rev.0, La determinazione quantitativa dei lipidi grezzi è stata effettuata mediante estrazione degli oli stessi con solvente organico (etere di petrolio) secondo la metodica approvata dal DM 21/12/1998 GU n /02/1999 suppl

68 La determinazione della fibra grezza è stata effettuata mediante un trattamento idrolitico acido (utilizzando acido solforico 1.25 %) a cui segue un trattamento idrolitico alcalino ( utilizzando idrossido di sodio 1.25%), secondo quanto riportato nella metodica AOAC ed 18th-rev.0, La determinazione del tenore di ceneri grezze, è stata effettuata mediante incenerimento di una quantità nota di campione in muffola a 600 C per 2 ore e successiva pesata della quantità di ceneri rimaste, secondo quanto riportato nella metodica AOAC ed 18th-rev.0, Il contenuto di fibra neutro detersa (NDF) è stato determinato mediante un trattamento con detergente neutro ed -amilasi, enzima che provoca la rimozione di tutti gli elementi, tranne i carboidrati strutturali vegetali (emicellulosa, cellulosa e lignina) che vanno a costituire l NDF così come riportato nella metodica AOAC ed 18th-rev.0, La determinazione quantitativa del contenuto di fibra acido detersa (ADF) è stata effettuata mediante un trattamento con acido solforico 0.5M che lascia un residuo formato principalmente da cellulosa e lignina (ADF). In seguito all estrazione con acido solforico al 72% si ottiene un residuo di lignina che rappresenta l ADL. La metodica eseguita è riportata da AOAC ed 18th-rev.0, Per tutte le analisi eseguite, accanto ai campioni di sansa, negli strumenti specifici per ogni analisi è stato analizzato un campione dalle caratteristiche note, posto in una posizione, riservata al materiale di riferimento. Questa pratica viene applicata in modo da avere una garanzia del risultato analitico ottenuto. 67

69 Considerando i tempi e la disponibilità del laboratorio è stato possibile avere un quadro completo di tutte le analisi in circa 120 giorni. 4.7 Sviluppo della calibrazione Disponendo sia degli spettri che dei risultati analitici, si sono impostati e sviluppati i passaggi successivi per la costruzione della calibrazione e dell equazione finale. Prima di elencare dettagliatamente quanto svolto, è necessario fare una breve descrizione delle diverse tipologie di file e del loro contenuto, in modo da semplificarne la comprensione. Per ciascuna tipologia di campione è stato necessario creare un file, che contiene tutti gli spettri dei campioni, tale file, per comodità, solitamente viene chiamato facendo seguire.nir al nome della matrice, da qui il nome sansa.nir. Tutti i file.nir contenevano solo ed esclusivamente le informazioni relative agli spettri dei campioni (Figg 22 e 23). 68

70 Figura 22 - Spettri di sansa umida (in alto) e di sansa asciutta (in basso) Figura 23 - Insieme di tutti gli spettri dei campioni analizzati 69

71 Un altra tipologia di file è rappresentato dal file.cal. Questi file contengono i dati spettrali abbinati ai relativi valori delle analisi di laboratorio, per cui nel file sansa.cal, erano contenuti tutti i campioni di sansa letti con l associazione dei dati analitici agli spettri precedentemente acquisiti. Per trasformare un file, da.nir a.cal, è stata effettuata una importazione dei dati. Tale operazione ha richiesto estrema precisione, infatti un errore in questa fase avrebbe comportato grosse difficoltà nel proseguo del lavoro. È stato creato quindi un file excel, riportando nelle colonne i codici dei campioni, le sigle dei parametri determinati e la misura in cui sono stati espressi, ad esempio il parametro proteina grezza sul tal quale è stato riportato con PGtq, e così anche per tutti gli altri parametri (Tabella 8). 70

