12/11/14. La struttura istologica dell osso. Rimodellamento del tessuto osseo. Osteoclas* Le cellule dell osso. La matrice dei connettivi calcificati

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1 La struttura istologica dell osso dell osso (98%) Stra* minerali di copertura (l'idrossilapa*te Ca10(PO4)6(OH)2: consiste in 60% di calcio, 30% di fosforo e 10% di ossigeno e idrogeno) Impalcatura di fibrille proteiche (collagene di *po I sinte*zzato dagli osteoblas*, composto prevalentemente dagli aminoacidi Glicina, Prolina, Lisina, acido Glutammico, Alanina e Arginina) Cellule (2%) osteoblas* che sinte*zzano l'impalcatura (fibrille ossee) osteoclas* che disfano la struoura osteoci* che mantengono il funzionamento del tessuto Sostanza minerale 70% Sostanza organica 30% Rimodellamento del tessuto osseo L osso è un tessuto metabolicamente attivo: nel tessuto osseo si svolge un con*nuo processo di rimozione e rinnovamento delle aree di osso senescente. Non solo nell età della crescita ma anche nell adulto e nella senescenza avviene un continuo fenomeno di distruzionericostruzione dell osso stesso, che porta ad un costante rinnovamento della struoura. Tale fenomeno è sooo controllo ormonale ed avviene grazie alla presenza di diversi *pi di cellule gli osteoblasti, responsabili della neoformazione, e gli osteoclasti del riassorbimento. Le cellule dell osso Cellule osteoprogenitrici osteoblasti (producono la matrice organica) matrice organica non calcificata matrice organica calcificata Osteoclas* Cellule grandi, mul*nucleate (fino a 50 nuclei), derivano dalla fusione di macrofagi mononuclea* Derivano da cellule ematopoie*che della linea del monocita- macrofago sono responsabili del riassorbimento dell osso (possiedono enzimi idroli*ci rilascia* per digerire la sostanza organica della matrice ossea) osteociti (sinte*zzano la matrice inorganica e la liberano all'esterno per esocitosi) osteoclasti (attivano il riassorbimento osseo) Cellule osteoprogenitrici, osteoblasti ed osteociti sono fasi consecutive dello stesso tipo cellulare. Gli osteoclasti, invece, derivano da precursori migrati nel tessuto osseo dal sangue, i cosiddetti preosteoclasti, i quali a loro volta si differenziano da cellule staminali del midollo osseo ematopoietico. possiedono receoori per la calcitonina e per il faoore s*molante rilasciato dagli osteoblas* sooo controllo dell ormone para*roideo Le diverse età del rimodellamento dell osso La matrice dei connettivi calcificati In condizioni fisiologiche e nell osso dell età adulta, riassorbimento e neoformazione procedono di pari passo; la neoformazione dell osso pareggia il precedente riassorbimento mantenendo costante la quan*tà di osso. In età pediatrica e nel corso dell accrescimento, prevale la fase di neoformazione Nella menopausa e nell età avanzata si osserva un eccesso di riassorbimento, con un disaccoppiamento dei due processi e la riduzione della quan*tà di osso mineralizzato. È formata da fibrille collagene giustapposte tra loro Ogni singola fibrilla, dopo un processo di formazione intracellulare (osteoblasti), subisce fasi di maturazione e catabolismo Nel reticolo endoplasmatico, le 3 strutture primarie (filamenti in verde) sono assemblate a formare la caratteristica tripla elica, il procollagene, caratterizzato dalla presenza di due propeptidi alle due estremità. 1

