Congresso Nazionale Congiunto SIMMESN e SIMGePeD Malattie genetico-metaboliche tra tecnologia e assistenza Ottobre 2011, Bologna

Transcript

1 Congresso Nazionale Congiunto SIMMESN e SIMGePeD Malattie genetico-metaboliche tra tecnologia e assistenza Ottobre 2011, Bologna L importanza delle conoscenze tecnologiche e metodologiche Giancarlo la Marca Dip. Farmacologia, UNIFI; AOU Meyer, Firenze

2 OBIETTIVO DEL CORSO Promuovere la formazione o l aggiornamento di operatori di spettrometria di massa in ambito chimico clinico

3 Basta comprare lo strumento. Poi è tutto automatico! È FALSO!!!

4 Lo strumentino che si autogestisce NON ESISTE!!!

5 Basta il kit! È FALSO!!!

6 L era del click e lo spettro è fatto NON VERRÀ MAI!!!

7 Identificare X / Determinare la quantità di Y CAMPIONE ESTRAZIONE PURIFICAZIONE ANALISI GC-,, HPLC- MS, MS/MS Quale informazione voglio ottenere? Qual è l esperimento più appropriato (sensibilità, selettività, velocità, ecc )? scelta corretta del tipo di esperimento corretta esecuzione Formazione conoscenza teorica conoscenza teorico-pratica in Spettrometria di Massa

8 Identificare X / Determinare la quantità di Y CAMPIONE ESTRAZIONE PURIFICAZIONE ANALISI RISULTATO IL COMPUTER HA DETTO.!!!! INTERPRETAZIONE Ipse dixit!

9 Identificare X / Determinare la quantità di Y CAMPIONE ESTRAZIONE PURIFICAZIONE ANALISI RISULTATO INTERPRETAZIONE Un risultato affidabile richiede: scelta corretta del tipo di esperimento corretta esecuzione corretta interpretazione dei dati

10 P E T T R O M E T R I A D I M A A p e c i f i c i t à e l e t t i v i t à e n s i b i l i t à p e e d t e c h i o m e t r i a

11 NOMENCLATURA USATA NEL CORSO E ACRONIMI NOMENCLATURA USATA NEL CORSO E ACRONIMI

12 NOMENCLATURA USATA NEL CORSO E ACRONIMI

13 SORGENTI DI IONIZZAZIONE NOMENCLATURA USATA NEL CORSO E ACRONIMI

14 ANALIZZATORI NOMENCLATURA USATA NEL CORSO E ACRONIMI

15 NOMENCLATURA USATA NEL CORSO E ACRONIMI

16 Caro collega, so che recentemente avete comprato la Tandem Max Caro collega, so che in Toscana usate la T-max.

17

18 CHE CONFUSIONE!!!!!!

19 Tandem mass spectrometry: Spettrometria di Massa Tandem Tandem mass spectrometer: Spettrometro di Massa Tandem cioè strumento in grado di registrare ioni frammento derivanti da uno o più ioni precursori: ES. TRIPLI QUADRUPOLI; TRAPPOLE LINEARI E NON; SISTEMI Q-TRAP etc Tandem mass spectrometer o Spettrometro di Massa Tandem NON indica esclusivamente un sistema TRIPLO QUADRUPOLO quindi i due termini NON sono biunivocamente ed esclusivamente interscambiabili. Tandem mass spectrometer o Spettrometro di Massa Tandem: I TERMINI TANDEM MASSA; TANDEM MAX; T-MAX; TANDEM. NON FANNO PARTE DI NESSUN SISTEMA NAZIONALE O INTERNAZIONALE DI NOMENCLATURA O ACRONIMI RIFERITO A SPETTROMETRI DI MASSA

20 IL PERICOLO MAGGIORE E CHE SI RITENGA CHE LO SPETTROMETRO DI MASSA POSSA ESSERE UN ROBOT DI LABORATORIO AUTONOMO O UNA SCATOLA NERA IN CUI NON SIA NECESSARIA L ESPERIENZA DELL OPERATORE CLICK MS

21 NON E UNA SCATOLA NERA. NON E SUFFICIENTE UN CLICK PER OTTENERE UN RISULTATO AFFIDABILE L OPERATORE E FONDAMENTALE: NON E SUFFICIENTE AVERE UNO SPETTROMETRO DI MASSA PER OTTENERE UN RISULTATO Mumble.. Mumble..

