Miceti di interesse alimentare e tecniche di rilevamento

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1 Miceti di interesse alimentare e tecniche di rilevamento

2 Caratteristiche generali sono eucarioti con nucleo diploide si riproducono per mezzo di spore o conidi (riproduzione sessuata o asessuata) di solito sono immobili possono essere unicellulari o pluricellulari presentano una parete cellulare contenente chitina sono organismi eterotrofi,saprofiti, parassiti o simbionti

3 Regno dei funghi: 5 phyla Ascomycota Funghi unicellulari o filamentosi a micelio settato con riproduzione asessuata tramite conidi originati da un ampia varietàdi strutture conidiogenee riproduzione sessuata tramite ascospore prodotte all interno di aschi Basidiomycota Funghi unicellulari o filamentosi a micelio settato con riproduzione asessuata tramite conidi e riproduzione sessuata tramite basidiospore prodotte su basidi Deuteromycota Funghi unicellulari o filamentosi a micelio settato con riproduzione asessuata tramite conidi originati da un ampia varietà di strutture conidiogenee riproduzione sessuata solitamente mancante, quando riconosciuta riconducibile ad ascomiceti o basidiomiceti Mycophytophyta Zygomycota Funghi filamentosi a micelio scarsamente o per nulla settato, con ife di ampio diametro, riproduzione asessuata tramite sporangiosporeoriginate in sporangi o sporangiolie riproduzione sessuata tramite zigospore

4 Cellula fungina lievitiforme

5 Cellula fungina miceliale

6 Parete cellulare fungina

7 BLASTOGONIA COLONIA FUNGINA LIEVITOFORME

8 SVILUPPO DELLA COLONIA FUNGINA MICELIALE

9 Produzione di pseudomicelio e di micelio nei lieviti

10 IL DIMORFISMO FUNGINO Fase lievitiforme in vivo Blastomyces dermatitidis Coccidioidesimmitis C. Posadasii Histoplasma capsulatum Paracoccidioides brasiliensis Penicillium marneffei Sporothrix schenckii 37 C in vitro 25 C Fase lievitiforme stessa conformazione degli strati parietali gemmazione Fase miceliale diversa conformazione degli strati parietali crescita apicale

11 Candida albicans ECOLOGIA Cryptococcus neoformans Aspergillus fumigatus Sporothix schenckii

12 Meccanismi di patogenicità dei funghi a) Adesività (superfici mucose e cutanee, es. Candida albicans) Meccanismi non specifici Forze idrofobiche Cariche elettrostatiche Meccanismi specifici Interazione tra adesine e recettori Possibili adesine Recettori Chitina Glucani Mannani/Mannoproteine Lipidi Proteine cellule epiteliali, superfici mucose Sconosciuti cellule epiteliali cellule epiteliali albumina, collagene, fibrina, fibrinogeno, fibronectina, laminina

13 Meccanismi di patogenicità dei funghi b)produzione di tossine (alcune intereferiscono con la risposta immunitaria) Candida albicans: glicoproteine, canditossina, tossine a basso peso molecolare Aspergillus spp. gliotossina, fumigatossina, restrictocina Micotossine, Micetismo (ingestione funghi velenosi) c) Produzione di enzimi idrolitici (mediano l invasività) Proteasi (Candida albicans), Fosfolipasi, Lipasi Serinproteasi(Aspergillus spp.) Metalloproteasi, Aspartil proteasi Cheratinasi(dermatofiti) Fenolo-ossidasi(Cryptococcus neoformans)

14 Meccanismi di patogenicità dei funghi d) Strutture cellulari (antifagocitarie, immunomodulanti) Mannani(Candida albicans) α1-3 glucano(blastomycesdermatitidis) (Histoplasmacapsulatum) (Paracoccidioidesbrasiliensis) Glucuronoxilomannani(Cryptococcusneoformans)(componenti capsulari) Recettori del complemento (inibiscono l opsonizzazione) e) Pleomorfismo, Dimorfismo forme miceliali invasive