2 12/11/14 dal procollageno al collageno dal collageno alla matrice mineralizzata La particolare struttura sfalsata delle singole molecole lascia scoperte delle zone di fibrilla definite buchi (hole zone) in precise sequenze spaziali. In questi buchi si deposita il minerale osseo, principalmente come idrossiapatite. 1) Scissione dei propeptidi alle due estremità 2) Formazione dei cross link Cross-link: è il legame che si forma tra un peptide terminale e un residuo aminoacidico della catena adiacente. Aumenta la resistenza e diminuisce la flessibilità della fibrilla. Il Calcio Si trova nel corpo umano in due compar*men*: 99% nello scheletro Quindi, la quantità di Calcio presente nel fluido extracellulare è inferiore 1% nei ﬂuidi extracellulari rispetto a quella immagazzinata nelle ossa Funzione del Calcio 1. Omeostasi e struttura dell osso Funzione strutturale: il 99% del calcio totale costituisce l idrossiapatite dello scheletro L osso funge da riserva per il calcio plasmatico 2. Coagulazione È necessario nella conversione della protrombina a trombina Il Ca, per la sua importanza in fisiopatologia, richiede un complesso sistema omeostatico che coinvolge osso, rene e tratto intestinale, in grado di regolare anche piccole variazioni minimali che possono verificarsi in condizioni fisiopatologiche di normalità 3. Trasmissione degli impulsi nervosi 4. Contrazione muscolare 5. Metabolismo cellulare 1. Legame con la calmodulina 2. Aavazione di alcuni enzimi Equilibrio del Calcio Funzione metabolica: nel liquido extracellulare ha effetti sulla soglia del potenziale d azione e sui canali di Na e K nei liquidi intracellulari funge da II messaggero, regola la contrazione muscolare Regolazione dei livelli di Ca plasma*co Il Calcio è scambiato giornalmente tra il fluido extracellulare (ECF,1), l intestino (2), il tessuto osseo (3) e il rene (4) l azione dell Ormone paratiroideo (PTH) Ca Circa 1000 mg di Ca vengono ingeriti ogni giorno con una dieta bilanciata Circa 200 mg/die vengono persi nel lume del tratto GI con la bile e altre secrezioni. A seconda della concentrazione di 1,25diidrossivitamina D circolante, approssimativamente da 200 a 400 mg di Ca vengono assorbiti dall'intestino ogni giorno. I rimanenti mg (20-25 mmol) si ritrovano nelle feci. Il bilancio netto del Ca viene mantenuto attraverso l'escrezione renale del Ca, attestata su una media di 200 mg/die (5 mmol/ die). La Calcitonina (inibisce l attività degli osteoclasti) il Calcitriolo (metabolita attivo della Vit. D) Ca Ca 2

3 Il Paratormone (PTH) E un ormone calciotropo, responsabile del mantenimento del livello ematico di calcio Il gene che lo codifica si trova sul cromosoma 11 E un polipeptide di 84 aa, prodotto dalle paratiroidi a partire da un precursore Circola in forma libera nel plasma Da prepropth (115aa) a Paratormone (84aa) prepropth (115aa) con*ene una sequenza segnale idrofobica (25aa) all estremità aminoterminale propth con*ene un esapep*de basico a funzione sconosciuta PTH (84aa): i primi 34 aa all estremità NH 2 - terminali sono essenziali per l aavità biologica e per il legame al receoore E trasformato nel fegato nella sua forma aava (frammento N- terminale) ed inaava (frammento C- terminale) La sintesi del PTH è controllata dalle concentrazioni di Ca ++ nei fluidi extracellulari ( Ca PTH) L azione dell Ormone para*roideo (PTH) Ca Il PTH viene con*nuamente sinte*zzato, secreto e degradato Il fegato e i reni sono coinvol* nel metabolismo del PTH Il frammento N- terminale biologicamente aavo del PTH ha una emivita di pochi minu* Durante la degradazione vengono genera* segmen* carbossi- terminali di PTH che compaiono in circolo e che sono privi di qualsiasi aavità biologica Il PTH promuove: 1) Riassorbimento osseo 2) Riassorbimento tubulare renale 3) Sintesi di 1,25- diidrossicolecalciferol o (1,25-DHCG) 4) Assorbimento di Ca dall intestino La VITAMINA D è un ORMONE STEROIDEO Ca -Aumenta l assorbimento di Ca 2+ intestinale (aumenta la trascrizione di geni coinvolti nell uptake di calcio nell enterocita. es: CBP intestinale, ATPasi Cadipendente) -Aumenta il riassorbimento osseo e quindi la mobilizzazione di Ca e Pi (stimola il differenziamento degli osteoclasti) -Diminuisce l escrezione di Ca a livello renale - Reprime l espressione del gene del PTH e della calcitonina La calcitonina Ca È un polipep*de di 32 