22 IL POSSEDERE UNA MACCHINA PER RAGGI X O UNA RISONANZA MAGNETICA CI RENDE TECNICI RADIOLOGI O RADIOLOGI?

23 PER POTER INTERPRETARE UNA RISONANZA O DELLE LASTRE E FONDAMENTALE ACQUISIRE FORMAZIONE ED ESPERIENZA

24 ESEMPI IN CUI LE RISPOSTE FORNITE DAI SOFTWARE DI GESTIONE DEGLI STRUMENTI HANNO DATO INDICAZIONI ERRATE DI SOSPETTA DIAGNOSI ED IN CUI L INTERPRETAZIONE DEGLI SPETTRI DA PARTE DELL OPERATORE E RISULTATA DIRIMENTE

25 Glutamate Formimino Trasferase Deficiency

26 sample 01b-C0 02b-C2 03b-C3 06b-C4 07b-C4DC 08b-C4OH 09b-C5 10b-C5DC X Y Z T L OPERATORE CHE SI FIDA DEL RISULTATO DELLO STRUMENTO E INDIRIZZATO VERSO UNA POSSIBILE SCAD O IBDH

27 Profilo delle acilcarnitine D2-Gly D9-Phe D3-Xle Gly GAA Amm-Lev. D2-Orn Orn Gly-Pro. Arg D5-Arg Cit l5-tyr l2-cit FormGlut HomoCit. Hawk. Arg. Succ.

28 controllo C µm (v.n. < 0.46) D 3 -C > >85 C µm (v.n. < 0.46) Paziente (SCAD o IBDH?) D 3 -C > >85

29 Control Affected FIGLU Acylcarnitine profile of affected newborn vs control. In affected patient besides the expected Th. ion (assigned to the butylated C4-acylcarnitine) there was a very intense signal at mass Th which is usually not expected, and anyway not related to the abovementioned C4-acylcarnitine butyl-ester.

30 FIGLU 288.3Th=C4 in DBS+contributo dell isotopo M+1 del segnale Th

31 L esperienza nell interpretazione di uno spettro ha permesso all operatore di evitare un falso positivo (SCAD/IBDH) e di evitare un falso negativo (Glutamate Formimino Trasferase Deficiency)

32 sample 55b-Ala 56b-Val 57b-Xle 58b-Met 59b-Phe 60b-Tyr X Y LEGGENDO SOLO IL RISULTATO E POSSIBILE STABILIRE SE ENTRAMBI I CAMPIONI X E Y SONO IPERMETIONINEMIE?

33 Controllo CASO Y Met D 3 -Met MAT o IPERMETIONINEMIA MET=153.65µmol/L (v.n. 46) D 3 -Met

34 CASO X CD 3 But D-Met D 3 -Met Met Ipermetioninemia o errore di sintesi dello standard interno? D 3 -Met CONTROLLO D-Met Met

35 Ile+Leu+OHPro Hyperhydroxyprolinaemia affected Healthy la Marca G, et al. Hyperhydroxyprolinaemia: a new case diagnosed during neonatal screening with tandem mass spectrometry Rapid Commun Mass Spectrom. 2005;19:

36 MSUD VAL Ile+Leu+(OHPro) I.S Ile+Leu+OHPro I.S Hyperhydroxyprolinaemia affected VAL Ile+Leu+OHPro I.S Healthy VAL

37

38 Val Leu-IS IsoLeu-IS+ AlloIle-IS Controllo Val-IS NorVal IsoLeu+ AlloIle Leu NorLeu Val Val-IS NorVal IsoLeu-IS+ AlloIle-IS IsoLeu+ AlloIle Leu Leu-IS MSUD NorLeu

39

40

41 XIC of +MRM (2 pairs): Exp 1, 374.2/85.0 amu from Sample 22 (Bl2) of DataSET1.wiff (Turbo S... Max. 3.5e4 cps. 3.5e4 3.4e e4 3.0e4 Ctr blood 2.8e4 2.6e4 2.4e4 2.2e4 2.0e4 1.8e4 1.6e4 1.4e4 1.2e4 1.0e SC MMC Time, min

42 XIC of +MRM (2 pairs): Exp 1, 374.2/85.0 amu from Sample 19 (5923) of DataSET1.wiff (Turbo... Max. 4.9e5 cps. 4.9e e5 4.0e5 SUCLA2 3.5e5 3.0e5 2.5e5 SC 2.0e5 1.5e5 MMC 1.0e5 5.0e Time, min

43 XIC of +MRM (2 pairs): Exp 1, 374.2/85.0 amu from Sample 27 (Milanese) of DataSET1.wiff (Tu... Max. 8.8e4 cps. 8.8e4 8.5e4 8.0e4 7.5e4 7.0e4 MMAciduria (MUT 0) 6.5e4 6.0e4 5.5e4 5.0e4 4.5e4 MMC 4.0e4 3.5e4 3.0e4 SC e4 2.0e4 1.5e4 1.0e Time, min

44

45 I KIT QUELLI PER LA MS SOLITAMENTE CONTENGONO: -STANDARD MARCATI CON ISOTOPI STABILI -SOLUZIONI STANDARD (BUFFER DI REAZIONE) -CONSUMABILI -CALIBRATORI POSSONO ESSERE UTILI MA NON SONO SUFFICIENTI

46 I KIT NON PERMETTONO ALL OPERATORE DALL ESIMERSI NELLA MANUTENZIONE ORDINARIA DELLO SPETTROMETRO DI MASSA NON DANNO INDICAZIONI SE E QUANDO VANNO SOSTITUITI ALCUNI CONSUMABILI FORMAZIONE ED ESPERIENZA RISULTANO FONDAMENTALI