15 Condizioni predisponenti all insorgenza di micosi Malattie concomitanti Infezioni microbiche Disfunzioni endocrine Alterazioni delle difese immunitarie Fattori dietetici Dieta ricca in carboidrati Carenze vitaminiche Vatriazioni dello status fisiologico Gravidanza Prima infanzia Vechiaia Fattori meccanici Traumi e ustioni Occlusione o macerazione dei tessuti Fattori iatrogeni Trattamento con farmaci che alterano la composizione della popolazione microbica residente o le difese dell ospite nei confronti delle infezioni Interventi chirurgici, introduzione di protesi o cateteri in tessuti o nei vasi

16 Difese dell ospite nei confronti dell infezione fungina Barriere meccaniche Sostanze antimicrobiche non specifiche Fagocitosi e killing intracellulare Immunità umorale e cellulo-mediata

17 CLASSIFICAZIONE DELLE MICOSI MICOSI SUPERFICIALI Infezioni che interessano esclusivamente gli strati cornei dellacute e gli annessi cutanei con nulla o scarsissima reazione immunitaria da parte dell'ospite. MICOSI (MUCO)CUTANEE Infezioni interessanti i tessuti cheratinizzati della cute, gli annessi cutanei e le mucose con danni tessutali e significativa reazione immunitaria da parte dell'ospite. MICOSI SOTTOCUTANEE Infezioni che coinvolgono la cute e i tessuti sottocutanei dopo innesto traumatico dell'agente eziologico. Possono rimanere localizzate o diffondere per contiguità, o per via linfatica, con rilevante reazione immunitaria da parte dell'ospite. MICOSI PROFONDE Infezioni, solitamente a livello polmonare, che possono disseminare per via ematica con coinvolgimento degli organi interni e della cute (micosi disseminate o sistemiche) con massima reazione immunitaria da parte dell ospite.

18 Micetismo Causato dall ingestione di funghi velenosi (es. Amanita phalloides, veleno α-amanitina) inibizione RNApolimerasi inibizione sintesi proteica Micotossicosi Le micotossine sono metaboliti secondari di funghi che possono esercitare, a piccole concentrazioni, effetti tossici acuti o cronici quando assunti per vie naturali da animali vertebrati

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20 Lieviti di interesse alimentare: Hansemula, Pichia, Torulopsis deterioramento alimenti (vino e prodotti lattiero-caseari) Saccaromiceti sono utilizzati nella produzione di alcuni alimenti Mai osservata la produzione di sostanze tossiche

21 Muffe di interesse alimentare: La struttura miceliare è un sistema efficiente per utilizzare i nutrienti presenti negli alimenti deteriormento Macromolecole (enzimi idrolitici, metaboliti secondari) possono essere escreti nel substrato Deuteromiceti (funghi imperfetti), annoverano molte speci tossigene (Aspergillus Penicillum, Fusarium)

22 Fattori che influenzano la crescita dei funghi negli alimenti Oltre ai nutrienti esistono diversi parametri chimico-fisici che condizionano lo sviluppo dei funghi negli alimenti Un fattore è correlato allo stato biologico dell alimento Frutta fresca, verdure, cereali, frumento prima del raccolto possiedono efficaci meccanismi di difesa contro l invasione microbica che perdono al momento del raccolto

23 Aw, ph I funghi sono in grado di crescere a valori di a w piuttosto bassi Valori inferiori a ph 5 facilitano la crescita fungina

24 Temperatura Condiziona i processi di sporulazione, germinazione delle spore, sviluppo del micelio La temperatura C rappresenta il range di sviluppo, ma alcune specie fungine riescono a crescere anche a temperature più alte Le spore fungine possono sopravvivere alla pastorizzazione

