Chaperon molecolari e ripiegamento delle proteine

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1 UNIVERSITA DEGLI STUDI DI CAGLIARI Facoltà di Scienze Matematiche, Fisiche e Naturali Dipartimento di Scienze Applicate ai Biosistemi Biochimica e Biologia Molecolare Chaperon molecolari e ripiegamento delle proteine Prof Giovanni Floris 1

2 Il ripiegamento corretto è indispensabile per il funzionamento delle proteine La biosintesi proteica rappresenta l ultima tappa del percorso molecolare seguito dall informazione genetica che procede dal DNA, al RNA, alle proteine. In particolare, ogni gene contenuto all interno del DNA funge da stampo per la sintesi di una molecola di RNA messaggero, che tradotto, darà luogo alla formazione di un polipeptide che si presenta nella sua conformazione primaria, rappresentata semplicemente dalla catena amminoacidica che costituisce il polipeptide stesso. Il prodotto finale della biosintesi proteica non è una proteina perfettamente funzionante, infatti, per essere definita tale, deve anzitutto ripiegarsi, o per usare un inglesismo, deve andare incontro al fenomeno del folding (ripiegamento). Successivamente, in base al tipo di funzione che dovrà svolgere, la proteina, potrà andare incontro ad ulteriori tipi di modificazioni post-traduzionali, quali ad esempio: Glicosilazione, Inserimento di gruppi prostetici, Modificazione chimica d alcuni residui amminoacidici, ecc... Tutta l informazione di cui un polipeptide necessita per adottare la struttura nativa corretta, è contenuta nella propria sequenza amminoacidica. 2

3 È stato possibile acquisire tale nozione grazie ad esperimenti su una ribonucleasi purificata dal pancreas bovino, condotti dal biochimico Christian Anfisen. La ribonucleasi è una piccola proteina di 124 amminoacidi che possiede una struttura terziaria costituita prevalentemente da foglietti β, e poche α-eliche, contenente quattro ponti disolfuro. Il ruolo di tale proteina è quello di catalizzare l idrolisi delle molecole di RNA a livello dei legami fosfodiestere. Pertanto la sua attività si misura in base alla capacità di idrolizzare le molecole di RNA. Christian Anfisen trattò la ribonucleasi con urea, (che destabilizza i legami idrogeno), e con mercaptoetanolo, (che riduce selettivamente i legami disolfuro), in maniera tale da far sì che la proteina perdesse la sua struttura terziaria e secondaria, e tornasse alla struttura primaria. 3

4 A questo punto, misurando l attività della ribonucleasi, egli poté osservare che questa diminuiva con l aumentare della concentrazione d urea e mercaptoetanolo utilizzati ed inoltre osservò un aumento della viscosità della soluzione proteica in esame. Rimuovendo l urea ed il mercaptoetanolo, tramite dialisi, al contrario, l attività enzimatica ricompariva e la viscosità si riduceva gradualmente fino a scomparire del tutto. Ciò stava ad indicare che l acquisizione della struttura tridimensionale era indispensabile alla proteina per il suo corretto funzionamento, e soprattutto, (ed in questo consisteva l innovazione della scoperta d Anfisen), la proteina denaturata (e quindi nella sua conformazione primaria), tornava spontaneamente alla propria conformazione secondaria e terziaria, dopo aver eliminato i denaturanti. In seguito furono condotti, gli stessi esperimenti, da altri biochimici ma stavolta su una ribonucleasi sintetizzata artificialmente. Questi confermarono gli stessi risultati ed eliminarono il dubbio che la rinaturazione potesse essere dovuta ad un ipotetico contaminante, presente nella soluzione proteica, che per un qualche motivo fosse sfuggito alla purificazione effettuata da Anfisen. Questi ultimi esperimenti hanno rimosso dalla mente dei biochimici gli ultimi dubbi sulla spontaneità del ripiegamento di quest enzima. In seguito, studi più dettagliati sui processi spontanei di rinaturazione, diedero lo spunto per affermare che durante il ripiegamento spontaneo il 4

