Indice generale. Capitolo 1 Struttura ed evoluzione delle proteine 1

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1 Indice generale Capitolo 1 Struttura ed evoluzione delle proteine STRUTTURA DEGLI AMINOACIDI E DEI PEPTIDI Le proteine sono composte da aminoacidi Agli aminoacidi sono consentite solo alcune conformazioni La conformazione più popolata si trova nella regione del foglietto β Le altre conformazioni principali sono l α-elica e il random coil I valori di pk a determinano lo stato di protonazione delle catene laterali FORZE CHE STRUTTURANO LE PROTEINE Le forze elettrostatiche possono essere notevoli I legami idrogeno si formano tramite dipoli elettrostatici Le forze di van der Waals sono individualmente deboli ma collettivamente importanti L interazione idrofobica è di origine entropica I legami idrogeno sono unidirezionali La cooperatività è una proprietà dei grandi sistemi La formazione della forcina β è cooperativa La rete di legami idrogeno è cooperativa Le proteine per funzionare necessitano di uno strato d acqua Le variazioni di entropia ed entalpia tendono a compensarsi STRUTTURA DELLE PROTEINE Nelle proteine si distinguono la struttura primaria, secondaria, terziaria e quaternaria Le strutture secondarie si compongono in motivi strutturali Le proteine di membrana sono diverse dalle proteine globulari La struttura di una proteina è (più o meno) determinata dalla sua sequenza Alcune proteine formano strutture metastabili La struttura è più conservata della sequenza L omologia strutturale si può sfruttare per identificare la funzione EVOLUZIONE DELLE PROTEINE Qual è lo scopo delle proteine? L evoluzione è uno stagnino Molte proteine si sono originate per duplicazione genica Gran parte delle proteine si origina grazie a modificazioni di geni duplicati L operato dell evoluzione lascia le sue impronte Proteine nuove possono originarsi tramite condivisione genica Solitamente l evoluzione mantiene la chimica e cambia le modalità del legame L evoluzione convergente e l evoluzione divergente sono due fenomeni difficilmente distinguibili Nuove funzioni si possono sviluppare a partire da precursori promiscui o da eventi di moonlighting L evoluzione retrograda non è comune L origine delle proteine è avvenuta in un mondo a RNA La maggior parte dell innovazione evolutiva si è verificata molto presto RIASSUNTO APPROFONDIMENTI SITI internet PROBLEMI PROBLEMI NUMERICI BIBLIOGRAFIA 57

2 INDICE GENERALE IX Capitolo 2 I domini proteici I DOMINI: LE UNITÀ FONDAMENTALi DELLA STRUTTURA PROTEICA I domini si possono definire in vari modi I domini sono solitamente associati a funzioni specifiche I domini sono i mattoni alla base delle proteine I moduli sono domini trasponibili IL RUOLO CHIAVE DEI DOMINI NELL EVOLUZIONE DELLE PROTEINE Le proteine multidominio si ottengono dal mescolamento degli esoni Le proteine multidominio hanno origine anche attraverso altri meccanismi genetici L evoluzione può procedere per salti tramite lo scambio tridimensionale di domini Lo scambio tridimensionale di domini è tuttora in corso L aumento della specificità di legame si ottiene grazie a interazioni aggiuntive tra domini Il legame intramolecolare è forte perché la concentrazione effettiva è alta Le interazioni intramolecolari portano alla formazione di una rete cooperativa di legami idrogeno Il legame intramolecolare tra dominio e peptide facilita l autoinibizione Il legame intramolecolare tra peptide e dominio promuove le variazioni evolutive Le proteine scaffold aumentano la specificità di legame Il legame intramolecolare è forte perché è meno sfavorevole entropicamente I VANTAGGI POTENZIALI DI COSTRUTTI A DOMINI MULTIPLI Il costrutto a multidominio rende più semplice l evoluzione di una nuova funzione Il costrutto a multidominio semplifica l introduzione di meccanismi di controllo e regolazione Il costrutto a multidominio rende un enzima funzionale Il costrutto a multidominio semplifica il folding, l assemblaggio e stabilizza le proteine LE PROTEINE COME ARNESI Gli arnesi hanno parti con movimento indipendente Gli arnesi hanno un design comune ma dimensioni diverse Gli arnesi hanno parti comuni con estremità variabili Alcuni arnesi sono simmetrici Alcuni arnesi hanno un utilizzo specifico RIASSUNTO APPROFONDIMENTI SITI INTERNET PROBLEMI PROBLEMI NUMERICI BIBLIOGRAFIA 96 Capitolo 3 Gli oligomeri PERCHÉ LE PROTEINE OLIGOMERIZZANO? L oligomerizzazione protegge e regola il sito attivo L oligomerizzazione migliora la funzionalità enzimatica L oligomerizzazione produce dimeri simmetrici Errori di codifica, efficienza e porzioni linker non sono ragioni convincenti ALLOSTERIA La maggior parte degli enzimi non è di tipo allosterico L emoglobina rappresenta il classico caso di regolazione allosterica L affinità per l ossigeno nell emoglobina è finemente regolata da altri effettori Esistono due modelli principali per descrivere l allosteria La glicogeno fosforilasi fornisce un secondo buon esempio di allosteria LEGAME COOPERATIVO DI DIMERI AL DNA La cooperatività può essere compresa tramite la termodinamica Il legame sequenza-specifico al DNA costituisce un certo problema Il repressore trp riconosce il DNA chiudendosi a cerniera CAP riconosce il DNA ruotando attorno all interfaccia del dimero 116