amminoacidi, sinte*zzato dalle cellule C parafollicolari della *roide, nell'uomo ha peso molecolare di Da Ha funzione antagonista al paratormone, infaa la sua azione consiste nel ridurre le concentrazioni plasma*che di calcio, agendo principalmente sull osso bloccandone il riassorbimento da parte degli osteoclas* e accelerando l aavità osteoblas*ca di deposizione della matrice agisce anche a livello renale, s*molando l'eliminazione di calcio da parte del tubulo contorto prossimale La Ct non svolge alcuna azione a livello intes*nale I livelli plasma*ci sono maggiori nei maschi da cui la predisposizione delle donne all osteoporosi La CT ha una azione veloce ma molto breve nel tempo La sua funzione è ridurre la calcemia quando avvengono piccoli aumen* di concentrazioni di Ca++ sierico 3

4 La secrezione della calcitonina è stimolata da alte concentrazioni plasmatiche di Calcio ionizzato e da alcuni ormoni intestinali (gastrina, glucagone, secretina) Organi bersaglio: 1) osso riduce gli osteoclasti ed inibisce il riassorbimento osseo 2) rene riduce il riassorbimento di Ca e P Assorbimento del Calcio La quan*tà di Calcio presente nell organismo dipende dalla quan*tà di calcio assorbita È richiesto un ambiente acido Il duodeno è il principale sito di assorbimento Disponibilità della Vitamina D Rapida motilità intestinale Elevato apporto di fibre Acloridria Le frazioni plasmatiche del calcio % ionizzato (fisiologicamente attivo) % complessato con bicarbonato, citrato, solfato e lattato Frazione % non legato alle proteine diffusibile (soprattutto all albumina) Frazione diffusibile Normalmente il 25% del calcio assorbito proviene dal cibo Deficit di Vitamina D Gli estrogeni aumentano l assorbimento L ormone para*roideo è implicato nell assorbimento del Ca Menopausa Età TAKE- HOME MESSAGE Il 40-50% del calcio circolante è legato alle proteine (in par*colare all albumina); la parte rimanente (sooo forma di citrato, fosfato, bicarbonato, solfato) rappresenta la quota aava e prende il nome di calcio ionizzato. Il laboratorio nelle malattie dell osso Sono oggeoo di studio le diverse componen* di questo complesso sistema metabolico (cos*tuito dall osso, dal collagene, dagli ormoni regolatori e dai diversi eleoroli* nel fluido extracellulare). Indagini di 1 livello Livelli sierici di: Calcio Albumina Fosfato Fosfatasi alcalina Marcatori del turnover del tessuto osseo Indagini di 2 livello PTH Magnesio Escrezione del calcio urinario 25-idrossicolecalciferolo Escrezione di idrossiprolina urinaria di formazione (Fosfatasi alcalina, Osteocalcina) di riassorbimento (Fosfatasi acida, Idrossiprolina urinaria totale) 4

5 12/11/14 Calcemia Valori di riferimento: 2,4 mmol/l I livelli calcemici sono mantenuti costanti, senza variazioni circadiane. I laboratori misurano di routine la concentrazione totale del Calcio (definita dalla frazione legata e quella non legata). FaOori che inﬂuenzano il legame del calcio alle proteine plasma*che 1) Il legame del Ca alle proteine è influenzato dalle variazioni del ph Alcalosi Diminuzione del calcio ionizzato per l aumento del legame albumina-ca Acidosi Aumento del calcio ionizzato per la dissociazione del complesso albumina-ca 2) alterazioni della concentrazione delle proteine plasmatiche influenzano la frazione di Ca ionizzato Nelle patologie in cui si riscontra diminuzione delle proteine plasmatiche anche il valore del calcio totale risulterà diminuito! I pazienti con ipoalbuminemia hanno valori di calcemia più bassi dei valori di riferimento, che riflettono i bassi livelli della frazione del calcio legato, ma il valore di calcio ionizzato, non legato, sarà normale! Tali pazienti non devono essere considerati ipocalcemici La convenzione del Calcio aggiustato La Calcemia può essere corretta per il livello di albumina utilizzando questa approssimazione: il valore della calcemia