EXCALIBUR. Nuovo Esperimento. Durata: 3 anni. (EXposure effects At Low-doses of Ionizing-radiation in Biological cultures) Collaborazione:

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1 Nuovo Esperimento (EXposure effects At Low-doses of Ionizing-radiation in Biological cultures) LNL Collaborazione: Bologna, Cagliari, LNF, LNGS, LNL, Pavia, Pisa, Roma3 Durata: 3 anni 1

2 Bologna: G. Castellani C. Franceschi M. Francesconi D. Remondini S. Salvioli E. Verondini I. Zironi M. Marengo A. Pession Sezioni INFN Partecipanti e Responsabili Locali Cagliari: A. Brunetti P. Bonelli M. Dattena N. Diaz P.L. Fiori B. Golosio G.L. Masala P. Oliva G.F. Pintus P. Randaccio P. Rappelli S. Stumbo Rapp. Naz.: R. Cherubini, INFN-LNL LNF & LNGS: B. Canonico M. Balata R. Bedogni F. Centis W. Cesarini G. Cugia A. Esposito F. Grianti M. Laubenstein F. Lucchetti S. Nisi S. Papa S. Stramigioli M. Valentini L. Zamai LNL: L. Celotti R. Cherubini V. De Nadal S. Gerardi F. Ianzini M. Mackey D. Zafiropoulos Pisa: G. Bisogni U. Bottigli S. De Maria Pavia: A. Buttafava D. Dondi A.Faucitano Roma3: A. Antoccia F. Berardinelli A. Sgura C. Tanzarella FTE: BO=5.0 CA=3.3 LNF=0.4 LNGS=3.1 LNL=3.5 PV=1.5 PI=1.1 ROMA3= 2.0 2

3 Scopo, Attività prevista & Implicazioni Studio degli effetti biologici indotti a seguito di esposizione a basse dosi di radiazioni ionizzanti, con particolare riguardo agli effetti non-lineari (ipersensibilità, radioresistenza indotta, risposta adattativa, effetti di bystander..) 1. Studio dei meccanismi di induzione e trasmissione del danno a basse dosi di radiazioni, in colture cellulari, in funzione della qualità della radiazione (raggi γ /X, prtoni, alfa, ioni pesanti di varie energie) 2. Studio dell influenza dello stato di crioconservazione sulla risposta cellulare alle radiazioni ionizzanti (raggi γ) di sistemi biologici in-vitro e in-vivo, esposti al fondo naturale di radiazioni. Studio delle cause della azione protettiva della crioconservazione (come da risultati dell Esperimento CRIORAD). 3. Contributo alla valutazione di rischio per esposizioni alle basse dosi di R.I. Sistematica di effetti biologici indotti in diversi sistemi cellulari di mammifero, in coltura o crio-conservati, in funzione della qualità della radiazione e della dose (nel regime delle basse dosi), inclusi sistemi in-vivo (embrioni di pecora) 3

4 Esposizione a basse dosi di radiazioni ionizzanti Contributo delle varie sorgenti naturali di radiazioni ionizzanti alla dose annuale media all uomo negli U.S.A. Principali sorgenti naturali Terrestri e loro vite medie Potassio K 1.3x10 9 a Rudio Rb 5x10 10 a Torio Th 1.4x10 10 a Uranio U 4.5x10 10 a Contributo alla dose media annuale delle principali sorgenti di irraggiamento interno 4 F.A. Mettler et al, 1995 Contributo relativo delle varie sorgenti di radiazioni ionizzanti alla dose annuale media all uomo nel mondo. Potassio K 17 mrem/a Carbonio C 10mrem/a Polonio-210 sino a Piombo-210 Totale 210 Po 210 Pb S.C. Bushong, mrem/a 39mrem/a 4

5 Valutazione di rischio alle basse dosi Studi a dosi medio-alte: - studi in vitro: irraggiamenti a fascio largo - studi epidemiologici: sopravvissuti di Hiroshima e Nagasaki, minatori di uranio, Chernobyl, popolazione medicalmente esposta + Estrapolazione alle basse dosi? assunzione cautelativa in radioprotezione: andamento lineare alle basse dosi Studi epidemiologici diretti a basse dosi (E.J. Hall, Int. J. Radiation Oncology Biol. Phys., Vol. 65, No. 1, pp. 1 7, 2006) - misura dell esposizione indoor di radon e correlazione con l incidenza di cancro ai polmoni problemi metodologici nella determinazione dell esposizione dell individuo 5 5

6 Effetti di esposizione a basse dosi di radiazioni ionizzanti: Evidenze sperimentali: studi in-vitro Effetti non-lineari alle basse dosi: Ipersensibilità e radioresistenza indotta Risposta adattativa Effetti non target : Bystander Effect e Instabilità genomica 6 6