72 Tabella 8 Analisi chimiche sui campioni di sansa 71

73 sample ph UMIDITA SS PGTQ EETQ FGTQ CENTQ NDFTQ ADFTQ ADLTQ ACIDITA ,69 94,31 9,64 12,56 27,95 4,47 48,02 40,61 27, ,40 93,60 5,57 1,88 49,00 2,64 72,51 53,31 20, ,54 50,28 49,72 2,60 2,11 24,18 1,79 37,22 31,28 12,62 0, ,75 58,25 3,05 2,48 28,32 2,10 43,61 36,64 14, ,44 97,56 5,11 4,15 47,44 3,52 73,04 61,37 24, ,87 67,61 32,39 1,50 12,34 5,28 2,06 7,74 6,21 3,31 1, ,56 35,44 1,65 13,50 5,78 2,25 8,47 6,80 3, ,54 93,46 4,34 35,61 15,23 5,93 22,34 17,93 9, ,80 75,81 24,19 1,76 3,95 5,54 2,01 8,35 6,16 3,28 5, ,75 26,25 1,91 4,28 6,02 2,18 9,06 6,69 3, ,02 92,98 6,78 15,17 21,31 7,71 32,09 23,68 12, ,13 68,42 31,58 1,40 11,16 4,79 3,01 7,21 6,00 3,57 1, ,81 46,19 2,05 16,32 7,01 4,40 10,54 8,77 5, ,94 95,06 4,21 33,59 14,42 9,06 21,69 18,05 10, ,87 74,89 25,11 1,70 4,65 5,62 1,78 9,14 6,87 4,79 4, ,00 34,00 2,31 6,29 7,61 2,41 12,38 9,30 6, ,15 93,85 6,37 17,37 21,00 6,65 34,17 25,68 17, ,36 63,52 36,48 3,51 8,54 7,50 3,78 11,92 9,72 6,33 27, ,15 54,85 5,27 12,84 11,27 5,69 17,92 14,61 9, ,72 94,28 9,06 22,07 19,38 9,78 30,81 25,11 16, ,82 58,46 41,54 2,44 2,63 22,71 1,26 34,40 26,85 13,47 87, ,67 54,33 3,18 3,44 29,70 1,65 44,99 35,12 17, ,85 86,15 5,05 5,46 47,10 2,61 71,34 55,69 27, ,07 50,64 49,36 2,42 5,18 28,76 1,37 35,13 31,02 17,69 10, ,69 60,31 2,95 6,33 35,14 1,67 42,92 37,91 21, ,95 97,05 4,75 10,19 56,55 2,69 69,07 61,00 34, ,06 52,85 47,15 2,43 4,45 24,15 2,73 33,67 28,20 14, ,07 62,93 3,24 5,95 32,23 3,65 44,94 37,64 19, ,78 96,22 4,96 9,09 49,28 5,58 68,72 57,55 30, ,26 76,83 23,17 1,88 6,67 4,60 1,52 8,04 6,22 4,51 3, ,58 46,42 3,76 13,37 9,22 3,05 16,10 12,46 9, ,46 96,54 7,83 27,80 19,18 6,34 33,48 25,92 18, ,34 73,36 26,64 1,89 7,59 4,77 1,93 8,20 6,18 4,61 2, ,47 32,53 2,31 9,26 5,83 2,35 10,01 7,55 5, ,49 96,51 6,84 27,48 17,29 6,98 29,70 22,40 16, ,38 58,40 41,6 2,22 4,56 20,80 1,04 32,21 25,10 12, ,83 80,17 4,28 8,79 40,09 2,01 62,08 48,37 24, ,84 98,16 5,24 10,76 49,09 2,46 76,01 59,23 29, ,12 40,58 59,42 3,79 4,65 29,36 3,98 44,02 34,14 15,58 73, ,89 84,11 5,37 6,58 41,56 5,64 62,31 48,33 22, ,28 97,72 6,24 7,64 48,28 6,55 72,39 56,15 25, ,90 40,82 59,18 3,49 6,12 28,45 2,65 43,60 34,99 16,54 68, ,64 74,36 4,39 7,70 35,75 3,33 54,78 43,96 20, ,51 97,49 5,75 10,09 46,87 4,36 71,82 57,64 27, ,67 42,76 57,24 2,63 5,63 26,54 3,01 40,57 31,92 15,20 62, ,80 80,20 3,68 7,89 37,18 4,22 56,84 44,73 21, ,21 97,79 4,49 9,62 45,34 5,14 69,31 54,54 25, ,74 71,26 28,74 2,05 6,05 8,61 1,39 14,09 11,03 5,43 5, ,91 40,09 2,86 8,44 12,01 1,94 19,65 15,38 7, ,97 98,03 7,00 20,65 29,36 4,75 48,06 37,62 18, ,80 75, ,74 7,53 5,40 1,08 8,38 6,46 3,27 2, ,20 35,80 2,50 10,78 7,73 1,54 12,00 9,26 4, ,65 97,35 6,79 29,32 21,02 4,19 32,62 25,17 12, ,93 71,03 28,97 1,59 6,94 5,92 1,92 9,10 7,05 4,32 2, ,87 39,13 2,14 9,38 8,00 2,59 12,29 9,52 5, ,36 93,64 5,13 22,44 19,14 6,19 29,42 22,79 13, ,60 73,33 26,67 1,55 6,40 5,21 2,27 8,09 6,17 3,66 6, ,72 35,28 2,04 8,47 6,89 3,01 10,70 8,16 4, ,61 94,39 5,47 22,65 18,44 8,04 28,62 21,84 12, ,90 74,82 25,18 1,37 5,68 5,16 1,93 8,45 6,46 3,32 4, ,87 28,13 1,53 6,35 5,77 2,16 9,44 7,22 3, ,78 91,22 4,96 20,58 18,7 7,00 30,61 23,40 12, ,50 73,13 26,87 1,71 5,33 8,16 1,92 8,94 7,20 4,10 3, ,40 30,60 1,95 6,07 9,29 2,18 10,18 8,20 4, ,85 95,15 6,07 18,86 28,89 6,79 31,67 25,51 14, ,80 75,71 24,29 1,62 5,15 4,58 1,83 7,45 6,22 3,83 3, ,57 35,43 2,36 7,51 6,69 2,67 10,87 9,07 5, ,50 95,5 6,35 20,24 18,02 7,20 29,30 24,44 15, ,43 74,70 25,3 1,51 4,93 5,76 1,59 8,81 7,45 4,71 2, ,01 40,99 2,44 7,99 9,34 2,58 14,28 12,07 7, ,05 95,95 5,71 18,71 21,86 6,04 33,42 28,26 17, ,50 70,99 29,01 2,07 7,00 5,74 1,70 10,39 8,32 4,78 2, ,12 37,88 2,71 9,14 7,50 2,21 13,56 10,86 6, ,96 97,04 6,94 23,42 19,21 5,67 34,75 27,83 15, ,90 69,99 30,01 2,03 7,85 5,91 1,65 10,99 8,19 4,56 2, ,75 40,25 2,72 10,53 7,93 2,21 14,74 10,99 6, ,98 97,02 6,56 25,38 19,11 5,33 35,53 26,48 14, ,76 73,56 26,44 1,60 4,39 5,52 1,87 10,21 8,09 4,72 3, ,40 45,60 2,75 7,57 9,51 3,23 17,60 13,95 8, ,11 96,89 5,85 16,09 20,21 6,87 37,40 29,65 17, ,16 72,51 27,49 1,87 5,56 6,03 1,83 10,49 8,21 4,94 3, ,08 41,92 2,86 8,48 9,19 2,79 15,99 12,52 7, ,41 97,59 6,65 19,73 21,39 6,50 37,23 29,14 17, ,82 72,53 27,47 2,04 6,01 6,02 2,20 9,68 8,09 5,17 2, ,76 51,24 3,81 11,21 11,23 4,10 18,05 15,08 9, ,00 97,00 7,22 21,22 21,26 7,77 34,17 28,55 18, ,55 73,68 26,32 1,84 5,56 5,94 1,90 9,87 8,31 4,66 2, ,60 40,40 2,82 8,54 9,12 2,91 15,14 12,76 7, ,40 94,60 6,60 19,99 21,36 6,82 35,46 29,88 16,