5 polipeptide passa attraverso due stadi principali prima di raggiungere la sua struttura tridimensionale nativa. Questi stadi sono: 1) la formazione dei motivi strutturali secondari, (α eliche e foglietti β). 2) la formazione della struttura terziaria. Per quanto concerne la formazione delle α eliche e dei foglietti β, essa si realizza grazie al fatto che gli amminoacidi idrofobici, presenti nella struttura primaria delle proteine, abbiano la tendenza naturale a rifuggire l H2O. Essi tendono quindi ad aggregarsi gli uni con gli altri, all interno di nuclei idrofobici denominati core, determinando la formazione delle strutture secondarie ed il collasso della proteina in un organizzazione compatta. Successivamente i motivi strutturali secondari (α eliche e foglietti β), interagiscono tra loro in maniera tale da originare la struttura terziaria, la quale si formerà gradualmente passando attraverso una serie di conformazioni intermedie. 5

6 Per anni si è assunto che in tutte le proteine denaturate in vitro, fosse insita la capacità di ripiegarsi correttamente, una volta eliminato il denaturante. Si è poi visto che, soltanto le proteine più piccole e con strutture poco complesse possiedono questa capacità. Esistono, infatti, due fattori che sembrano impedire il corretto ripiegamento di proteine più grandi, e sono: 1) la tendenza a formare aggregati insolubili 2) la tendenza ad intraprendere percorsi secondari che portano ad un ripiegamento scorretto. Per quanto riguarda la tendenza a formare aggregati insolubili, durante il ripiegamento, nel tentativo di proteggere i loro residui idrofobici dall acqua, due o più polipeptidi diversi possono aggregarsi tra loro formando complessi insolubili e pertanto non funzionanti. Per quanto riguarda la tendenza ad assumere un ripiegamento scorretto, questa può portare a proteine che essendo mal ripiegate sono instabili e non funzionanti o proteine mal ripiegate stabili anche se ovviamente non funzionanti. In vivo il ripiegamento delle proteine intracellulari è molto rapido. Le cellule d Escherichia coli, ad esempio, sintetizzano una molecola proteica di 100 amminoacidi, in circa 5 secondi, alla temperatura di 37 C. Di certo quindi non si può trattare di un fenomeno casuale dettato dalla semplice esplorazione da parte della proteina, di tutte le possibili conformazioni fino a raggiungere quella corretta. Ciò è stato confermato da un semplice calcolo effettuato dal chimico Cyrus Levithal. In base ai suoi calcoli si e 6

7 potuto stabilire che l esplorazione casuale di tutte le possibili conformazioni, da parte di una proteina, fino a raggiungere quella nativa, comporterebbe un dispendio di tempo enorme. Per una proteina di 100 amminoacidi il tempo stimato sarebbe circa 20 miliardi d anni, molto più che l età dell universo. Tutto ciò rappresenta ovviamente una conferma che il ripiegamento di una proteina non può avvenire in maniera casuale. Funzione dei chaperon molecolari Oggi si sa, che il folding corretto di una proteina, oltre che dalla sua composizione amminoacidica, è determinato dall aiuto d altre proteine, note come: chaperon molecolari o proteine da stress o ancora Heat Shock Proteins (HSP). I chaperon molecolari furono in origine descritti come proteine da shock termico; poiché si osservò che nelle cellule di Drosofila, per esposizione alle alte temperature, la concentrazione di una particolare proteina di Da di peso molecolare, aumentava enormemente, tale proteina fu indicata come Hsp 70. Si era inoltre notato che esponendo le cellule a temperature di 35/37 C, si rilevava un calo nella sintesi delle altre proteine della cellula, e i dispositivi deputati alla sintesi proteica lavoravano a ritmi serrati per la sintesi delle Hsp 70, il cui ruolo era quello di ripristinare la struttura tridimensionale di proteine che in seguito allo shock termico erano andate incontro a denaturazione. Addirittura osservando i cromosomi delle celle di drosofila dopo lo shock termico, è possibile osservare in un certo punto del cromosoma, un rigonfiamento dovuto all aumento, al suo interno, della sintesi del RNA messaggero codificante per le Hsp 70. 7