25 Temperatura Molti funghi si riproducono alle temperature di refrigerazione (Fusarium, Cladosporium, Penicillum), specialmente in condizioni di umidità (frigoriferi) A. flavus e A. niger crescono a temperature medio alte e rappresentano la flora dominante di ambienti quali i tunnel di essiccamento delle paste alimentari Esiste una correlazione fra produzione di micotossine nelle granaglie e insilati, temperatura e a w L optimum della temperatura è tra 20 e 30 C L aumento della temperatura comporta un abbassamento dell a w ottimale per la produzione di aflatossine

26 Tensione di ossigeno Le muffe hanno assoluto bisogno di ossigeno Sono sensibili ad alti livelli di anidride carbonica Generalizzando: deterioramento degli alimenti dovuto a funghi filamentosi (muffe) avviene in aerobiosi, i lieviti fermentativi sono in grado di riprodursi in completa assenza di ossigeno

27 Consistenza dell alimento I lieviti causano maggiori problemi nei cibi liquidi, dove le singole cellule si disperdono facilmente I funghi filamentosi sono favoriti da substrati solidi su cui ancorarsi con pieno accesso all ossigeno

28 Substrato nutritivo e conservanti I funghi sono favoriti dalla presenza di zuccheri Acidi deboli (benzoico, sorbico, solforoso acetico, propionico) sono abbastanza efficaci sui funghi, con alcune eccezioni Penicillum roqueforti ad esempio è estremamente resistente isolamento!

29 Tecniche per la determinazione della contaminazione fungina negli ambienti di produzione e negli alimenti

30 Determinazione della contaminazione da funghi negli ambienti di produzione degli alimenti Rilevamento della flora micotica aerodispersa presente sulle superfici

31 Flora micotica AERODISPERSA Campionamento mediante diverse tecniche di: aria ambientale in uscita da impianti di filtrazione/condizionamento/movimentaz ione materiali a mezzo flusso aria

32 1. Campionamento dell aria con campionatore SAS (surface air system pbi international) Il sistena SAS campiona il volume d aria selezionato sfruttando il principio dell impatto ortogonale su piastre contenenti terreni di coltura agarizzati specifici per i miceti (Sabouraud Dextrose Agar) I limiti della tecnica risiedono nelle possibili perdite di particolato che non viene trattenuto durante l impatto

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34 CARATTERISTICHE PRINCIPALI I campionatori SAS SUPER ISO 100 e SAS SUPER ISO 180 di produzione International pbi sono campionatori per la determinazione della carica microbica presente nell aria Sono strumenti portatili funzionanti a batterie ricaricabili ad elevata autonomia: oltre litri di aria campionabili con ogni ricarica portata costante di 100 o 180 L/min possiedono 8 volumi impostabili e memorizzabili sono dotati di sistema di campionamento sequenziale per estendere il campionamento da pochi minuti a diverse ore Utilizzano piastre a contatto da 55 mm di diametro. Possibilità di utilizzare piastre a contatto diametro 84 mm e piastre Petri diametro 90 mm.

35 DUO SAS SUPER 360 ISOLATOR campionatore per tutti gli ambienti a contaminazione controllata che richiedono il campionamento di volumi elevati in brevi intervalli di tempo - formato da un singolo corpo dotato di 2 teste aspiranti separate - in grado di aspirare 360 litri/min d aria ( litri/min) - possono essere monitorati oltre 20 m³ d aria/ora in differenti cicli. Il campionatore microbiologico d aria Duo-SAS-Super 360 Isolator è stato appositamente progettato per il monitoraggio di ambienti a contaminazione controllata, dove è richiesto un elevato volume di aria aspirata in brevi periodi di tempo e dove è necessario il campionamento di differenti specie di microrganismi. Grazie alla doppia testata separata dall'unità di controllo, è possibile effettuare il monitoraggio simultaneo in due ambienti diversi.