ottenuto deve diminuire o aumentare di 0,8 mg/dl (0,20 mmol/l) per ogni 1 g/dl di diminuzione o di aumento dell'albumina. Si misura sia il Calcio totale sia l albumina; Se l albumina è anomala, si calcola quale sarebbe stato il Calcio totale se l albumina fosse stata normale. Calcio aggiustato = Ca totale misurato + 0,02 (47-albumina) (mmoli/l) Questo calcolo dovrebbe essere usato per evitare problemi di valutazione della concentrazione della calcemia, in pazienti che hanno concentrazioni anormali di albumina nel siero! Sfortunatamente, questo e altri algoritmi per decidere il valore del Ca ionizzato sono spesso imprecisi! Ipocalcemia Valori di riferimento del Calcio sierico totale: 2,4 mmol/l Il dosaggio del paratormone (PTH) È la riduzione dei livelli plasmatici di calcio al di sotto dei valori di riferimento È caratterizzata da sintomi neurologici (formicolio, tetano, alterazioni mentali), segni cardiovascolari (es., ECG anomalo) e cataratta. È causata da ipoparatiroidismo, deficit di Vit. D, malattie renali. Terapia: assunzione del Calcio per via orale o metaboliti sintetici della Vit. D Le para*doidi secernono sia il PTH aavo di 84 AA, che frammen* inaavi di PTH. Quindi il dosaggio del PTH si basa su: Concentrazione plasma*ca di PTH aavo=1 5 pmol/l Emivita del PTH aavo: molto breve = 2-4 minu* Catabolizzato da fegato e rene con produzione di frammen* della regione intermedia e C- terminale con emivita molto più lunga si accumulano nel circolo, raggiungendo concentrazioni 5-20 volte maggiori rispeoo al pep*de aavo 5

6 Fosforo Fabbisogno: 1-2 g/die Eliminazione: filtrato per il 90%, viene riassorbito quasi totalmente; escrezione gr/die Valori di riferimento: mg/dl nell adulto mg/dl nei bambini Funzione del fosforo Funzione strutturale: il 75% del fosforo totale costituisce l idrossiapatite dello scheletro Funzione metabolica: costituente di: acidi nucleici, fosfolipidi, fosfoproteine, composti ad alta energia (ATP), cofattori (NADP) Il fosforo dell organismo esiste in due forme: P inorganico: HPO 4 2- e H 2 PO 4 - HPO 4 2- : H 2 PO 4 - = 1:4 a ph 7.4; 1:1 in acidosi; 1:9 in alcalosi 55% è libero, 35% è complessato con Na, Mg e Ca, 10% è legato alle proteine P organico: contenuto nelle cellule Nel sangue sono presen* sia fosfa* inorganici che organici e comunemente vengono dosa* solo I primi. Anche i fosfa*, come il calcio, sono presen* in forma libera e legata alle proteine ma una valutazione separata delle due fasi non riveste una u*lità clinica. Alimenti Intestino Feci Assorbimento 1,25(OH) 2 D + Il metabolismo del fosforo È fisiologicamente legato a quello del Calcio È regolato dagli effea renali ed ossei del PTH e della VitD Formazione Filtrato Osso Pool del fosforo Rene Urine Riassorbimento Riassorbimento PTH - Sudore Fosforemia Valori di riferimento: 2,8-4,5 mg/dl I livelli fosforemici presentano significative variazioni intra- e interindividuali, con ampie variazioni relative all età, al sesso, alla massa muscolare e a momenti fisiologici diversi. Nell infanzia sono >del 50% rispetto ai VdR e diminuiscono progressivamente fino all età adulta. Variazioni circadiane: rilevanti, correlate anche con i pasti Magnesio In un uomo adulto: g di magnesio Distribuzione: 50% nelle ossa, 45% intracellulare, 5% extracellulare Fabbisogno: 300 mg/die nell adulto Eliminazione: filtrato per il 70-80%, viene riassorbito per il 20-30% Valori di riferimento: mg/dl 6