8 In realtà le Hsp 70 appartengono ad una sottoclasse di chaperonine che fanno capo ad una classe più vasta di proteine prodotte dalla cellula, non solo, in risposta all aumento della temperatura, ma a svariati stimoli o agenti tossici quali: FATTORI AMBIENTALI: shock termico, metalli pesanti, agenti chemioterapici STATI PATOLOGICI: infezioni virali, infiammazioni, febbre, neoplasie. FATTORI CELLULARI NORMALI: ciclo di divisione cellulare, fattori di crescita Tra i vari chaperon molecolari esiste una forte omologia di sequenza, com' è emerso dal confronto della sequenza amminoacidica di varie proteine da stress. Esse possiedono all estremità N-terminale una sequenza di circa 450 Aa detta dominio ATPasico, ed una sequenza di circa 200 Aa all estremità C-terminale detta dominio di riconoscimento del substrato. Dominio ATPasico Dominio di riconoscimento del substrato 450 Aa 200 Aa Tramite gli amminoacidi che formano il dominio di riconoscimento, i chaperon molecolari riconosco e legano le proteine da assistere, mentre tramite il dominio ATPasico riconoscono e legano l ATP da utilizzare come fonte d'energia per compiere la loro azione ausiliaria nel ripiegamento corretto delle proteine mal ripiegate o denaturate. E chiaro, che le proteine da stress devono essersi conservate lungo tutto il corso dell evoluzione e probabilmente hanno svolto una funzione analoga ed importante in tutti gli organismi. 8

9 Dal raffronto dei chaperon molecolari appartenenti a tre differenti classi di organismi: batteri, archea, ed eucarioti, si può infatti osservare una sorprendente omologia che accomuna tali proteine. 9

10 Funzione generale dei chaperon molecolari I chaperon molecolari svolgono la loro azione legandosi a residui idrofobici esposti della proteina target. La loro azione, in questo modo, è duplice: 1. legandosi ai residui idrofobici, impediscono che questi possano interagire con altri residui idrofobici di proteine vicine nel tentativo di proteggersi dal contatto con l acqua, e quindi impediscono la formazione degli aggregati insolubili. 2. impediscono che i residui idrofobici della stessa proteina si aggreghino prematuramente tra loro originando una conformazione errata. Esistono due tipologie di chaperon molecolari. Quelle che si legano alla catena polipeptidica non appena essa protruda l estremità Nterminale dal ribosoma. Esse mantengono la proteina in una conformazione aperta, fino a che non sia stata completamente sintetizzata, in modo da impedire la formazione di una struttura errata. Quelle che si legano a proteine non ancora ripiegate,o a proteine che abbiano perso la loro conformazione nativa in seguito ad un agente denaturante, o per aver imboccato una via secondaria durante il ripiegamento. 10

11 Appartengono alla prima tipologia, chaperon di piccole dimensioni, 200 KDa che sono indicati normalmente come chaperoni. Appartengono invece alla seconda tipologia, chaperon di grandi dimensioni, 8000 KDa, che sono comunemente indicati come chaperonine. Chaperon molecolari in Escherichia Coli Come paradigma per la comprensione del meccanismo d azione dei chaperoni, prenderemo in esame le DnaK. Per quanto concerne, invece il meccanismo d azione delle chaperonine esamineremo, il funzionamento del complesso proteico GroEL/GroES. In entrambi i casi si tratta di proteine procariotiche anche se negli eucarioti è stata riscontrata la presenza di proteine omologhe, che vengono indicate rispettivamente come Hsp70 (quella omologa a DnaK), e Hsp60/Hsp10 (complesso omologo a GroEL/GroES) DnaK Quando si avvia il processo di traduzione, DnaK, che si trova localizzata nei pressi dei ribosomi in attività, riconosce una sequenza di amminoacidi idrofobici appartenenti al peptide nascente, e con essi stabilisce dei contatti. In realtà, la proteina DnaK si lega alla proteina nascente, grazie all intervento di una molecola di DnaJ (una piccola proteina che assiste DnaK nel legame con il polipeptide) ed ad una molecola di ATP, (che si legherà a sua volta in prossimità del dominio 11