36 2. Sistema di campionamento dell aria multiplo sequenziale Necessari quando il campionamento deve avvenire durante il periodo di produzione, con un monitoraggio continuo delle aree produttive o di controllo ove sia necessario avere più punti di monitoraggio in sequenza

37 Campionatore MD8 Il sistema MD8 campiona il volume di aria selezionato sfruttando il principio della filtrazione su membrane in fibra di vetro, in nitrocellulosa (porosità 0,45 micron) e membrane in gelatina (porosità 3 micron) Le membrane sono poi depositate in piastra con terreni specifici Si contano anche in questo caso le UFC

38 Flora fungina sulle SUPERFICI Piastre a contatto (riempite fino al bordo) Sistemi tipo slide, sempre basati sul contatto fra la superficie e un terreno nutritivo Prelievo con tampone da un area stabilita Inoculazione in una soluzione isotonica che inattiva eventuali residui di disinfettanti Mantenimento dell integrità strutturale e quantitativa dei microrganismi (fino a 12h) Semina in laboratorio per inclusione in agar Conta delle colonie

39 Determinazione della contaminazione fungina La conta delle UFC viene effettuata ad occhio nudo Per i campioni di aria il numero viene espresso per m 3 (UFCX1000: il volume di aria campionato) Per le superfici per cm 2, tenendo conto di eventuali fattori di diluizione se si utilizzano soluzioni di trasporto

40 Determinazione della contaminazione fungina negli alimenti Le tecniche di rilevazione dei miceti sono molto simili a quelle utilizzate per i batteri Tutti i campioni (cereali, arachidi, farine, spezie) sono generalmente mantenuti a 0 C per 72 ore prima dell analisi per eliminare le larve di insetti (contaminazione crociata) I campioni sono Osservati al microscopio Sottoposti a metodiche per la numerazione, isolamento ed identificazione delle muffe

41 Osservazione al microscopio Fattore di ingrandimento 25X Osservazione di corpi fruttiferi o miceli Allestimento di un vetrino a fresco per prima identificazione Se non si osservano corpi fruttiferi Semina in opportuni terreni di coltura

42 Determinazione quali-quantitativa dei miceti Semina diretta del campione in terreno povero Semina diretta del campione in terreni nutritivi Semina di diluizioni del campione in terreni nutritivi

43 Semina diretta in terreno povero Terreno Agar-Acqua Incubazione a 25 C per 5-45gg Le piastre non sono capovolte Osservazione periodica ed eventuali subcolture

44 Semina diretta in terreni nutritivi E il sistema più idoneo per valutare la contaminazione in alimenti come arachidi e grano, che prima della semina devono essere disinfettati in superficie per eliminare le spore adese e mettere in evidenza solo le ife penetrate e cresciute nel prodotto

45 Preparazione del campione Il campione di alimento (10-50g) viene immerso in una soluzione di ipoclorito di sodio (0,4%) Dopo 2 minuti il campione viene lavato con acqua sterile Si procede quindi alla semina

46 Allestimento delle piastre I grani vengono adagiati sulla superficie di piastre di Petri contenenti il terreno di coltura Le piastre opportunamente seminate vengono incubate a 25 C per 5-7 gg Si effettua quindi la conta dei grani contaminati

47 Sistema di diluizioni del campione in terreni nutritivi Alimenti solidi, semisolidi, liquidi I campioni liquidi vengono seminati previa diluizione I campioni solidi e semisolidi (gen 10 g) vengono diluiti 1:10 con apposito diluente (acqua peptonata 0,1%, ma anche soluzione salina o altro) In caso di prodotti secchi o bevande concentrate si deve utilizzare un diluente che contiene il 20% di saccarosio, perché le cellule potrebbero essere danneggiate Si procede quindi ad un omogenizzazione

48 Allestimento delle piastre Le diluizioni vengono seminate su piastre contenenti Sabouraud Dextrose Agar o Malt Extract Agar o altri terreni specifici addizionati con antibiotici (cloramfenicolo, gentamicina) a ph neutro Incubazione a 25 C per 3-5 gg Il risultato è espresso in ufc/g o ml di campione E orientativo perché legato non solo alle spore ma anche a frammenti di ife

