Materiale del corso:

Transcript

1 Informazioni sul corso Fabrizio Ferrè Tel: Dipartimento di Biologia, stanza 320 (dente di Genetica) Materiale del corso: Username: GC2014 Password: GC2014!

2 Informazioni sul corso Calendario Lezione 1 (7 prile): Sequenziamento e assemblaggio Lezione 2 (14 prile): Sequenziamento e assemblaggio 2 Lezione 3 (28 prile): Sequenziamento del trascrittoma Lezione 4 (5 Maggio): Sequenziamento del trascrittoma 2 Lezione 5 (12 Maggio): nnotazione del genoma Lezione 6 (19 Maggio): nnotazione del genoma 2 Lezione 7 (26 Maggio): Banche dati genomiche Lezione 8 (2 Giugno): Varie ed eventuali

3 Informazioni sul corso Valutazione finale: Relazione scritta sull analisi di dati di sequenziamento del trascrittoma

4 Informazioni sul corso Valutazione finale: Relazione scritta sull analisi di dati di sequenziamento del trascrittoma: 1 nalisi di qualità 2 Mappatura sul genoma 3 Calcolo dell espressione 4 Test di espressione differenziale 5 Visualizzazione e interpretazione 6 nalisi funzionale

5 Informazioni sul corso Valutazione finale: Relazione scritta sull analisi di dati di sequenziamento del trascrittoma: Per ognuno di voi verrà creato un account sul server per la didattica, dove metterò i dati e I installerò i programmi necessari Scrivetemi un e vi manderò le credenziali per entrare nel vostro spazio

6 Lezione 1 Sequenziamento del genoma

7 Genomica Introduzione Genoma: corredo dell'acido nucleico contenente l'informazione genetica di un organismo Nucleare Cromosomico Genoma Degli organelli Extracromosomico

8 Genomica Introduzione Genoma: corredo dell'acido nucleico contenente l'informazione genetica di un organismo Nucleare Cromosomico Genoma Degli organelli Extracromosomico Epigenoma Individuali Variazioni genomiche Diverso da cellula a cellula In alcuni tipi cellulari

9 Genomica Introduzione Genoma: corredo dell'acido nucleico contenente l'informazione genetica di un organismo Nucleare Cromosomico Genoma Degli organelli Extracromosomico Epigenoma Individuali Variazioni genomiche Diverso da cellula a cellula In alcuni tipi cellulari Genoma core Pan-genoma Genoma dispensabile

10 Genomica Introduzione l GENOM Geni e sequenze reagolatorie La Genomica è strettamente legata a molte altre discipline, ciascuna delle quali impiega molte metodologie computazionali l TRSCRITTOM RN ed espressione genica l PROTEOM Proteine l METBOLOM Metaboliti e vie metaboliche l FRMCOGENOM Relazione tra genoma e risposta ai farmaci l INTERTTOM Insieme di interazioni fra proteine l EPIGENOM Modificazioni del genoma l REGOLOM Sequenze regolative e molecole regolatrici

11 Genomica Introduzione La Genomica e la Biologia Computazionale sono evolute insieme nni 70: i dati erano pochi e poco rappresentativi, ma gia i biologi iniziavano ad applicare algoritmi per analizzare sequenze di proteine ed acidi nucleici; nni 80: vari studiosi iniziarono ad introdurre metodi presi in prestito da informatica e statistica per analisi più sofisticate; nni 90: non appena i primi genomi iniziarono ad essere sequenziati, nasce la genomica computazionale; 2000-: i genomi completamente sequenziati sono numerosi, nuove tecnologie promettono di ottenere valanghe di dati in tempi brevissimi, e la genomica computazionale è ormai integrata nelle metodologie di analisi biologica e non più applicata solo a posteriori

12 Genomica Introduzione Figure 714 Genomes 3 ( Garland Science 2007)

13 Genomica Introduzione Organismo Paia di basi (aploide) Numero geni Descrizione Saccharomyces cerevisiae 12,495,682 5,770 Lievito della birra Cyanidioschyzon merolae 16,520,305 5,331 lga rossa unicellulare Plasmodium falciparum 22,853,764 5,268 Protozoo Caenorhabditis elegans 100,258,171 19,427 Nematode rabidopsis thaliana 115,409,949 28,000 ngiosperma Drosophila melanogaster 122,653,977 13,379 Moscerino della frutta nopheles gambiae 278,244,063 13,683 Zanzara Mus musculus 26 x ,000 Topo domestico Homo sapiens 32 x ,000 Uomo Tetraodon nigroviridis 342 x ,918 Pesce palla Oryza sativa 39 x ,544 Riso