12 ATPasico di DnaK). DnaJ presenta un dominio N-terminale di 70 amminoacidi in grado di interagire efficacemente con i residui N-terminali distesi dei polipeptidi nascenti, ricchi in residui idrofobici. Una volta legata al polipeptide nascente, DnaJ subisce una modificazione conformazionale, in seguito alla quale esporrà un sito di legame specifico per DnaK, in questo modo DnaJ segnala la presenza di proteine non ancora ripiegate a DnaK. Dopo che il complesso DnaJ-DnaK si è formato, entra in gioco l ATP che si legherà in prossimità del dominio ATPasico di DnaK. Avvenuta l idrolisi dell ATP, si avrà la liberazione di un fosfato inorganico e l allontanamento della molecola di DnaJ. Il complesso DnaK-ADP rimarrà legato al polipeptide nascente fino a che la proteina non sarà completamente sintetizzata e pronta al ripiegamento. A questo punto interviene un altro chaperon molecolare presente nei procarioti: GrpE, che grazie all idrolisi di un altra molecola di ATP, rende possibile il distacco del complesso DnaK/ADP dalla proteina che a questo punto sarà in grado di ripiegarsi autonomamente. 12

13 È presumibile che questo tipo d interazione, sia particolarmente importante per quelle proteine il cui terminale carbossilico è necessario per il corretto ripiegamento dell estremità N-terminale. In questo caso, infatti, l attacco delle chaperonine stabilizza la porzione N-terminale fino a che la C-terminale non sia completamente sintetizzata e a quel punto la proteina sarà in grado di ripiegarsi autonomamente. Complesso GroEL/GroES GroEL è costituita da 14 subunità che si riuniscono in maniera tale da formare due gruppi, di 7 subunità ciascuno. Questi due gruppi sono sovrapposi e formano due alloggiamenti uno superiore ed uno inferiore. 13

14 Ogni subunità è costituita nel suo insieme da tre domini. Un dominio apicale, nel quale è presente il sito di riconoscimento del substrato, un dominio intermedio, ed infine un dominio equatoriale, nel quale è presente un sito ATPasico. GroES è invece costituita da 7 subunità unite assieme a formare nua sorta di unico disco. 14

15 Il meccanismo d azione del complesso GroEL/GroES, è paragonabile a quello di una gabbia che imprigiona la proteina non ancora ripiegata e che si apre liberando le proteine solo a ripiegamento avvenuto correttamente. Per questa ragione si dice che GroEL/GroES funga da gabbia: LA GABBIA DI ANFISEN In condizioni di riposo la superficie della cavità interna di tali alloggiamenti espone verso il centro del canale: residui amminoacidici idrofobici (quelli che nella figura sottostante sono rappresentati in blu elettrico). La proteina non ripiegata e che pertanto presenta i suoi amminoacidi idrofobici non ancora racchiusi all interno della sua struttura, potrà allora interagire con gli amminoacidi idrofobici dell alloggiamento superiore di GroEL. Una volta che il polipeptide entra nella cavità superiore, intervengono 7 molecole di ATP che si legano in prossimità dei domini ATPasici di ciascuna delle 7 subunità costituenti l alloggiamento superiore. 15

16 Assieme all ATP, entra in gioco anche GroES che si dispone al di sopra dell alloggiamento in cui è contenuta la proteina, come fosse un tappo.la proteina a questo punto è proprio in gabbia!!! L idrolisi dell ATP a ADP da parte di ciascuna delle 7 sub unità fa sì che in esse si verifichi una modificazione conformazionale tale che, le subunità non esporranno più, verso il centro della cavità, i loro amminoacidi idrofobici, bensì i loro amminoacidi idrofilici (come si vede dalla figura, infatti, quei cerchietti blu elettrico che rappresentavano i domini idrofobici nella figura precedente ora non ci sono più e sono rimasti soltanto nella cavità inferiore).in virtù di tale modificazione conformazionale, la proteina non ancora ripiegata non trovando più gli amminoacidi idrofobici con cui interagire, si ripiegherà su se stessa, in modo che i suoi amminoacidi idrofilici vengano a trovarsi all esterno, mentre quelli idrofobici si riuniscano a formare il nucleo idrofobico interno della proteina, proprio come deve essere in una corretta struttura tridimensionale proteica. A questo punto intervengono altre 7 molecole di ATP che si legano, stavolta, in prossimità dei siti ATPasici delle 7 subunità costituenti l alloggiamento inferiore; in questo modo saranno allontanati sia GroES (aprendo la gabbia) sia l ADP (derivante dall idrolisi dell ATP che si era precedentemente legato alle sub unità superiori). A questo punto, tali subunità esporranno nuovamente verso la cavità interna dell alloggiamento, gli Aa idrofobici (come si vede dalla figura in cui i cerchietti blu sono tornati). 16