49 Isolamento dei ceppi fungini Usando un ansa sterile si procede al prelievo di piccoli frammenti di ife o poche spore Si trapiantano in terreno Potato-Dextrose a becco di clarino Incubazione a 25 C per 5-7 gg Si procede quindi all identificazione

50 Identificazione delle specie fungine Esame delle caratteristiche morfologiche macroscopiche delle colonie e microscopiche delle fruttificazioni

51 Osservazione della colonia Dal terreno Potato-Dextrose si procede al trapianto su terreni nutritivi Dopo opportuna incubazione si osserva macroscopicamente la colonia Diametro Aspetto Margini Quantità di sporulazione Colore Eventuale presenza di essudati Odore Retro

52 Osservazione delle spore e delle fruttificazioni Allestimento di vetrini a fresco: un frammento di micelio è posto in soluzione di lattofenolo di Amann su vetrino portaoggetti e disteso con l ago Allestimento di microcolture: direttamente su vetrino portaoggetti, dopo sviluppo potrà essere osservata direttamente senza alterazione delle strutture

53 Microcolture su vetrino Una porzione di terreno PDA (1-2 mm spessore) viene posizionato su un vetrino con un ansa sterile Su questo viene posizionato l inoculo mediante un ago sterile e coperto con un coprioggetto Il vetrino è posto opportunamente sollevato in una petri sul fondo della quale è adagiato un foglio di carta assorbente bagnato La capsula chiusa è incubata a 25 C per 4 gg Osservazione al microscopio Viene prelevato il copriogetto con la vegetazione che si è sviluppata Montato su un altro vetrino e osservato

54 Saggi complementari Per alcuni miceti esistono anche saggi complementari quali: Saggi d crescita su specifici terreni Patogenicità per animali da laboratorio Saggi biochimici

55 Metaboliti tossici I funghi sono in grado di sintetizzare (verso la fine del ciclo di sviluppo) dei prodotti metabolici tossici Questi non sono necessari alla crescita fungina e sono prodotti del metabolismo secondario Vengono indicati col termine di MICOTOSSINE

56 Micotossine In seguito alla loro ingestione si manifestano manifestazioni cliniche acute e croniche, con interesse di numerosi organi vitali e modificazioni cellulari fino alla comparsa di tumori

57 Muffe tossigene La maggior parte si ritrovano nei generi: Aspergillus Fusarium Penicillum Secondo alcuni studi, il 30-40% delle muffe producono tossine in quantità più o meno dannose, anche se il potere tossinogeno varia da ceppo a ceppo Una stessa tossina può essere prodotta da funghi diversi Alcune tossine sono specifiche di specifici funghi

58 Muffe tossigene Il genere Aspergillus è quello che include il maggior numero di speci tossigene: Asp. flavus Asp. parasiticus Asp. versicolor Asp. ochraceus Asp. clavatus Il fegato e il rene sono gli organi principalmente colpiti Importanti anche le intossicazioni legate alle muffe del genere Fusarium, diffuse nel suolo e in particolare sui cereali

59 Micotossicosi I sintomi dipendono da: il tipo di micotossina; la quantità e la durata dell esposizione; L età, stato di salute, sesso dell individuo esposto; E molti effetti sinergistici che coinvolgono genetica, dieta, e interazioni con altre tossine

60 Micotossicosi La gravità della micotossicosi dipende da numerosi fattori quali Mancanza di vitamine Carenza di calorie Abuso di alcol Presenza di malattie infettive Inoltre, le micotossicosi a loro volta Aumentano la vulnerabilità nei confronti di altre malattie microbiologiche Aggravano gli effetti della malnutrizione Determinano fenomeni di interazione con altre tossine

61 Epidemiologia Il numero preciso di persone affette da micosi e micotossicosi è sconosciuto Sebbene il numero complessivo sembra inferiore a quello della popolazione affetta da infezioni batteriche, virali e parassitarie, le infezioni fungine sono comunque un serio problema di livello mondiale