3 X indice generale Il riconoscimento del DNA grazie a una struttura simmetrica detta leucine zipper Il riconoscimento del DNA da parte di una struttura leucine zipper eterodimerica Max e Myc formano uno zipper eterodimerico con partner alternativi Il riconoscimento del DNA da parte di un dimero tandem ISOENZIMI RIASSUNTO APPROFONDIMENTI SITI INTERNET PROBLEMI PROBLEMI NUMERICI BIBLIOGRAFIA 126 Capitolo 4 Le interazioni tra proteine in vivo FATTORI CHE INFLUENZANO LE VELOCITÀ DI COLLISIONE Su piccola scala i processi casuali hanno effetti molto significativi La diffusione avviene casualmente La velocità di collisione è limitata da fattori geometrici Le velocità di collisione possono aumentare sfruttando attrazioni elettrostatiche Le velocità di collisione vengono incrementate anche dalla guida elettrostatica Il legame tra proteine avviene tramite un complesso di interazione La repulsione elettrostatica è importante anche per limitare le interazioni L affollamento macromolecolare favorisce l associazione delle proteine Proteine più grandi diffondono più lentamente COME RIESCONO LE PROTEINE A TROVARE PIÙ RAPIDAMENTE IL LORO PARTNER La processività diminuisce la velocità di rilascio da substrati polimerici La ricerca è più veloce in due dimensioni La ricerca è ancora un po più veloce lungo una dimensione La ricerca è più rapida in piccoli compartimenti Le estremità adesive sono utili per la ricerca a corto raggio Le sequenze ricche in prolina possono costituire buone estremità adesive Le interazioni delle estremità adesive hanno velocità di aggancio e rilascio rapide Le estremità adesive interagiscono rapidamente perché si chiudono a cerniera piuttosto che a lucchetto PROTEINE DESTRUTTURATE ALLO STATO NATIVO Le proteine destrutturate allo stato nativo sono comuni Le proteine destrutturate allo stato nativo permettono un legame specifico con aggancio veloce Le proteine destrutturate allo stato nativo offrono legami specifici senza necessità di un legame forte Le proteine destrutturate allo stato nativo possono fornire ulteriori benefici MODIFICAZIONI POST-TRADUZIONALI DI PROTEINE Le modificazioni covalenti alterano la funzione della proteina Fosforilazione Metilazione e acetilazione Glicosilazione FOLDING E MISFOLDING DI PROTEINE Il folding proteico è spesso un processo rapido e termodinamicamente controllato Tutte le proteine hanno una durata di vita limitata, specialmente le proteine denaturate L amiloide è una conseguenza della non corretta strutturazione di proteine RIASSUNTO APPROFONDIMENTI SITI internet PROBLEMI PROBLEMI NUMERICI BIBLIOGRAFIA 175

