DIPARTIMENTO DI FARMACOLOGIA PRECLINICA E CLINICA
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- Ignazio Ferrari
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1 DIPARTIMENT DI FARMACLGIA PRECLINICA E CLINICA PRGETT Monitoraggio della terapia enzimatica sostitutiva (ERT) nella malattia di Anderson-Fabry RESPNSABILE SCIENTIFIC: Prof. Gloriano Moneti CLLABRATRI: F. Boscaro, G. La Marca, G. Bartolucci, G. Pieraccini. E stato messo a punto un metodo per il dosaggio dei livelli plasmatici ed urinari di globotriaosylceramide (Gb3) in pazienti colpiti dalla malattia di Anderson-Fabry. L analisi prevede l uso della tecnica Flow Injection Analysis-Electrospray Ionization-Tandem Mass Spectrometry (FIA-ESI-MS/MS). Essendo il metodo molto sensibile, la preparazione dei campioni di plasma ed urine è molto rapida, infatti i campioni sono solo diluiti 50 volte ed iniettati. La quantificazione degli analiti avviene in uno strumento a triplo quadrupolo (QqQ), con la modalità Multiple Reaction Monitoring (MRM). Sono stati presi in considerazione i seguenti parametri: la linearità della risposta degli standard di calibrazione, la precisione delle analisi, l accuratezza e il limite di rivelazione del metodo. La procedura proposta permette una rapido ed accurato dosaggio della globotriaosylceramide in campioni biologici. I dati ottenuti da volontari sani e da pazienti colpiti dalla malattia di Anderson-Fabry suggeriscono un ruolo potenziale di questa tecnica per monitorare l efficacia della terapia sostitutiva con enzima prodotto da DNA ricombinante (ERT).
2 DIPARTIMENT DI FARMACLGIA PRECLINICA E CLINICA TITL DEL PRGETT: Monitoraggio della terapia enzimatica sostitutiva (ERT) nella malattia di Anderson-Fabry RESPNSABILE SCIENTIFIC: Prof. Gloriano Moneti CLLABRATRI: F. Boscaro, F. Luceri, G. la Marca, G. Bartolucci e G. Pieraccini. Centro di riferimento della Toscana per la malattia di Anderson-Fabry Dr. F. Martinelli Dr. A. Sodi Dr. W. Borsini Dr. M. Ciaccheri Dr. M.R. Scordo Prof. G. Moneti Dr. F. Torricelli Unità di Nefrologia (Coordinatore) Dipartimento di ftalmologia Dipartimento di Neurologia Unità di Cardiologia Unità di Neuropsichiatria CISM Unità di Citogenetica e Genetica spedale di Careggi,, Firenze Università di Firenze Università di Firenze spedale di Careggi,, Firenze spedale di Careggi,, Firenze Università di Firenze spedale di Careggi,, Firenze
3 Malattia di ANDERSN - FABRY William Anderson ( ) Johannes Fabry ( ) Blackwell Science Ltd. EREDITARIETA incidenza stimata: 1 : 40,000 maschi xx x*y x*y xx In Italia: 500 : 0 M maschi
4 Human Globotriaosylceramide (Gb3) H H H H H H H H H H H NH C ( 14-4 ) 3 ( ) 1 3 α Galactosidase A L assenza o la ridotta attività dell enzima è responsabile di un difetto metabolico che si manifesta nella sindrome di Anderson-Fabry la mancata idrolisi del legame α galactosidico comporta un accumulo di Gb3 prevalentemente nei fluidi biologici e nelle cellule endoteliali dei vasi sanguigni questo accumulo puo manifestarsi anche dopo molto tempo con patologie a danno di vari organi cellule del tessuto connettivo, miocardico e reticoloendoteliale lisosomi dell endotelio vascolare cellule epiteliali della cornea e del rene Angiocheratoma Malattia di Anderson-Fabry pacità della cornea cellule muscolari lisce del sistema cardiovascolare -renale fluidi biologici gangli e cellule perineurali del SNA
5 H H FIA-ESI-TF (MARINER) 100 % Intensity H H H H H H H R=4:1 R=4: H NH C C 55 H 80 N IS H ( ) R ( ) 1 3 R=: R=: R=4: Mass (m/z) Measured m/z Calculate m/z Error (ppm) DBE Formula 118, , , ,5 C58H107N18Na 1130, , , ,5 C58H109N18Na 1154, , , ,5 C60H109N18Na 1156, , ,9837 5,5 C60H111N18Na 1158, , ,8670 4,5 C60H113N18Na 117, ,7645-4,1461 5,5 C60H111N19Na 1174, , , ,5 C60H113N19Na LC-ESI ESI-MS/MS FIA - Plasma calibration curve 10 µg/ml 0 µg/ml Autosampler Flow Injection Analysis (FIA) HPLC HPLC Column Electrospray Interface 0 µg/ml.5 µg/ml 5 µg/ml Time, min Q1 Q Q3 Triple Quadrupole MS/MS 15 Samples MRM C4:0 C4:1 C4: C:0 C:1 C0:0 C18:0 C16:0 C16:0 HPLC Plasma C:0 C4:1 C0:0 C:1 C4:0 C18:0 C4: Time, min 1 Sample
6 PLASMA URINE 0 µl of plasma + 980µL of Acetone : MeH : H 45 : 45 : 10 v/v Proteine Precipitation and centrifugation g x 5 min 0 µl of urine + 980µL of Acetone : MeH : H 45 : 45 : 10 v/v 1:50 Dilution 1:50 Dilution 800 µl liquid phase 800 µl liquid phase 0. µl Inj. 0. µl Inj. FIA-ESI ESI-MS/MS ( PE SCIEX API 365 ) Gb3 in AFD male biological fluids Intensity, cps weeks therapy C16:0 Basal C18:0 C0:0 C:1 C4: C:0 C4:1 C4:0 Plasma Intensity, cps Time, min Basal weeks therapy Urine Time, min
7 . ERT follow up ERT follow up Plasma Gb3: AFD Male (V.A.) TKT Urine Gb3: AFD Male (V.A.) TKT Gb3 (µg/ml) 1,0 10,0 8,0 6,0 4,0,0 0, Weeks Gb3 (mg/4h) 18,0 16,0 14,0 1,0 10,0 8,0 6,0 4,0,0 0, Weeks Plasma Gb3: AFD Female (C.G.) TKT Urine Gb3: AFD Female (C.G.) TKT 1,00 18,0 10,00 16,0 14,0 Gb3 ug/ml 8,00 6,00 4,00 Gb3 (mg/4h) 1,0 10,0 8,0 6,0 4,0,00,0 0, Weeks 0, weeks 3,00 Gb3 Plasma (µg/ml) 18,00 13,00 8,00 3,00 4 Mese 5 Mese 6 mese 7 mese 6,5 mese 9 mese 1 Settimana 1 Mese Mese 3 Mese 0,00 Gb3 Urine (nmoli/g Creatinine) 16,00 4 Mese 1,00 8,00 4,00 0,00 6,5 Mese 7 Mese 9 Mese 1 Settimana 1 Mese Mese 3 Mese
Rivelazione, identificazione, caratterizzazione strutturale
HPLC Separazione cromatografica di proteine e peptidi in miscela Eluato Rivelatore UV (fotodiodi) Cromatogramma UV (picchi generati dall assorbimento di ogni proteina) Eluato Spettrometro di massa ESI-Trappola
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