62 Micosi versus micotossicosi Le micosi sono causate da patogeni opportunistici e sono soprattutto malattie dei paesi industrializzati (in collegamento con specifici trattamenti medici avanzati) Le micotossicosi sono invece più comuni nei paesi in via di sviluppo Una delle caratteristiche in comune è che nessuno dei due tipi di malattia è generalmente trasmissibile da persona a persona

63 Micosi versus micotossicosi Le micosi sono frequentemente acquisite attraverso l inalazione delle spore dai reservoir ambientali o a causa della crescita inusuale di una specie commensale normalmente presente sulla pelle o nel tratto grastrointestinale I funghi commensali diventano patogeni in presenza di farmaci antibatterici, chemoterapici, o immunosuppressori, infezione da HIV, presenza di cateteri, e altri fattori predisponenti La maggior parte delle micotossicosi deriva dal consumo di cibi contaminati Il contatto attraverso la pelle con substrati infettati da muffe e l inalazione di tossine prodotte da spore sono altre fonti importanti di esposizione

64 Terapia Ad eccezione di una terapia di supporto (ex idratazione) non esistono trattamenti per l esposizione a micotossine Pochi sistemi per il trattamento di micotossicosi in ambito veterinario Alcune evidenze che certi ceppi di Lactobacillus legano efficacemente micotossine introdotte con l almentazione Oltipraz, un farmaco inizialmente messo a punto per il trattamento della schistosomiasi, è stato testato in populazioni esposte ad ambienti contaminati con aflatossina

65 Definizioni, etimologia, e principi generali Tutte le micotossine sono prodotti naturali a basso peso molecolare prodotti durante il metabolismo secondario dai funghi filamentosi Questi metaboliti costituiscono un insieme eterogeneo raggruppato insieme solo per il fatto di causare malattia e morte nell uomo e altri vertebrati Non sorprendentemente, molte micotossine presentano tossicità sovrapponibile in invertebrati, piante, e microorganismi

66 Storia Il termine micotossina fu coniato nel 1962 durante una crisi veterinaria vicino Londra, durante la quale morirono circa tacchini. Quando questa misteriosa turkey X disease fu collegata ad arichidi contaminate con un metabolita secondario prodotto da Aspergillus flavus (aflatossina), il mondo scientifico fu spinto ad esaminare la possibilità ce altri metaboliti prodotti dalle muffe potessero essere letali In breve tempo la lista di micotossine fu estesa ad includere tossine fungine (e.x, alcuni alcaloidi), alcuni composti originariamente isolati come antibiotici (e.x., patulina), e numerosi nuovi metaboliti secondari (e.x., ochratossina A)

67 Storia Il periodo tra il 1960 e il 1975 è considerata l età d ora della micotossicologia Attulmente dalle 300 alle 400 sostanze sono riconosciute come micotossine, con circa dodici gruppi che rappresentano un potenziale rischio per la salute umana e animle

68 Altri composti tossici prodotti dai funghi Non tutti i composti tossici prodotti dai funghi sono detti micotossine Il bersaglio e la concentrazione del metabolita sono entrambi importanti Prodotti fungini che sono tossici soprattutto per i batteri vengono detti antibiotici Prodotti che sono tossici per le piante sono detti fitotossine Metaboliti a basso peso molecolare tossici solo ad alte concentrazioni (come l etanolo) non sono considerati micotossine

69 Veleni prodotti dai funghi superiori Anche i funghi superiori producono metaboliti tossici che non vengono inseriti tra le micotossine La distinzione tra micotossine e i veleni dei funghi superiori, non è basata solo sulla dimensione del fungo che produce la sostanza, ma anche sul fatto che mentre l esposizione alle micotissine è generalemente accidentale, nel secondo caso l avvelenamento avviene a causa dell alimentazione con funghi scorrettamente identificati come commestibili

70 Classificazione delle micotossine Molto complessa, per la diversa natura chimica, effetti, origini biosintetiche I medici le classificano a seconda dell organo che colpiscono: epatotossine, nefrotossine, neurotossine, immunotossine Un altra classificazione è quella generale in teratogeni, mutageni, carcinogeni, e allergeni Possono essere classificati a seconda Della struttura chimica (lattoni, cumarine ); Dell origine biosintetica (derivati degli amminoacidi ); Della malattia che causano A partire dai fungi che le producono (tossine di Aspergillus, di Penicillium.)