74 Nel preparare questo file, è risultato importante eliminare nella descrizione dei campioni e dei rispettivi parametri gli spazi, gli accento e gli apostrofi, per evitare che i simboli potessero causare qualsiasi tipo di errore nella importazione dei dati (ad esempio il parametro umidità è diventato umidita). Completato questo file si è proceduto all importazione dei dati tramite una funzione presente nel programma di gestione apparecchiatura NIR, che ha permesso di associare i valori analitici dei campioni ai rispettivi spettri. Eseguita correttamente questa operazione si è passati alla realizzazione dell equazione per la sansa e quindi al file sansa.eqa. In questo file erano presenti tutti i parametri determinati sulla matrice e alcuni indici che indicavano la correttezza della calibrazione. Nel file sansa.anl, sono stati inseriti invece, tutti i risultati analitici delle letture NIR. 4.8 Analisi statistica Le diverse prove di sviluppo delle curve sono state fatte utilizzando una regressione Partial Least Squares (PLS) lavorando su tutto l intervallo spettrale a disposizione. In alcuni casi è stato possibile escludere la parte del visibile fino a 700 nm. Questa seconda scelta è stata dettata dal fatto che la parte visibile contiene una scarsa quantità di informazioni e quindi la possibilità di utilizzare un sensore che comprenda solo l intervallo nm è risultata la scelta più economica in accordo con quanto riportato da Taylor et al., (2005). In effetti, la PLS si avvantaggia della correlazione esistente tra i dati spettrali e la concentrazione dei costituenti. Così come i dati spettrali possono essere scomposti in componenti, anche le concentrazioni possono essere trattate allo stesso 73

75 modo. In questo modo si generano due set di vettori corrispondenti agli scores, un set dai dati spettrali, l altro dai dati di concentrazione chimica dei costituenti. (AA.VV., 1991). Inoltre è stata utilizzata l analisi della varianza (ANOVA, proc. GLM SAS, 2001), prendendo in considerazione, per ogni parametro analitico sia la variabile tipologia di analisi (NIRS vs AOAC), sia il metodo di estrazione utilizzato per la sansa (Sistema due fasi vs Sistema per pressione). 74