17 ADP ADP ATP ATP La proteina correttamente ripiegata può così uscire dalla trappola in cui era imprigionata, infatti, essa non può più interagire con la superficie della cavità che è tornata idrofobica. Se invece il polipeptide non si fosse ancora ripiegato correttamente ed esponesse ancora i suoi amminoacidi idrofobici verso l esterno, allora potrebbe interagire nuovamente con la superficie interna della cavità ritornata idrofobica, e si ripeterà un nuovo ciclo di idrolisi dell ATP fino a che la proteina non si sarà ripiegata correttamente. Il ciclo: LEGAME IDROLISI - RILASCIO del polipeptide dura 15 secondi, quest intervallo è, infatti, sufficiente per il corretto ripiegamento di svariate proteine 17

18 Chaperon molecolari eucariotici Negli eucarioti il ripiegamento proteico si serve meno del complesso Hsp60/Hsp10 (omologo a GroEL/GroES); e dipende maggiormente dall azione delle proteine Hsp70 (omologhe a DnaK). Ciò potrebbe essere dovuto a delle differenze tra le proteine batteriche e le proteine eucariotiche. La maggior parte delle proteine batteriche, infatti, è relativamente piccola e tutte le unità strutturali secondarie interagiscono per formare una singola unità strutturale terziaria, le proteine di questo tipo devono essere ripiegate dopo il completamento della sintesi in quanto l intera proteina fa parte di una singola unità strutturale terziaria. Le proteine eucariotiche invece, tendono ad essere più grandi e comprendono due o più unità strutturali terziarie, ciascuna delle quali può ripiegarsi prima che le altre subunità siano state sintetizzate; il ripiegamento pertanto potrebbe essere cotraduzionale e le proteine in grado di mediare questo tipo di ripiegamento sono prevalentemente le Hsp70. Quindi, mentre nei batteri è largamente usato il complesso GroEL/GroES, adatto al ripiegamento postraduzionale, negli eucarioti, invece, è preferita l Hsp70 capace di mediare il ripiegamento cotraduzionale. In questo contesto verranno esaminati i chaperon molecolari eucariotici che intervengono nel trasporto delle proteine non ancora ripiegate, verso i mitocondri. I polipeptidi destinati ai mitocondri presentano nella loro estremità N-terminale, una sequenza amminoacidica ricca in Serina, Treonina e residui basici, questa regione, nota come sequenza segnale, anche se con differenti amminoacidi costituenti, è presente in quasi tutte le proteine e serve per indirizzarle verso la loro giusta meta. I polipeptidi che devono essere trasportati all interno del mitocondrio, sono riconosciuti da particolari chaperoni quali l Hsp70, che si lega in prossimità della loro sequenza N-terminale. Entrambe stabilizzano la conformazione non ripiegata delle proteine che devono essere trasportate all interno del mitocondrio in modo che queste non assumano conformazioni errate o si aggreghino con altre proteine prima di trovarsi all interno dell organulo citoplasmatico. Una volta avvenuto il legame, i polipeptidi destinati ai mitocondri vengono ceduti ad una proteina di membrana chiamata 18