71 Micotossicosi Come le altre malattie tossicologiche possono essere distinte in acute o croniche Le acute generlamente hanno un rapido inizio e una risposta tossica facilmente riconoscibile Le croniche sono caratterizate da una bassa dose di esposizione ma per un lungo periodo di tempo, dando origine a cancro e altri effetti irreversibili

72 Diagnosi Per dimostrare che una malattia è una micotossicosi, è necessario mostrare una relazione dose-resposta fra la mycotossina e la malattia Ne caso della popolazione umana i dati epidemiologici sono essenziali Dati a supporto sono forniti dai sintomi riprodotti in animali modello L esposizione alla micotossine è ulteriormente determinata da monitoraggio ambientale e biologico Nel monitoraggio ambientale le micotossine vengono messe in evidenza nel cibo, aria, o altri campioni; Nel monitoraggio biologico, la presenza di residui, addotti, metaboliti è misurata direttamente nei tessuti, fluidi, e escreati

73 Distribuzione a livello mondiale In generale, l esposizione alle micotossine è più probabile nelle regioni dove i metodi di manipolazione del cibo sono scarsamente controllati e di basso standard L esposizione alle micotossine sono un problema grave dove la malnutrizione è diffusa e dove esistono poche leggi per proteggere la popolazione esposta Tuttavia, anche nei paesi industrializzati, specifiche sottopopolazioni possono essere target di esposizione alle micotossine

74 Prevenzione I metodi di controllo dell esposizione alle micotossine sono principalmente PREVENTIVI Includono pratiche di buona agricoltura (sufficiente tempo di essiccazione dei cereali dopo il raccolto) Numerosi sforzi sono diretti a prevenire la contaminazione dei cereali prima del raccolto Questo include lo sviluppo di resistenza nella pianta attraverso incroci and attraverso l inserimento di geni antifungini mediante ingegneria genetica, medante il controllo di geni regolatori importanti per la sintesi delle micotossine Nessuno di questi metodi ha ancora eradicato il problema. Le micotossine sono contaminanti naturali di molti cibi e la loro presenza è spesso inevitabile, ma può essere regolamentata

75 PRINCIPALI MICOTOSSINE

76 Aflatossine Le aflatossine vennere identificate in occasione della morte di tacchini (turkey X disease) che fu collegata con il consumo di farina di arachidi contaminata da muffe Le quattro principali aflatossine sono chiamate B1, B2, G1, and G2 in base al colore assunto agli UV (blue or green) e alla mobilità relativa in cromatografia su strato sottile L aflatossina B1 è il carcinogen naturale più potente e normalmente è la principal aflatossina prodotta dalle muffe tossigeniche Numerose altre aflatossine (e.x., P1. Q1, B2a, and G2a) sono state descritte, in particolare come prodotti della biotrasformazione dei principali metaboliti nei mammiferi

77 Aflatossina B1

78 Aflatossine Le aflatossine sono derivati delle difuranocumarine derivatives prodotte da Aspergillus flavus e Aspergillus parasiticus In particolare, Aspergillus flavus è un contaminante comune in agricoltura Le diverse specie di Aspergillus in grado di produrre aflatossine mostrano una grande differenza a livello QUALITATIVO e QUANTITATIVO nella produzione della tossina stessa

79 Aflatossine Molti substrati consentono le crescita delle muffe produttrici di aflatossine La contaminazione dei CEREALI, SEMI DA OLIO, NOCI, TABACCO, è molto comune In alcuni casi i cereali vengono contaminati prima del raccolto, soprattutto in caso di siccità Spesso il problema è la conservazione dei cereali in condizioni che favoriscono la crescita delle muffe (contaminazione dopo il raccolto) UMIDITA del substrato e UMIDITA RELATIVA dell ambiente circostante