7 Effetti delle basse dosi: Ipersensibilità (HRS) e Radioresistenza indotta (IRR) (Marples and Joiner,Int. J. Radiat. Biol. 2001, vol. 77, ) Irraggiamenti cellulari con RX: Cellule normali e tumorali di radiosensibilità Iper-sensibilità alle basse dosi Radioresistenza indotta Meccanismo protettivo indotto da basse dosi di radiazioni Con neutroni e pioni di alto LET: Andamento lineare (no HRS/IRR) 7 Curva dose-rischio SOPRA-LINEARE? Curva dose-rischio SUB-LINEARE? 7

8 Effetti delle basse dosi: Ipersensibilità e Radioresistenza indotta (E.Tsoulou et al., Int. J. Rad. Biol. (2001),vol. 77, ) at LNL: broad ion beam cell irradiations: 60 Co γ rays and 4 He 2+ ions of different energies (59, 79 and 102 kev/µm LET) Chinese hamster V79 cells Iper-sensibilità alle basse dosi (HRS( HRS) Radioresistenza indotta (IRR( IRR) 8

9 Effetti delle basse dosi: HRS/IRR OPEN QUESTIONS 1. Relazione con la qualità della radiazione? Dall esperimento SHEILA e dipendenza dalla linea cellulare??... 9

10 Effetti delle basse dosi: HRS/IRR OPEN QUESTIONS 2. L effetto è evidente solo in termini di morte clonogenica? Nasonova et al., Radiat. Environ. Biophys. (2006) Nuta and Darroudi, Radiat. Environ. Biophys. 47 (2008) 265 Cherubini et al., Nuovo Cimento C (accettato per la pubblicazione, mag.08) Evidenze di HRS/IRR, in termini di deviazioni dall andamento lineare, in curve dose-risposta di micronuclei e aberrazioni cromosomiche indotte da raggi γ 10

11 Effetti delle basse dosi: Bystander effect By soluble molecules? By gap-junction? 1 cellula colpita all interno di una popolazione Danno (morte cellulare, apoptosi, induzione di micronuclei, trasformazioni 11 oncogeniche) espresso in più di 1 cellula (..evidenze sperimentali..) Quali meccanismi di induzione e trasmissione del danno?... secrezione di fattori citotossici nel mezzo di coltura da parte delle cellule irraggiate comunicazione diretta tra cellule attraverso gap-junction. ROS/RNS (NO);. Curva dose-rischio SOPRA-LINEARE Curva dose-rischio SUB-LINEARE (apoptosi) 11

12 Radiazione Mitocondrio produce energia (possiede il suo DNA - mtdna) Interazione diretta (e- δ) e indiretta (ROS) Nucleo = sede del materiale Genetico (DNA) Citoplasma SG2008 Citoplasma N = Nucleo ( 8 µm ) 12 Modificato da L.E. Feinendegen,2005

13 Signaling between Tissue Cells and Matrix Hit Cell Tissue Gap Junction Cells = Bystander Effects Matrix L.E. Feinendegen, 2005 Ulteriore Open problem : Qual è il target della radiazione? 13

14 Effetti delle basse dosi OPEN QUESTIONS 3. HRS e BE? Mothersill et al., Radiat. Res. 157 (2002) 526 Nuta and Darroudi, Radiat. Environ. Biophys. 47 (2008) 265 I meccanismi dei due fenomeni sono analoghi?.. I due fenomeni sono esclusivi?... 14

15 Effetti delle basse dosi: Risposta adattativa 1) Priming dose: 5-40 cgy RX qualche h prima dell irraggiamento 2) Irraggiamento (Challenging dose) Osservato: in vivo e in vitro (protozoi, alghe, cell vegetali e di mammifero) per diverse linee cellulari per diversi end-point biologici (mutazioni, trasformazioni oncog., micronuclei, danno cromosomico e sopravvivenza cellulare) SG2008 Curva dose-rischio SUB-LINEARE 15

16 Effetti delle basse dosi: Instabilità Genomica L esposizione a radiazioni può dare inizio ad una cascata di eventi che produce un aumento del rateo di mutazioni e danno cromosomico nella progenie di cellule irraggiate (effetti tardivi) Per diverse linee cellulari: cellule umane normali, linfociti umani, cellule murine di midollo osseo Kadhim et al. (1992): alterazioni nel cariotipo di cell esposte a dosi di particelle α corrispondenti a 1 ione/cell (in media) Limoli et al. (1999, 2000): instabilità cromosomica nel 3% di cloni di cell ibride umane/criceto per 1 Gy di RX; nel 4% di cloni per 1 Gy di ioni ferro SG2008 Curva dose-rischio SOPRA-LINEARE 16