19 TOM, che funziona da recettore mitocondriale. Da TOM, i polipeptidi passano ad un altra proteina TOM, che forma un complesso transmembrana con TIM. Il complesso TOM-TIM, funziona da canale attraverso la membrana, quindi, il polipeptide, viene diretto verso la matrice mitocondriale. La traslocazione è consentita dall interazione con il chaperone mhsp70 che idrolizza una molecola di ATP. Una volta all interno della matrice mitocondriale, l estremità N-terminale o sequenza segnale (grazie alla quale era stato possibile il riconoscimento del polipeptide da parte delle chaperonine che dovevano indirizzarlo al mitocondrio), viene attaccata da specifiche proteasi che ne catalizzano la scissione. A questo punto il ripiegamento delle proteine mitocondriali viene facilitato dalle diverse chaperonine mitocondriali Hsp10, Hsp60 ed Hsp70. Il trasporto dei polipeptidi non ancora ripiegati all interno dei cloroplasti segue un meccanismo simile; tuttavia quelle proteine che devono essere indirizzate verso i tilacoidi manifestano una interessante variazione. La porzione ammino terminale che li dirige verso la meta è bipartita. Infatti, una volta che queste proteine grazie all azione dei chaperon molecolari abbiano attraversato la membrana del cloroplasto, il peptide segnale subisce un primo taglio da parte di proteasi presenti in 19

20 questa regione dell organulo. Qui la proteina non subisce ancora nessun processo di folding, ma anzi viene traslocata attraverso la membrana tilacoidale grazie al fatto che una parte del peptide segnale non ancora rimosso venga riconosciuta da altri chaperon. Una volta all interno del tilacoide anche questa porzione verrà eliminata e solo a questo punto potrà avvenire il corretto ripiegamento proteico grazie all ausilio di specifici chaperon molecolari. Sistema di degradazione delle proteine Le proteine che nonostante l intervento dei chaperon molecolari, non dovessero riuscire ad assumere la loro corretta struttura, sono attaccate dai sistemi di degradazione delle proteine e idrolizzate per il recupero degli amminoacidi costituenti. La degradazione proteica è realizzata mediante un processo selettivo da un sistema proteolitico che opera costantemente e che viene detto PROTEASOMA. Tale sistema di degradazione tuttavia non è in grado di riconoscere autonomamente le proteine da degradare, per questo scopo esso si avvale di un sistema di enzimi e di una piccola proteina di 76 Aa: l ubiquitina, così chiamata data la sua presenza in tutti gli eucarioti. In particolare, l ubiquitina viene legata covalentemente alla proteina 20

21 da degradare in prossimità di un residuo di Lisina attraverso l azione a cascata dei tre enzimi, noti come: E1, E2, E3. E1 si lega all ubiquitina, grazie all idrolisi di una molecola di ATP, tramite un legame tioestere che si stabilisce tra il gruppo carbossilico libero dell estremità C-terminale dell ubiquitina ed il gruppo sulfidrilico di un residuo di cisteina di E1. O O Ubiquitina C + O HS Ubiquitina E1 C S - AMP + PPi E1 Successivamente l ubiquitina viene ceduta ad E2. E2 HS HS E1 O Ubiquitina C S O E1 Ubiquitina C S E2 Da E2, passerà quindi ad E3 che porta già legata a se, la proteina da degradare, pertanto potrà catalizzare il legame dell ubiquitina su un residuo di lisina della proteina stessa. O Ubiquitina C S E2 + ligasi Residuo di lisina HS E2 O Ubiquitina C NH 21

22 Il riconoscimento della proteina da degradare da parte di E3 è reso possibile dalla presenza di un gruppo di amminoacidi idrofobici posti all estremità N-terminale della proteina stessa. Il legame dell ubiquitina sulla lisina della proteina da degradare avviene in virtù del fatto che: mentre nelle proteine funzionanti tale lisina è trimetilata e quindi protetta dall ubiquitinizzazione, nelle proteine da degradare, non esiste più questo sistema di protezione. Dopo che varie molecole di ubiquitina saranno state legate alla proteina, il proteasoma potrà riconoscerla e degradarla in piccoli peptidi inattivi, l ubiquitina verrà riciclata. O Ubiquitina C S E2 ligasi Residuo di lisina Piccoli peptidini 22