80 Aflatossine e animali da allevamento La contaminazione da aflatossine del mangime è stata spesso legata all aumento di mortalità in animali da allevamento Il problema per l uomo sta nel fatto che prodotti derivati dal latte possono diventare fonte di aflatossine Mucche allevate con mangini contaminati da aflatossine, trasformano metabolicamente la aflatossina B1 in una forma idrossilata detta M1, che si accumula nel latte

81 Tossicità e carcinogenicità Le aflatossine sono associate sia a tossicità sia a potenziale carcinogeno nell uomo e negli animali La malattia acuta causata dal consume di aflatossina è detta aflatossicosi L aflatossicosi acuta, generalmente porta a morte L aflatossicosi cronica porta a cancro, immuno soppressione, e altre condizioni patologiche a lenta evoluzione

82 Modalità d azione Alcuni enzimi (sistema del citocromo P450) convertono l aflatossina nella forma reattiva 8,9-epossido, che lega sia il DNA che le proteine Legame in posizione N7 delle guanine Inoltre, addotti di aflatossina B1-DNA portano a trasversioni GC TA La coniugazione dell aflatossina attivata con glutaione ridotto ad opera di una glutation S-transferasi nel citosol porta all escrezione dell aflatossina Variazioni nel livello di glatation-transferasi e del sistema del citocromo P450 hanno un impatto sulla suscettibilità specie-specifica osservata nei confronti dell aflatossina

83 Aflatossicosi acuta L intossicazione acuta nell omo non è stata osservata molto frequentemente Nel 1974 un outbreak di epatite in India con 100 mortie è stata associata al consumo di mais fortemente contaminato da aflatossina Dai dati ricavati dall osservazione di questo caso è stato calcolato che la dose letale sia approssimativamente dai 10 ai 20 mg di aflatossina

84 Aflatossicosi acuta E stato anche ipotizzato che alcuni casi di grave malnutrizione infantile possano essere ricondotti ad aflatossicosi acuta Inoltre alcuni dati indicano che una forma di encefalopatia e degenerazione del pannicolo adiposo dei visceri (sindrome di Reye) in bambini e adolescenti possa essere correlata ad aflatossicosi acuta L aflatossina è comunque un potente veleno e è stata adottata come arma di bioterrorismo

85 Effetto carcinogeno I dati sull aflatossina come carcinogeno umano sono molto più convincenti che i dati a disposizione riguardo i suoi effetti nell intossicazione acuta Studi epidemiologici hanno collegato il tumore al fegato all assunzione di aflatossine attraverso la dieta L esposizione alle aflatossine è considerato un importante fattore di rischio per lo svilupoo dell epatocarcinoma primario, in particolare in pazienti positivi per HBV

86 Effetto carcinogeno Il monitoraggio della presenza di aflatossine viene effettuato analizzando la presenza di metaboliti di tali sostanze nel sangue, latte e nelle urine; inoltre possono essere evidenziati addotti al DNA e alle proteine L addotto B1-N7-guanina reppresenta il marker a livello delle urine più utilizzato, ma è rilevabile solo in seguito ad un esposizione recente alle aflatossine Numerosi studi hanno rivelato che l efficacia come carcinogeno è correlata con il numero di addotti al DNA generati in vivo

87 Effetto carcinogeno L inattivazione di p53 sembra svolgere un ruolo importante nello sviluppo dell epatocarcinoma primario Una serie di studi dimostrano che mutazioni in p53 tumor a livello del codone 249 sono associate con una trasersione da G-a-T L addotto aflatossina B1-DNA può generare una transversione GC TA La mutazione al codone 249 di p53 è il primo esempio di marker "carcinogeno-specifico" che rimane costante nei tessuti tumorali

88 La International Agency for Research on Cancer ha classificato l aflatossina B1 nei carcinogeni di gruppo I Problema grave per i paesi in via di sviluppo (incidenza epatocarcinoma volte più alta)