Il comportamento tecnologico del latte: valutazione attraverso tecniche di microscopia

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1 Il comportamento tecnologico del latte: valutazione attraverso tecniche di microscopia D Incecco P., Limbo S., Hogenboom J.A., Rosi V., Pellegrino L. Dipartimento di Scienze per gli Alimenti, la Nutrizione e l Ambiente, Università degli Studi di Milano Piattaforma di microscopia avanzata di ateneo 6 Congresso lattiero-caseario AITeL LATTE E DERIVATI: RICERCA, INNOVAZIONE E VALORIZZAZIONE Trento, 20 settembre 2018

2 Organizzazione Parte 1: I lipidi del latte: modifiche e interazioni Parte 2: Fenomeni di cristallizzazione nei formaggi extra duri

3 I lipidi del latte: modifiche e interazioni Globuli del diametro di 0,1 14 µm in emulsione Densità: 0,950 kg/m 3 Strato di membrana Trigliceridi

4 I lipidi del latte: modifiche e interazioni Membrana Porzione interna Liss Rhod PE eccitazione 543 nm emission nm Nile Red eccitazione 488 nm emissione nm

5 I lipidi del latte: modifiche e interazioni Effetto del trattamento di omogeneizzazione Non trattato Omogeneizzazione classica Omogeneizzazione sperimentale 5 µm 2,5 µm 2,5 µm D Incecco et al., 2018

6 Effetto del trattamento di omogeneizzazione Incremento di shelf life

7 Omogeneizzazione classica Omogeneizzazione sperimentale Dopo 4 mesi Dopo 12 mesi

8 I lipidi del latte: modifiche e interazioni Effetto del trattamento di omogeneizzazione Non trattato Omogeneizzazione classica Omogeneizzazione sperimentale 300 nm 100 nm 300 nm D Incecco et al., 2018

9 I lipidi del latte: modifiche e interazioni Effetto della temperatura: valutazione dell organizzazione sopramolecolare del grasso durante l affioramento naturale 4 C 8 C 8 C preheated 22 C 40 C Volume Contenuto di grasso Microstruttura Analisi d immagine Diametro dei globuli di grasso in % volume

10 Relazione tra contenuto di grasso, volume di crema e temperatura di affioramento

11 Globuli di grasso in creme affiorate a diversa temperatura Latte crudo 4 C 8 C 8 C preriscaldato 22 C 40 C Bar = 10 µm D Incecco et al., 2018

12 % Volume Volume frequency of fat globule size by image analysis Raw milk 50 Cream 4 C 40 Cream 8 C Cream 8 C preheated Cream 22 C Cream 40 C Diametro dei globuli di grasso (µm)

13 Coalescenza dei globuli di grasso

14 I lipidi del latte: modifiche e interazioni Interazione globulo di grasso C. tyrobutyricum durante l affioramento naturale

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16 IMMUNO ORO MARCATURA B F B IgA F IgA > IgM IgA IgA 100 nm

17 Siti antigenici su C. tyrobutyricum 100 nm

18 I lipidi del latte: modifiche e interazioni Grasso Proteina Combinati Micelle del diametro di nm in dispersione colloidale Numero micelle /ml superficie 4 mq/ml

19 Parte 2: Formazioni cristalline nei formaggi extra duri

20 Formazioni cristalline nei formaggi extra duri

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22 Terminologia cristallo perla 0,5 cm sono stati studiati anche i microcristalli

23 ANALISI DELLE PERLE Sferiche, con diametro > 2 mm, presenti ovunque nel formaggio Visibili solo dopo 1 anno di stagionatura ma più facilmente dopo mesi Bianche, di aspetto amorfo ma facilmente scalzabili dal formaggio

24 ANALISI DEGLI PERLE Microscopia ottica TEM

25 PERLE IN NINIDRINA OUT PERLA La ninidrina è passata attraverso il formaggio ma non è penetrata nella PERLA 200 µm 50 µm

26 TAGLIO DEL COAGULO Linea di giunzione tra due chicchi di cagliata Globulo di grasso Coagulo proteico Kalab et al., 1987

27 PERLA Microscopia ottica: sezione semifine Le linee più scure sono più ricche in proteina e corrispondono alle giunzioni tra i chicci di cagliata Le cavità derivano dalla incompleta fusione dei chicchi di cagliata 200 µm 50 µm

28 PERLA: COMPOSIZIONE CHIMICA ALTRO CENERI PERLA FORMAGGIO PROTEINA GRASSO FORMAGGIO PERLA La PERLA è più ricca in proteina* e più povera di umidità*, grasso e ceneri* * p < 0,05 UMIDITÀ (g/100 di formaggio)

29 Orn His Arg Asp Thr Ser Gly Ala Cit Tyr Glu Phe Lys Val Met Ile Leu PERLA: COMPOSIZIONE CHIMICA PERLA FORMAGGIO contiene maggiori quantità di aminoacidi idrofobici liberi

30 TEM: SEZIONI ULTRASOTTILI PERLA GRASSO FORMAGGIO PROTEINA 2 µm 2 µm1 µm

31 Microcristalli Microscopia ottica Microscopia confocale TEM Microscopia confocale Raman

32 Microcristalli Microscopia ottica: sezione semifine I formaggi extra duri contengono elevate quantità di microcristalli pari a /mm² 50 µm

33 Microcristalli Microscopia confocale: sezione semi fine Strutture circolari, ovali o a forma di rene Diametro µm 10 µm

34 TEM: sezioni ultrafini Microcristalli Struttura complessa con 3 zone: 1. Centrale a forma stellata 2. Intermedia con struttura fibrillare 3. Esterna ad anello PROTEINA La zona intermedia è formata da unità prismatiche, distribuite radialmente attorno al cristallo centrale 5 µm 300 nm

35 Microcristalli CRISTALLO CENTRALE CALCIO FOSFATO PURO 91% di sovrapposizione con lo spettro del calcio fosfato puro

36 IPOTESI DI GENESI Nel formaggio giovane, la fermentazione lattica abbassa il ph a 5-5,5 e il calcio fosfato si solubilizza dalla micella di caseina nella fase acquosa Durante la stagionatura, la fase acquosa del formaggio si concentra progressivamente Cristallizzazione del calcio fosfato

37 Cagliata acida Formaggio stagionato (> 9 mesi circa) Tempo di stagionatura Formaggio stagionato (> 12 mesi) Microcristallo di fosfato di calcio Cristallo di tirosina PERLA Dato che cristalli e perle aumentano durante la stagionatura del formaggio, la loro presenza deve essere interpretata come un fenomeno della stagionatura e quindi garanzia di una corretta durata della stessa

38 CONCLUSIONI L approccio multidisciplinare è senza dubbio quello necessario per il corretto studio dei fenomeni in ambito lattiero caseario e la microscopia si dimostra sempre più uno strumento analitico indispensabile da affiancare a valutazioni chimiche, microbiologiche e tecnologiche.

39 Grazie per l attenzione