76 5. RISULTATI E DISCUSSIONE 5.1 La curva di calibrazione La popolazione dei campioni di sansa, oggetto della calibrazione, ha mostrato un ampia variabilità; si è riscontrata, infatti, una notevole differenza tra i campioni suddivisi secondo il metodo di lavorazione utilizzato per l estrazione dell olio. La calibrazione ottenuta in questo lavoro (Fig.24), ha mostrato, in relazione ai parametri in oggetto (Umidità, Lipidi grezzi, Proteina grezza, Fibra grezza, Ceneri, NDF, ADF, ADL), ottimi coefficienti di determinazione. Riguardo ai parametri di ph ed acidità, invece, è necessario fare qualche considerazione più precisa. Per il ph, il SEC, errore standard di calibrazione, è risultato pari a 0,23, valore ottimo se si considera che deve essere quanto più vicino allo zero, il parametro 1- VR pari a 0,58 invece, è basso poiché il valore migliore è 1. Questo è imputabile ai pochi campioni letti; il ph, infatti, è stato determinato su 29 campioni, cioè su quei campioni aventi umidità superiore al 50%. Lo strumento ha risposto bene quando sono stati sottoposti alla lettura campioni umidi, mentre per campioni di sansa con umidità inferiore al 50%, i risultati non sono apparsi attendibili, poichè gli indici di GH ed NH superano notevolmente la soglia limite prevista. Da qui la necessità di analizzare altri campioni di sansa freschi e determinarne il ph in modo da introdurre nuovi dati in calibrazione e poter fare delle considerazioni più approfondite e più precise su questa analisi. Dalle analisi eseguite, è emerso che le sanse provenienti dal processo di 75

77 estrazione continuo a due fasi hanno mostrato un ph leggermente più basso, con un valore medio registrato pari a 4,52 vs un valore medio di ph pari 5,57 ottenuto nelle sanse prodotte dal sistema di estrazione per pressione. L analisi dell acidità è stata fatta seguendo il metodo ufficiale già citato in materiali e metodi. In fase di calibrazione e nell equazione finale (equation file) il SEC dell acidità è stato di 4,55, valore decisamente troppo alto se si considera che è consigliabile sia pari a zero, la stessa osservazione può essere trasferita al SECV.; da quanto detto scaturisce la poca attendibilità di tutti i parametri statistici e di conseguenza l attendibilità del dato finale riguardante questo paramentro. La spiegazione potrebbe essere attribuibile al fatto che la matrice letta con il NIRS, la sansa, è diversa dalla matrice su cui è stata determinata l acidità, l olio, per cui non si è riusciti ad avere una corrispondenza tra l analisi eseguita in laboratorio e la lettura effettuata al NIRS. Per tutti gli altri parametri presenti in calibrazione, Umidità, Proteine grezze, Lipidi grezzi, Fibra grezza, Ceneri, NDF, ADF, ADL, si sono registrati dei valori eccellenti. Alcuni valori di SEC e SECV leggermente più alti rispetto al previsto (Fig.24), sono stati attribuiti alla maggiore deviazione standard registrata e conseguente all avere analizzato campioni provenienti da diversi metodi i estrazione della sansa. Tale scelta è stata fatta nell ottica di poter disporre di un data-set di campioni quanto più diversificato possibile. 76

78 5.2 Confronto tra la metodica convenzionale AOAC e la metodica NIRS Si è avuto modo di testare la precisione e l accuratezza della calibrazione, effettuata analizzando con le metodiche convenzionali (AOAC), 5 campioni, scelti in maniera random, dei 100 prelevati nella campagna olearia 2010 /11 che contestualmente sono stati sottoposti ad analisi NIRS. Dal confronto (Tab.9) tra i valori ottenuti con le due metodiche (NIRS vs AOAC) è emerso che i risultati, relativi a tutti i parametri composizionali, sono stati sovrapponibili tra di loro, come è possibile osservare dal valore della significatività statistica P > 0,05. Alla luce di quanto detto si è proceduto alla caratterizzazione dei campioni prelevati, utilizzando esclusivamente il NIRS. 5.3 Caratterizzazione nutrizionale La tabella 10 riporta i valori medi della composizione chimica delle sanse provenienti dai due tipi di impianto. Si sono osservate differenze significative per tutti i parametri chimici determinati sui campioni di sanse in relazione al metodo di estrazione. La sansa proveniente dagli impianti di estrazione a due fasi ha presentato un valore di umidità (Tab.10, Grafico 1) significativamente più elevato (72,51%) rispetto a quello misurato nella sansa proveniente dall impianto a pressione (49,35%), con un conseguente valore in sostanza secca pari, rispettivamente, a 27,49% e 50,65% (Tab.10, Grafico 2). Questa differenza potrebbe essere attribuita all addizione di acqua alla pasta di olio nella fase di centrifugazione che separa le sanse e l'acqua di vegetazione dal mosto d'olio. 77