17 Effetti delle basse dosi OPEN QUESTIONS : ROS/RNS?? Numerosi dati sperimentali sembrerebbero indicare che ROS (Reactive Oxygen Species) e RNS (Reactive Nitrogen Species), in particolare l ossido nitrico NO, siano tra le molecole chiave coinvolte nell induzione e trasmissione del danno indotto a basse dosi di radiazioni ionizzanti e quindi tra i principali mediatori dell effetto bystander [Lehnert et al., 1997; Azzam et al., 2002; Shao et al., 2002; Han et al., 2007]. Utilizzando degli scavenger di tali molecole, quali per esempio il DMSO e il c-ptio, si è osservata una riduzione del livello di bystander, ipotizzando che questa possa essere dovuto alla soppressione rispettivamente di radicali [Kashino et al., 2007] e di NO [Shao et al., 2003], che agiscono sul DNA. Una delle più importanti sorgenti di ROS nelle cellule di mammifero è costituita dai mitocondri, suggerendo che uno dei bersagli cellulari delle radiazioni ionizzanti a basse dosi sia rappresentato dal DNA mitocondriale (mtdna) e che i mitocondri siano coinvolti nella trasmissione di segnale dopo l irraggiamento, attraverso la produzione di radicali liberi reattivi [Tartier et al., 2007]. ROS/RNS sembrerebbero anche implicati nell espressione della risposta adattativa, sia inducendo direttamente il danno al DNA che attiva poi la risposta adattativa, sia producendo la trascrizione/regolazione di geni e proteine che conferiscono radioresistenza alla cellula [Matsumoto et al., 2007]. Alcuni autori ipotizzano il possibile coinvolgimento dello stress ossidativo prodotto dai ROS anche nell induzione del fenomeno di HRS/IRR in cellule non ciclanti come 17 i linfociti [Nasonova et al., 2006]

18 Effetti delle basse dosi: Effetti della radiazione di fondo su Sistemi Crio-conservati Il metodo di conservazione per lunghi periodi di tempo di sistemi biologici è la cosiddetta crio-conservazione, ovvero il loro mantenimento, con opportuni trattamenti preparatori, mediante congelamento, vitrificazione o ibernazione in opportune installazioni di laboratorio (dewar per azoto liquido, -196 C, 77 K). Alle temperature criogeniche i processi biochimici cellulari sono inibiti e quindi si impedisce la senescenza cellulare e la degradazione del materiale biologico. Dipendendo dall ambiente in cui i sistemi biologici crio-conservati vengono depositati, essi subiranno un irraggiamento protratto (per anni e spesso per decine di anni, come nel caso delle banche di colture cellulari o delle banche di cellule staminali e/o germinali) a causa del fondo naturale di radiazioni. Dipendendo dal tempo di conservazione e mancando l azione antagonista continua dei meccanismi di riparazione, i danni prodotti dall esposizione delle cellule crio-conservate al fondo gamma, in principio, andranno accumulandosi, trasformando l esposizione a dose protratta (bassissimo rateo di dose del fondo ambientale) in esposizione a dose acuta, al momento dello scongelamento e rivitalizzazione delle cellule. Recenti risultati sperimentali ottenuti confrontando la risposta a raggi-γ di diversi sistemi biologici in condizioni criogeniche e a temperature ambiente, in termini di vari end-point biologici, hanno mostrato un effetto protettivo della crioconservazione rispetto all azione delle R.I (raggi-γ) [Esp. CRIORAD] 18

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20 .e quindi l Esperimento Sulla base anche delle evidenze sperimentali derivanti dai precedenti esperimenti CRIORAD e SHEILA, si propone: 1. Lo studio dell azione delle radiazioni ionizzanti, in termini di diversi end-point biologici, e dei meccanismi di induzione e trasmissione del danno a basse dosi di radiazioni, in colture cellulari di mammifero, in funzione della qualità della radiazione (raggi γ/x; protoni, particelle alfa/ioni elio-4 e ioni pesanti di varie energie) e della dose 2. Lo studio dell influenza dello stato di crioconservazione sulla risposta cellulare alle radiazioni ionizzanti (raggi γ) di sistemi biologici in-vitro e in-vivo (embrioni di pecora), esposti al fondo naturale di radiazioni. Studio delle cause della azione protettiva della crioconservazione. 20

21 Si studierà: la dipendenza della risposta dalla qualità della radiazione (e dalla dose e rateo di dose) la dipendenza dalla linea cellulare la dipendenza dall end-point biologico considerato i meccanismi di comunicazione inter- e intra-cellulare il ruolo dei ROS/RNS quali molecole mediatrici dell azione delle radiazioni alle basse dosi. la relazione tra i vari effetti e loro implicazioni nelle valutazioni di rischio per esposizione a R.I. particolare riguardo sarà rivolto: all HRS/IRR e il BE e la loro eventuale interazione (HRS/IRR BE) allo studio del ruolo dei ROS nel danno indotti dalle radiazioni in sistemi crioconservati. 21