4 INDICE GENERALE XI Capitolo 5 Come funzionano gli enzimi Gli enzimi abbassano l energia dello stato di transizione Cos è lo stato di transizione? Gli enzimi abbassano le barriere di entropia e di entalpia nello stato di transizione Gli anticorpi catalitici dimostrano il ruolo del contributo entropico Catalisi chimica Le reazioni chimiche implicano un movimento di elettroni Un buon gruppo uscente è importante La catalisi da acido generico o base generica è comune Anche la catalisi elettrofila è comune La termolisina utilizza tutti questi meccanismi La catalisi nucleofilica implica un cambiamento nel meccanismo Gli enzimi usano spesso cofattori e coenzimi Gli enzimi controllano le molecole d acqua nei loro siti attivi Gli enzimi riconoscono lo stato di transizione, non il substrato I modelli chiave e serratura e adattamento indotto Un enzima non dovrebbe legarsi troppo al suo substrato Il legame e la velocità catalitica sono strettamente collegati Analoghi dello stato di transizione sono dei buoni inibitori degli enzimi Triosofosfato isomerasi La triosofosfato isomerasi utilizza diversi meccanismi catalitici La triosofosfato isomerasi è un enzima evolutivamente perfetto Riassunto Approfondimenti Problemi Problemi numerici bibliografia 213 Capitolo 6 Flessibilità e dinamica proteica SCALE DI TEMPO E DI ESTENSIONE DEI MOTI I moti rapidi sono locali e non correlati I moti locali producono disordine globale I moti su scala maggiore sono maggiormente correlati e quindi più lenti I moti più lenti sono proteina-specifici a differenza dei moti rapidi I moti correlati possono coinvolgere parecchi legami idrogeno SELEZIONE CONFORMAZIONALE Le proteine popolano un profilo conformazionale La selezione conformazionale è un modello migliore dell adattamento indotto La selezione conformazionale e l adattamento indotto sono due estremi di un continuum Gli enzimi hanno una piccola popolazione in conformazione attivata MOTI FUNZIONALI Gli enzimi non catalizzano lo spostamento lungo la coordinata di reazione La motilità segmentata è essenziale per il legame e la catalisi Le molecole d acqua sepolte nel cuore della proteina sono importanti per i moti interni La dinamica interna delle proteine può produrre allosteria RIASSUNTO APPROFONDIMENTI SITI internet PROBLEMI PROBLEMI NUMERICI BIBLIOGRAFIA 240 Capitolo 7 Come le proteine spostano i loro ligandi COME FUNZIONANO I MOTORI PROTEICI La maggior parte dei movimenti intracellulari avviene mediante diffusione casuale 243

5 XII indice generale Il movimento unidirezionale richiede un dente d arresto La Ras GTPasi è l interruttore archetipico MOTORI, POMPE E TRASPORTATORI La miosina è il motore lineare dei muscoli La miosina funziona accoppiando il legame con l actina alla rotazione della testa La dineina si muove verso l estremità dei microtubuli La chinesina si muove verso l estremità + dei microtubuli L ATP sintasi è un motore a rotazione L ATP sintasi collega il motore rotazionale a una pompa a protoni I flagelli batterici sono imparentati con l ATP sintasi Un interruttore simmetrico è alla base di molte pompe di membrana e di trasportatori La rodopsina, una pompa protonica attivata dalla luce, è un recettore a sette eliche transmembrana accoppiato a una proteina G IL MOVIMENTO LUNGO LE FIBRE DI ACTINA E TUBULINA Le fibre di actina e tubulina si assemblano e disassemblano in continuazione Le cellule regolano rigorosamente la crescita delle fibre Come si muovono le cellule Le vescicole vengono trasportate lungo i microtubuli Le cellule grosse necessitano più trasporto direzionale intracellulare La mitosi richiede importanti movimenti intracellulari TRASPORTO NUCLEARE TRASPORTO NELLE MEMBRANE E ATTRAVERSO ESSE Il trasporto in membrana richiede una sequenza segnale Il canale all interno della membrana del RE è Sec Il meccanismo di trasporto all interno dei mitocondri e dei cloroplasti è simile Il trasporto richiede energia RIASSUNTO APPROFONDIMENTI SITI internet PROBLEMI PROBLEMI NUMERICI BIBLIOGRAFIA 283 Capitolo 8 Come le proteine trasmettono i segnali UNA PANORAMICA DEI PROBLEMI E DELLE SOLUZIONI I pathway di trasduzione del segnale devono far fronte a numerosi problemi La barriera della membrana può essere attraversata da segnali lipofilici La barriera della membrana può essere superata tramite dimerizzazione del recettore La barriera della membrana può essere superata dalla rotazione di un elica La barriera della membrana può essere attraversata aprendo un canale I pathway di trasduzione usano speciali moduli proteici I pathway di trasduzione utilizzano questi moduli per acquisire specificità Per acquisire specificità, i pathway di trasduzione sfruttano la colocalizzazione SISTEMI RECETTORIALI CHINASICI DIMERICI Il sistema Jak/Stat è un pathway semplice La dimerizzazione dei recettori si presenta sotto diverse forme Ras è il bersaglio immediato del sistema dei recettori tirosina chinasici (RTK) Ras attiva la chinasi Raf Il pathway a valle di Raf è una cascata chinasica La colocalizzazione aggiunge un ulteriore controllo L autoinibizione fornisce un controllo aggiuntivo Il sistema di trasduzione batterico a due componenti include un istidina chinasi Una prospettiva evolutiva fornisce una spiegazione unificante 311