7 Il metabolismo del magnesio Il Mg riveste un ruolo fondamentale come cofaoore per più di 300 enzimi, e quindi come aavatore per numerosi sistemi enzima*ci essenziali. non ha grande importanza nel metabolismo dei conneavi calcifica*, nonostante la sua abbondanza nello scheletro. TAKE- HOME MESSAGE La calcemia dipende da: PTH: s*mola l aavità osteoclas*ca(aumenta calcio e fosforo), aumenta l assorbimento del calcio e diminuisce quello del fosforo, aumenta la formazione di VitD aava VitD: promuove l assorbimento del calcio e del fosforo nell intes*no, mobilizza calcio e fosforo dall osso insieme al PTH, s*mola la ritenzione di calcio e fosforo a livello renale Calcitonina: antagonizza il PTH Marcatori del turnover del tessuto osseo di formazione dell osso (osteo-deposizione) Fosfatasi alcalina Osteocalcina Propeptidi N- e C-terminale del procollagene tipo I di riassorbimento Sialoproteina dell'osso Fosfatasi acida Piridinolina (PYD) e Deossipiridinolina (DPD) cross-link del collagene Marcatori biochimici di osteo-deposizione I biomarcatori di formazione e apposizione ossea sono prodoa direa o indirea dell'aavita' degli osteoblas*, espressi sia durante le differen* fasi della differenziazione degli osteoblas*, sia nel corso della deposizione e maturazione di nuova matrice extracellulare ossea. Campione biologico: siero o plasma Metabolita Tessuto di origine Specificità Metabolita ALP totale Tessuto Osso, fegato, di origine intestino, Bassa Specificità placenta ALP ossea Osso Molto elevata Osteocalcina Osso Molto alta Peptidi C e N terminali del procollagene Osso, pelle, connettivo Moderata Fosfatasi alcalina (ALP) Valori di riferimento: UI/l (bambini fino a 1 anno) UI/l (bambini 1-10 anni) UI/l (adolescenti) UI/l (adulti) È prodooa a livello di vari tessu*: osso, fegato, intes*no, placenta, rene, ghiandole salivari, mammella E' presente in tuoe le cellule in fase di proliferazione o con un metabolismo aavo Isoforme*: tessuto- aspecifica, placentare o simil- placentare, intes*nale Fosfatasi alcalina ossea *sono codifica* dallo stesso gene e presentano iden*ca sequenza aminoacidica, mentre differiscono fra loro nel contenuto di carboidra* Fosfatasi alcalina ossea Elevate quan*tà sono localizzate sulla membrana cellulare degli osteoblasti. Determina l idrolisi del pirofosfato, rendendo disponibile il fosfato per i processi di mineralizzazione ossea. Ha una emivita di 1-2 giorni Il dosaggio può essere effeouato con metodi eleorofore*ci o con l impiego di an*corpi monoclonali (metodi immunoenzima*ci) specifici per l isoforma ossea e dota* di elevata sensibilità anali*ca Aumenta in tuoe le condizioni di aumentata apposizione ossea con o senza contemporaneo aumento del riassorbimento. Età infantile e adolescenza Osteoporosi Post-menopausa Morbo di Paget 7

8 Osteocalcina sierica (Bone Gla Protein) Valori di riferimento: 3,2-12,2 ng/ml (uomo) e 2,7-11,5 ng/ml (donna) È una proteina di 5900 Da, Vit. K dipendente in grado di legare il Ca e l idrossiapa*te Presenta 3 residui di γ- carbossiglutammato, che hanno una forte capacità di legare ioni Ca ++ e permeoono alla proteina di legarsi all idrossiapa*te (per questo e' chiamata bone gla protein) Interagisce con altri receoori di membrana, svolgendo un ruolo molto importante nell'organizzazione della matrice extracellulare e nel processo di mineralizzazione dell'osteoide. La quan*ta' di osteocalcina in circolo e' proporzionale all'en*ta' della formazione ossea in corso. I livelli di osteocalcina raggiungono valori massimi intorno ai 12 (F)- 14 (M) anni, in coincidenza con i periodi di massima velocità di crescita, poi decrescono verso i valori dell adulto. Nelle donne la concentrazione plasma*ca dell osteocalcina aumenta di circa due volte dopo la menopausa. ProdoOa da osteoblas*, osteoci* e condroci* ipertrofici in seguito a s*molazione della Vit D La quan*ta' di osteocalcina dell'osso rappresenta il 15% delle proteine totali ed e' considerata un marcatore specifico dell'aavita' degli osteoblas* La maggior parte dell'osteocalcina prodooa dagli osteoblas* e' incorporata nella matrice ossea, dove si lega all'idrossiapa*te, mentre solo una piccola frazione e' presente nel sangue Emivita: pochi minu* È specifica per le patologie dell osso, tuoavia le metodiche di dosaggio aoualmente