22 Studio degli Effetti delle basse dosi: Approcci sperimentali cellule di mammifero in coltura Condizioni di irraggiamento: -Irraggiamento a basse dosi con fasci accelerati di ioni di diversa qualità (tipo e energia/let), allargati a dimensioni del cm 2 ed estratti in aria (intera popolazione cellulare) - Irraggiamento a basse dosi con fasci allargati di ioni in cui una frazione della popolazione cellulare è schermata dalla radiazione - Irraggiamenti selettivi con microfasci di ioni di singole cellule all interno di una popolazione cellulare SG2008 Ta sp=200µm Radiation Acceleratori LNL: VdG CN; Tandem-ALPI; facility di broad- e di micro-beam Sorgenti gamma di Co-60 o Cs137 nei vari Laboratori coinvolti 22

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24 Studio degli Effetti delle basse dosi: Approcci sperimentali Endpoints biologici in studio in colture cellulari di mammifero: Sopravvivenza cellulare Micronuclei Aberrazioni cromosomiche Telomeri P53 e CDKN1A Correnti ioniche (patch clamp) Espressione/identificazione geni (micro-array) ROS (Reactive Oxygen Species) 24

25 Gruppi coinvolti: 1. Bologna Misure di Patch Clamp su fibroblasti Misure di espressione genica con tecnica di micro-array Misure di fluorescenza dinamica sulle cellule irraggiate di messaggeri (mrna) e attività trascrizionali e di stato redox cellulare 2. LNL Inattivazione cellulare (morte mitotica o riproduttiva) Espressioni di proteine specifiche Induzione di micronuclei 3. Roma3 Modulazione dose-dipendente del danno citogenetico e del metabolismo del telomero in cellule di mammifero Contributo dei ROS a basse-dosi di radiazioni 25

26 Studio dell influenza dello stato di crio-conservazione di sistemi biologici sulla loro risposta alle radiazioni ionizzanti. La valutazione dell eventuale contributo dell accumulo di dose del fondo naturale (gamma) in cellule crio-conservate nella incidenza di morte cellulare o induzioni di mutazioni al momento dello scongelamento delle stesse cellule per il loro utilizzo di laboratorio o in clinica (es., cellule staminali, germinali, etc). Studio delle cause dell azione protettiva della crioconservazione, osservata su diversi sistemi e in diversi Laboratori all interno dell Esperimento CRIORAD Contenitori raffreddati con azoto liquido per la conservazione delle cellule 26

27 In Vitro Embryo Production AGRIS Bonassai Sassari, Italy - Maturation of Oocytes (24h) Fertilisation of Oocytes (24h) Culture of embryos (6-7d) Vitrificazione 27

28 Irradiation Day AGRIS Bonassai Sassari, Italy - Thermos Inox just before irradiation 28

29 Endpoints biologici in studio in sistemi biologici in-vitro e in-vivo: Studio dell influenza dello stato di crio-conservazione di sistemi biologici sulla loro risposta alle radiazioni ionizzanti. Approcci sperimentali Sopravvivenza cellulare Mutazioni DNA ssb e DNA dsb (rotture al DNA) Espressioni di geni selezionati + Ruolo degli Scavengers ROS (Reactive Oxygen Species), NO (Nitrogen Oxide) Spettroscopia EPR di intermedi radicalici del danno indotto da R.I. Sorgenti gamma di Co-60 o Cs137 nei vari Laboratori coinvolti 29

30 Gruppi coinvolti: 1. Cagliari, Pisa Danno sul DNA mitocondriale e ruolo dei ROS Danno su embrioni di pecora congelati e non. 2. LNF, LNGS Analisi della mortalità e delle mutazioni indotte dalle radiazioni ionizzanti su cellule mononucleate del sangue periferico in condizione di congelamento Valutazione della funzionalità mitocondriale in cellule mononucleate mediante citometria a flusso Valutazione delle ssb e dsb del DNA 3. LNL Inattivazione cellulare (morte mitotica o riproduttiva) Induzione di mutazioni al locus hprt Ruolo dei ROS 4. Pavia Identificazione e quantificazione del danno radicalico nei diversi componenti della struttura cellulare (membrane, nucleo, citoplasma, etc.) Identificazione del danno radicalico in funzione della dose Identificazione e caratterizzazione del danno radicalico in funzione della qualità delle radiazioni Studio degli effetti combinati dello stato solido e della bassa temperatura (crioconservazione) sulla componente radicalica del danno radiobiologico 30

31 Richieste Finanziarie 2009 U.O. M.I. M.E. Cons. Inv. Costr. App. BO Tot. CA LNGS LNL PV PI RM LNF.DTZ totale Il profilo di spesa per gli anni successivi rimane costante, a meno dell inventario (che decresce o si azzera): 2010=230 ke; 2011=210 ke 31

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