6 INDICE GENERALE XIII Spegnere il segnale TRASDUZIONE DEI RECETTORI ACCOPPIATI ALLA PROTEINA G CANALI IONICI TRASDUZIONE MEDIANTE DEGRADAZIONE DI UNA PROTEINA REGOLATORIA Il recettore Notch attiva direttamente la trascrizione genica Hedgehog impedisce la proteolisi di un segnale intracellulare RIASSUNTO APPROFONDIMENTI SITI internet PROBLEMI PROBLEMI NUMERICI BIBLIOGRAFIA 321 Capitolo 9 Complessi proteici: macchine molecolari INTERATTOMA CELLULARE Gli interattomi possiedono strutture simili Il quadro è ancora lontano dall essere completamente chiaro I complessi di interazione hanno strutture definite ma transienti Gli interattomi costituiscono macchine molecolari ESOSOMA COMPLESSO DELL RNA POLIMERASI II La pol II si assembla in modo sequenziale È nota la struttura del complesso di pre-inizio ottenuta tramite microscopia elettronica Il dominio C-terminale è un componente chiave nella fase di allungamento CONCETTO DI METABOLONE I metaboloni sono controversi La colocalizzazione fornisce un evidenza dell esistenza dei metaboloni L incanalamento degli intermedi fornisce una prova dell esistenza dei metaboloni I metodi high-throughput (altamente intensivi) forniscono un evidenza dell esistenza dei metaboloni Abbiamo una ragionevole evidenza dell esistenza del metabolone glicolitico RIASSUNTO APPROFONDIMENTI SITI internet PROBLEMI PROBLEMI NUMERICI BIBLIOGRAFIA 345 Capitolo 10 Complessi multienzimatici INCANALAMENTO DEI SUBSTRATI La triptofano sintasi fornisce il miglior esempio di incanalamento di substrati La maggior parte degli altri esempi di incanalamento di substrati coinvolge intermedi tossici REAZIONI CICLICHE Le reazioni cicliche richiedono coordinazione La PDH ha una struttura complessa di grandi dimensioni La PDH mostra accoppiamento dei siti attivi L acido grasso sintasi richiede numerose ripetizioni di reazioni cicliche Le strutture di FAS contengono una grande cavità in cui si svolgono le reazioni cicliche La β-ossidazione è approssimativamente l inverso della sintesi degli acidi grassi COMPLESSI ENZIMATICI CHE SONO QUASI MEC La polichetide sintasi di tipo I è chimicamente simile a FAS ma non è MEC Alcune polichetide sintasi sono vere MEC La biosintesi di peptidi non ribosomiali ricorda la polichetide sintasi La sintesi di aminoacidi aromatici rappresenta un MEC scadente I complessi integrali di membrana non sono di tipo MEC POSSIBILI VANTAGGI DEI COMPLESSI MULTIENZIMATICI Ciclizzazione dei substrati Incanalamento dei substrati Aumento dalla velocità delle reazioni Tempo di risposta più rapido 373

7 XIV indice generale Accoppiamento dei siti attivi Aumento della portata del solvente Conclusioni RIASSUNTO APPROFONDIMENTI SITI internet PROBLEMI PROBLEMI NUMERICI BIBLIOGRAFIA 375 Capitolo 11 Tecniche per lo studio delle proteine ESPRESSIONE E PURIFICAZIONE METODI SPETTROSCOPICI Introduzione ai metodi spettroscopici L assorbanza UV/vis Dicroismo circolare Fluorescenza Metodi a singola molecola Misure idrodinamiche NMR Spin nucleare e magnetizzazione Lo spostamento chimico (chemical shift) L accoppiamento dipolare L accoppiamento J Spettri bidimensionali, tridimensionali e quadridimensionali Un esempio pratico: un esperimento di coerenza quantica singola eteronucleare Assegnazione degli spettri NMR Mappatura del chemical shift Rilassamento Risoluzione della struttura di una proteina a partire da dati di NMR DIFFRAZIONE Microscopia e limite di diffrazione Diffrazione di raggi X Il problema della fase nella diffrazione di raggi X Struttura, densità elettronica e risoluzione Misure di qualità: fattore R e fattore B Il solvente e altre molecole nelle strutture cristallografiche Gli aspetti tecnici della diffrazione di raggi X Strutture di proteine di membrana Diffrazione di fibre Diffrazione di neutroni Diffrazione elettronica MICROSCOPIA Crio-microscopia elettronica Microscopia a forza atomica METODI PER STUDIARE LE INTERAZIONI TRA PROTEINE Risonanza plasmonica di superficie Calorimetria per titolazione isotermica Il grafico di Scatchard: un insegnamento SPETTROMETRIA DI MASSA METODI HIGH-THROUGHPUT Analisi proteomiche Interazioni proteina-proteina: saggio del doppio ibrido in lievito Interazioni proteina-proteina: marcatura TAP METODI COMPUTAZIONALI Bioinformatica Simulazioni di dinamica molecolare Biologia dei sistemi RIASSUNTO APPROFONDIMENTI PROBLEMI PROBLEMI NUMERICI BIBLIOGRAFIA 433 Glossario 435 Indice analitico 445