79 L elevato contenuto in acqua, presente nella sansa proveniente dall impianto a due fasi ha determinato, a causa della diluizione e dispersione, contenuti proteici, (Tab.10, Grafici 3 e 4) fibrosi (Tab.10, Grafici 5 e 6) e minerali, (Tab.10, Grafici 7 e 8) più bassi. Per quanto riguarda il contenuto lipidico (Tab.10, Grafici 9 e 10) questo è risultato invece significativamente più elevato a causa della minore resa quantitativa degli impianti a due fasi a freddo, rispetto agli impianti per pressione. Osservando le misurazioni di ph (Tab.10, Grafico 11) delle due serie di campioni si osservano differenze significative. Il ph dei campioni provenienti dal sistema a pressione risulta più elevato, probabilmente a causa dell addizione di acido citrico alla sansa per la sua stabilizzazione. I risultati hanno messo in evidenza che, i sistemi continui a due fasi producono sanse eccessivamente umide con uno scarso valore merceologico (72,51% vs 49,35%). Le sanse diventano pertanto un prodotto di scarto da smaltire senza alcuna possibilità di recupero economico. Tuttavia alla luce dei valori dei parametri composizionali (PG, LG, frazioni fibrose) delle sanse ottenute con metodo a due fasi e alla luce del fatto che molti produttori usano essiccare parzialmente le sanse, i risultati ottenuti sembrano evidenziare un utilizzo della sansa in zootecnia. La sansa di olive infatti, adeguatamente stabilizzata ed essiccata, può costituire un ottima integrazione nei piani di razionamento per tutti gli animali da reddito. I parametri più interessanti dal punto di vista dell apporto nutrizionale sono apparsi quelli relativi al contenuto in lipidi grezzi, che svolgono principalmente funzione energetica, e quelli relativi alle diverse frazioni fibrose (NDF, ADF, ADL), importanti per l ottimizzazione dei processi digestivi, specie nei ruminanti. 78

80 Inoltre considerata la qualità degli acidi grassi presenti, nella frazione lipidica, in particolare l acido oleico, diventa interessante utilizzare la sansa in zootecnia, in parziale o totale sostituzione di altre fonti specie se di importazione (semi di lino, di cotone, ecc.). Nell impianto di estrazione a due fasi, anche i dati relativi alla componente fibrosa sono risultati qualitativamente migliori rispetto all altra tipologia di impianto; infatti, dallo studio effettuato, si è riscontrato che la fibra neutro detersa (NDF), parametro correlato negativamente all assunzione di sostanza secca da parte dell animale, è risultato di molto inferiore rispetto a quello determinato su sanse provenienti dall impianto per pressione (Grafici 12 e 13). Lo stesso risultato è stato osservato anche per l ADF (Grafici 14 e 15) e ADL (Grafici 16 e17); quanto detto è di particolare interesse considerato che la fibra acido detersa, (ADF) e la lignina acido detersa (ADL) sono dei parametri correlati negativamente alla digeribilità dell alimento (Dell Orto et al, 2005). 79

81 6. CONCLUSIONI Il presente studio evidenzia che l applicazione della curva di calibrazione NIRS costruita per la sansa di olive, ha mostrato una buona efficienza in termini di risposte analitiche per i parametri: Umidità, Proteine grezze, Lipidi grezzi, Fibra grezza, Ceneri, NDF, ADF, ADL. Per quanto riguarda l analisi del ph, essendo tale parametro strettamente correlato alla presenza di acqua contenuta nel campione, si può supporre che introducendo nella calibrazione altri valori relativi a questa determinazione anche il ph potrebbe essere determinato senza alcun tipo di problema. La stessa considerazione non può essere fatta per l acidità i cui risultati non sono stati soddisfacenti per motivi correlati al principio della determinazione analitica più che alla metodica NIRS. La tecnica NIRS, pertanto può essere una valida, economica e veloce alternativa nella caratterizzazione chimica dei principali costituenti di questa particolare tipologia di sottoprodotto. È stato possibile inoltre, caratterizzare le sanse provenienti da due diversi impianti di estrazione dell olio, rispettivamente di quello a due fasi, e di quello a pressione, mettendo in evidenza i vantaggi e gli svantaggi dell uno e dell altro in termini di qualità, del sottoprodotto sansa. È stato riscontrato infatti, che le sanse provenienti dal sistema di estrazione in continuo a due fasi, risultano essere, dopo adeguata stabilizzazione ed essiccazione, qualitativamente migliori rispetto a quelle ottenute attraverso il metodo per pressione. In conclusione si ritiene che una particolare attenzione vada rivolta alla valorizzazione di questo sottoprodotto agroindustriale nel settore della mangimistica, quale integratore, nelle razioni per animali da reddito, per la presenza 80

82 di importanti principi nutritivi, in modo particolare di lipidi e fibra grezza, soprattutto alla luce del continuo rincaro delle materie prime e dei sottoprodotti di origine vegetale. In tale direzione la sansa essiccata, se adeguatamente gestita, può essere considerata una potenziale risorsa per il comparto zootecnico e non essere catalogata solo ed unicamente quale prodotto di scarto dell industria olearia. 81

83 7. BIBLIOGRAFIA AA.VV. (1991). PLSplusIQ Users Guide, Thermo Galactic. AA.VV. (1989). Near Infrared Reflectance Spectroscopy (NIRS): Analysis of Forage Quality, Agriculture Handbook, Number. 643, Salem NH (U.S.A). ACCARDI F., LETO G., GIACCONE P., ALICATA M.L. (1979). Sansa vergine di oliva. Indagini sulla composizione chimica, digeribilità ed effetto nutritivo su agnelloni. Zoot. Nutriz. Anim n 5 pp AMIRANTE P. et al. (1993) Evoluzione tecnologica degli impianti di estrazione dell olio di oliva. Olivae n 48, C.O.I. Madrid. AMIRANTE P. (1998). Innovazione tecnologica dei sistemi estrattivi per l olio di oliva. Atti Tornata dell Accademia Nazionale dell olivo, maggio, Pescara. AMIRANTE, P., MONTEL, G.L. (1999). Tecnologie ed impianti per il compostaggio intra ed interaziendali, Il compostaggio in ambito agricolo. Promozione ed impiego del compost in agricoltura biologica, I Quaderni di Biopuglia n.5, Istituto Agronomico Mediterraneo Bari, pp A.O.A.C. (2005). Official Methods of Analysis, 18 th Edition Association of Official Analytical Chemists, Washington, DC, USA. APROL (2002). Relazione del Presidente alla XX Assemblea ordinaria, Lecce, 10/05/