disponibili (metodi radioimmunologici ed immunoenzima*ci) non sono completamente standardizza* Osteomalacia Morbo di Paget Osteoporosi postmenopausa Iperparatiroidismo Ipoparatiroidismo Trattamento corticosteroideo prolungato Fosfatasi alcalina ossea e Osteocalcina Sebbene siano prodooe entrambe dagli osteoblas*, le loro concentrazioni non variano in parallelo, suggerendo che esse sono coinvolte in processi differen*. La concentrazione sierica di osteocalcina e' quindi un marcatore molto sensibile di formazione ossea e correla con i valori di formazione ossea. Peptidi N- e C-terminale del procollagene di tipo I Il collagene e' cos*tuito per il 95% da collagene di *po I e per il restante 5% da collagene di *po III e IV. Il collagene di *po I e' anche il principale componente dell'osso (cos*tuisce il 90% della matrice ossea) La formazione dei frammen* N e C terminali del procollagene e' direoamente proporzionale alla formazione di nuove molecole di collagene maturo misura diretta e quantitativa della formazione di collagene maturo 45 Marcatori biochimici di riassorbimento osseo Sono prodoa di degradazione del collagene di *po I dell'osso, che possono essere misura* nelle urine e nel siero. Sialoproteina Dell'osso E' una glicoproteina di 80 kda presente nell'osso E' sinte*zzata dagli osteoblas* ed e' coinvolta nella mineralizzazione ossea. Studi preliminari indicano che aumen* della sua concentrazione sierica correlano meglio con patologie del riassorbimento osseo che con quelle di formazione. 8

9 Fosfatasi acida Le fosfatasi acide sono un gruppo eterogeneo di sei isoforme enzima*che, espresse in modo specifico in diversi tessu* e *pi cellulari (es. prostata, vescica, piastrine, eritroci*, macrofagi) Sono inibite dal tartrato In par*colare, per l'isoforma della Fosfatasi acida presente negli osteoclas* sono sta* iden*fica*: 1) un isoenzima grande con PM maggiore, sensibile al tartrato 2) un isoenzima piccolo con PM minore, resistente al tartrato (TRAP: tartrate resistant acid phopshatase) TRAP 5a: contenente acido sialico, presente nei macrofagi TRAP 5b: privo di acido sialico, specifico per gli osteoclas* La concentrazione sierica di TRAP 5b e' aumentata in condizioni di marcato riassorbimento osseo (menopausa, osteoporosi) Piridolina (HP) e Deossipiridolina (LP) cross- link piridolinici Valori di riferimento: piridolina: pmoli/µmoli creat.; deossipiridolina: 3-21 pmoli/µmoli creat. Sono compos* aminoacidici che formano legami crocia* covalen* tra catene adiacen* di collagene Si trovano nell osso, nella car*lagine, nei tendini, nei legamen* e nell aorta Sono secreti nelle urine e derivano dalla degradazione del collagene maturo e non da quello di nuova formazione Sono disponibili metodi immunometrici per il dosaggio su campioni di urine delle 24 ore. Morbo di Paget Osteoporosi Iperparatiroidismo primario Ipertiroidismo Artrite rematoide organica mineralizzata Malattie ossee L ipercalcemia o l ipocalcemia non implicano necessariamente alterazioni significative a livello osseo. Al contrario, si possono manifestare gravi malattie ossee, anche quando il livello di calcio sierico sembra normale. Le principali malattie ossee sono l osteoporosi, l osteomalacia e rachitismo, il morbo di Paget Normale Osteoporosi Osteomalacia organica mineralizzata organica mineralizzata Malaaa Osteomalacia/ Rachi*smo Profili biochimici nelle malaae ossee Profilo Il Calcio tenderà a essere basso o può essere neoamente diminuito; Il PHT è elevato; il 25- idrossicolecalciferolo diminuisce se la malaaa dipende dal deficit di Vit. D Malaaa di Paget Il Calcio è normale; la fosfatasi alcalina è elevata in maniera evidente Osteoporosi Non ci sono modificazioni biochimiche rilevabili Metastasi ossee Il Calcio può essere alto, basso o normale; il PTH è normalmente basso; la fosfatasi alcalina può essere elevata o normale 9