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91 SITI INTERNET CONSULTATI: =311&id=15A 21A

92 Figura 1- Ripartizione della produzione per Paese RIPARTIZIONE DELLA PRODUZIONE PER PAESE (ultime quattro campagne) 100% 80% 60% 40% 20% Il ruolo degli altri Paesi 0% * Spagna Italia Grecia Altri Fonte: ISMEA su dati COI 91 Infrared Reflectance Spectroscopy) nell ottica del suo utilizzo in alimentazione animale Dottorato di Ricerca in:

93 Figura 2 Trend della produzione di olio di oliva in Italia (000 tonnellate) FONTE: ISTAT; * ISMEA / UNIONE DEI PRODUTTORI 92 Infrared Reflectance Spectroscopy) nell ottica del suo utilizzo in alimentazione animale Dottorato di Ricerca in:

94 Figura 3- Ripartizione della Produzione italiana per regione (dati relativi al 2008) FONTE : ISMEA SU DATI ISTAT 93 Infrared Reflectance Spectroscopy) nell ottica del suo utilizzo in alimentazione animale Dottorato di Ricerca in:

95 Fig.4 - Superficie olivetata (ha) nelle province siciliane (dati ISTAT 2007) 94 Infrared Reflectance Spectroscopy) nell ottica del suo utilizzo in alimentazione animale Dottorato di Ricerca in:

96 Figura 5 - Produzione olivicola (ton) nelle province siciliane (dati ISTAT 2007) 95 Infrared Reflectance Spectroscopy) nell ottica del suo utilizzo in alimentazione animale Dottorato di Ricerca in:

97 Figura 6: Schema del processo di estrazione dell olio di oliva in modalità discontinua (A) e continua (B) 96

98 Figura 21 - Parametri statistici della calibrazione N (Numerosità del dataset), SEC (Errore standard di calibrazione) = differenze tra i valori di laboratorio e i valori NIRS di calibrazione. (Valore preferibile quanto più vicino allo 0). SECV (Errore standard di cross-validatione) = differenze tra i valori di laboratorio e i valori NIRS di cross-validazione (Valore preferibile quanto più vicino allo 0). 1-VR (1 minus variance ratio) = rappresenta quella porzione della varianza totale, spiegata in fase di cross-validazione, è comparabile con il coefficiente di determinazione R². (Valore preferibile quanto più vicino ad 1). R² o RSQ (Coefficiente di correlazione) = rapporto tra i valori di laboratorio e valori NIRS. (Valore preferibile quanto più vicino ad 1) (Brogna 2007). Secondo la classificazione dei modelli di calibrazione proposta da Mouazen et al.(2005) un valore di R² superiore a 0.91 indica una predizione eccellente mentre con valori compresi tra 0.82 e 0.90 si rivela buona 97 Infrared Reflectance Spectroscopy) nell ottica del suo utilizzo in alimentazione animale Dottorato di Ricerca in:

99 Tabella 1 - Oli d oliva siciliani DOP DOP TERRITORIO SUPERFICIE OLIVETATA (ha) RICONOSCIMENTO Monte Etna Ct, En, Me Settembre 2003 Monti Iblei Sr, Rg, Ct Giugno 2003 Val di Mazara Pa, Ag Marzo 2001 Valdemone Me Marzo 2005 Valle del Belice Tp Settembre 2004 Valli Trapanesi Tp Ottobre 1998 Colline Ennesi* En Maggio 2008 Colli Nisseni* Cl Gennaio 2008 * Hanno ricevuto la protezione transitoria nazionale 98 Infrared Reflectance Spectroscopy) nell ottica del suo utilizzo in alimentazione animale Dottorato di Ricerca in:

100 Tabella 2 - Superficie (ha) e produzione (quintali): olivo, olive da tavola, olive da olio, olio di pressione. Dettaglio per Provincia - Anno 2007 Province Superficie totale Superficie in produzione Fonte: Istat, stima delle superfici e produzioni delle coltivazioni agrarie Mese di rilevazione: r = valore rilevato; s = valore imputato; t = totale Olive Olive da tavola Olive da olio Olio di pressione Produzione Produzione Produzione Produzione Resa di Produzione Metodo Metodo Metodo Totale raccolta Totale Totale produzione Totale Sicilia Trapani r r r 19, r Palermo r r r 18, r Messina r r r 21, r Agrigento r r r 19, r Caltanissetta r 700 r r 13, r Enna r 7191 r r 16, r Catania r r r 17, r Ragusa r r r 15, r Siracusa r r r 16, r Totale Sicilia t t t 17, t Metodo 99 Infrared Reflectance Spectroscopy) nell ottica del suo utilizzo in alimentazione animale Dottorato di Ricerca in:

101 Tabella 3 - Superficie (ha) e produzione (quintali): olivo,olive da tavola,olive da olio, olio di pressione. Dettaglio per Provincia - Anno 2008 Province Superficie totale Superficie in produzione Fonte: Istat, stima delle superfici e produzioni delle coltivazioni agrarie Mese di rilevazione: r = valore rilevato; s = valore imputato; t = totale Olive Olive da tavola Olive da olio Olio di pressione Produzione Produzione Produzione Produzione Resa di Produzione Metodo Metodo Metodo Totale raccolta Totale Totale produzione Totale Sicilia Trapani r r r 25, r Palermo r r r 16, r Messina r 9000 r r 21, r Agrigento r r r 20, r Caltanissetta r 1326 r r 13, r Enna r r r 5, r Catania r r r 18, r Ragusa r r r 15, r Siracusa r r r 16, r Totale Sicilia t t t 17, t Metodo 100 Infrared Reflectance Spectroscopy) nell ottica del suo utilizzo in alimentazione animale Dottorato di Ricerca in:

102 Tabella 4 - Superficie (ha) e produzione (quintali):olivo,olive da tavola,olive da olio, olio di pressione. Dettaglio per Provincia - Anno 2009 Province Superficie totale Superficie in produzione Fonte: Istat, stima delle superfici e produzioni delle coltivazioni agrarie Mese di rilevazione: r = valore rilevato; s = valore imputato; t = totale Olive Olive da tavola Olive da olio Olio di pressione Produzione Totale Produzione raccolta Metodo Produzione Totale Metodo Produzione Totale Metodo Resa di produzione Produzione Totale Sicilia Trapani r r r 12, r Palermo r r r 16, r Messina r 9000 r r 21, r Agrigento r r r 18, r Caltanissetta r 700 r r 14, r Enna r r r 13, r Catania r r r 17, r Ragusa r r r 15, r Siracusa r r r 16, r Totale Sicilia t t t 16, t Metodo 101 Infrared Reflectance Spectroscopy) nell ottica del suo utilizzo in alimentazione animale Dottorato di Ricerca in:

103 Tabella 9 Confronto tra i valori ottenuti mediante analisi dei campioni di sansa secondo metodiche AOAC e letture mediante tecnica NIRS CRFC8645 CRFC8652 CRFC8547 CRFC8647 CRFC8654 AOAC NIRS AOAC NIRS AOAC NIRS AOAC NIRS AOAC NIRS P value UM 71,03 69,03 69,99 68,72 3,49 3,75 6,78 6,04 6,56 6,67 0,97 PG 1,59 1,34 2,03 1,64 6,84 6,68 4,96 5,09 6,65 6,44 0,91 LG 6,94 7,90 7,85 8,22 27,48 26,38 20,58 19,68 19,73 18,70 0,95 FG 5,92 6,95 5,91 6,11 17,29 17,96 18,7 19,07 21,39 21,08 0,93 CN 1,92 2,84 2,65 3,16 6,98 7,11 7,00 7,26 6,50 6,26 0,84 NDF 9,10 10,43 10,99 9,82 26,7 25,07 30,61 28,35 37,23 34,54 0,87 ADF 7,05 8,20 8,19 9,20 22,40 22,55 23,40 23,38 28,14 27,63 0,95 ADL 4,32 5,44 4,56 5,47 16,69 15,71 13,17 13,47 17,53 17,19 0,96 Acidità ,42 2,57 4,92 / / / / / / ph 4,93 3,98 4,90 4,18 / / / / / / 102 Infrared Reflectance Spectroscopy) nell ottica del suo utilizzo in alimentazione animale Dottorato di Ricerca in:

104 Tabella 10 :Valori medi determinati mediante metodica NIRS sulle sanse provenienti dai due differenti sistemi di estrazione. Parametro Sistema 2 Fasi DEV. ST Sistema a pressione DEV.ST P value ph 4,52 0,34 5,57 0,57 < 0,001 Umidità (%) 72,51 3,16 49,35 7,30 < 0,001 P.G. (%/ss) 6,62 1,15 5,42 0,59 < 0,001 E.E. (%/ss) 23,87 5,66 8,69 2,36 < 0,001 F.G. (%/ss) 21,23 3,59 50,83 3,88 < 0,001 Ceneri (%/ss) 7,08 1,42 4,27 1,54 < 0,001 NDF (%/ss) 34,01 5,32 74,54 4,01 < 0,001 ADF (%/ss) 26,87 4,22 60,36 2,98 < 0,001 ADL (%/ss) 15,99 2,68 29,52 3,63 < 0,001 * Espresso in percento di acido oleico, parametro determinato mediante metodica AOAC. 103 Infrared Reflectance Spectroscopy) nell ottica del suo utilizzo in alimentazione animale Dottorato di Ricerca in:

105 UMIDIT A' % 80,00 72,51 60,00 40,00 49,35 S is tema continuo a due fas i S is tema a pres s ione 20,00 0,00 Grafico 1 Andamento del tenore in umidità delle sanse ottenute con i diversi sistemi di estrazione. % S OS T. S E C C A 60,00 50,00 40,00 30,00 27,49 50,65 S is tema continuo a due fas i S is tema a pres s ione 20,00 10,00 0,00 Grafico 2 Andamento del tenore in sostanza secca delle sanse ottenute con i diversi sistemi di estrazione. 104

106 PG (tq) % 3,00 2,00 1,82 2,75 Sistema continuo a due fasi 1,00 0,00 Grafico 3 Andamento del tenore in proteine grezze (sul tal quale) delle sanse ottenute con i diversi sistemi di estrazione. P G (s s ) % 8,00 6,00 4,00 2,00 0,00 C ATANIA 6,62 5,42 S is tema continuo a due fas i S is tema a pres s ione Grafico 4 Andamento del tenore in proteine grezze (sulla sostanza secca) delle sanse ottenute con i diversi sistemi di estrazione. 105

107 F G (tq) % 30,00 25,00 20,00 15,00 10,00 5,00 5,81 25,62 S is tema continuo a due fas i S is tema a pres s ione 0,00 Grafico 5 Andamento del tenore in fibra grezza (sul tal quale) delle sanse ottenute con i diversi sistemi di estrazione. F G (s s ) % 60,00 50,83 50,00 40,00 30,00 21,23 S is tema continuo a due fas i S is tema a pres s ione 20,00 10,00 0,00 Grafico 6 Andamento del tenore in fibra grezza (sulla sostanza secca) delle sanse ottenute con i diversi sistemi di estrazione. 106

108 C E NE R I (tq) % 2,30 2,23 2,20 2,10 2,00 1,90 1,80 1,96 S is tema continuo a due fas i S is tema a pres s ione Grafico 7 Andamento del tenore in ceneri (sul tal quale) delle sanse ottenute con i diversi sistemi di estrazione. C E NE R I(s s ) % 8,00 6,00 4,00 2,00 0,00 7,08 4,27 S is tema continuo a due fas i S is tema a pres s ione Grafico 8 Andamento del tenore in ceneri (sulla sostanza secca) delle sanse ottenute con i diversi sistemi di estrazione. 107

109 L G (tq) % 8,00 6,63 6,00 4,00 2,00 0,00 4,42 S is tema continuo a due fas i S is tema a pres s ione Grafico 9 Andamento del tenore in lipidi grezzi (sul tal quale) delle sanse ottenute con i diversi sistemi di estrazione. %L G (s s ) % 25,00 20,00 15,00 10,00 5,00 0,00 23,87 8,69 S is tema continuo a due fas i S is tema a pres s ione Grafico 10 Andamento del tenore in lipidi grezzi (sulla sostanza secca) delle sanse ottenute con i diversi sistemi di estrazione. 108

110 ph 6,00 4,52 4,00 2,00 5,57 Sistema continuo a due fasi Sistema a pressione 0,00 Grafico 11 Andamento del tenore in ph delle sanse ottenute con i diversi sistemi di estrazione. 109

111 NDF (tq) % 37,60 40,00 30,00 20,00 10,00 0,00 9,31 S is tema continuo a due fas i S is tema a pres s ione Grafico 12 Andamento del tenore in NDF (sul tal quale) delle sanse ottenute con i diversi sistemi di estrazione. NDF (s s ) % 80,00 60,00 40,00 20,00 34,01 74,54 S is tema continuo a due fas i S is tema a pres s ione 0,00 Grafico 13 Andamento del tenore in NDF (sulla sostanza secca) delle sanse ottenute con i diversi sistemi di estrazione. 110

112 ADF (tq) % 40,00 30,00 20,00 10,00 0,00 7,36 30,44 S is tema continuo a due fas i S is tema a pres s ione Grafico 14 Andamento del tenore in ADF (sul tal quale) delle sanse ottenute con i diversi sistemi di estrazione. % ADF (s s ) 80,00 60,00 40,00 20,00 26,87 60,36 S is tema continuo a due fas i S is tema a pres s ione 0,00 Grafico 15 Andamento del tenore in ADF (sulla sostanza secca) delle sanse ottenute con i diversi sistemi di estrazione. 111

113 ADL(tq) % 14,82 15,00 10,00 5,00 4,37 Sistema continuo a due fasi 0,00 Grafico 16 Andamento del tenore in ADL (sul tal quale) delle sanse ottenute con i diversi sistemi di estrazione. ADL (s s ) % 30,00 25,00 20,00 15,00 10,00 5,00 0,00 15,99 29,52 S is tema continuo a due fas i S is tema a pres s ione Grafico 17 Andamento del tenore in ADL (sulla sostanza secca) delle sanse ottenute con i diversi sistemi di estrazione. 112

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