14 Genomica Introduzione

16 The Sanger chain-termination method Molecole di DN a singolo filamento che differiscono anche solo di una singola base in lunghezza possono esere separate su gel di poliacrilamide per elettroforesi

17 The Sanger chain-termination method ddnucleotidi l l dd, ddt, ddc, ddg Quando incorporati nella catena nascente di DN causano l'arresto della replicazione

18 The Sanger chain-termination method Si parte da DN a singolo strand che si vuole sequenziare; Si iniziano 4 reazioni di replicazione separate; Nella miscela di reazione sono presenti i 4 nucleotidi standard e sono aggiunti dideossinucleotidi (ddntps) marcati che terminano l'allungamento; Dopo un numero sufficiente di cicli ci saranno polimeri che terminano ad ogni possibile posizione del templato Separando per elettroforesi questi polimeri in base alla loro dimensione, si osserveranno una serie di bande corrispondendti alla sequenza del templato

19 The Sanger chain-termination method

20 The Sanger chain-termination method Elettroferogramma Mentre i frammenti ottenuti dalla reazione di sequenziamento sono separati dal gel, un laser legge la fluorescenza di ogni frammento e determina automaticamente la sequenza Ogni colore (blu, verde, rosso o giallo), oppure l'intensità della fluorescenza, corrisponde ad un nucleotide diverso (ad esempio blu per le G, e cosi via)

24 Qualità della sequenza Phred PHRED PHil s Read EDitor (Phil Green) Generata sequenza della read e valutazione della qualità PHRED quality = -10 log 10 Prob(Error)

25 Il formato GCCCGGCGGGTTCTGCTGGGGCGGTGTTCGGTTGGGCGGC + fffffffefe^eeceedffdcd^dxecffbeed`reebe`db\]xwss Un file FSTQ utilizza 4 righe per ogni sequenza: - La prima riga inizia con ed è seguita dall identificativo della sequenza ed una descrizione (opzionale); equivale alla prima riga di un file FST (che inizia per >) - La seconda riga contiene la sequenza - La terza riga inizia con un + e può contenere identificativo e descrizione - La quarta riga contiene I punteggi di qualità per ogni nucleotide della sequenza codificati come conversione decimale del codice SCII (merican Standard Code for Information Interchange) del carattere corrispondente (ad es ]=93,f=102)

26 The Sanger chain-termination method Sequenziatori: - La separazione e' effettuata per elettroforesi su capillare invece che su gel - 1 corsa = 4 ore - 1 corsa = 384 sequenze in parallelo - più di 2000 sequenze al giorno - ogni sequenza = fino a 700 bp

27 Next Generation Sequencing DN sequencing technologies Sanger sequencing Next-Generation sequencing Roche 454 BI SOLiD Illumina (Solexa) Next-Next (3 rd ) Generation sequencing VisiGen Helicos Oxford Nanopore

28 Next Generation Sequencing - Producono un'enorme mole di reads corte; - I tempi di corsa sono molto brevi; - Grosso risparmio economico; - Possono essere applicate a DN, RN e altre varianti; - Di recente sono state estese per la produzione di paired reads; - L'analisi bioinformatica è lo step limitante di tutta la procedura: I dati sono prodotti più velocemente e facilmente di quanto sia possibile analizzarli

29 Next Generation Sequencing

30 Next Generation Sequencing [Kahvejian et al, Nature Biotech 2008]

31 Piattaforme per Next Generation Sequencing

32 Piattaforme per Next Generation Sequencing Polony = PCR colony

33 Sequenziamento con terminatori reversibili 1) Estrazione del DN 2) Frammentazione 3) ttacco degli adattatori

34 Sequenziamento con terminatori reversibili 4) ttacco ad un supporto solido 5) mplificazione per PCR Lezione 1 Genomica Computazionale,

35 C T G C T G T G C G T T G Cluster 1 Cluster 2 Cluster 3 C T G C T G C T G T G C G T T G C G T T G C G T T G Sequenziamento con terminatori reversibili adattatore sequenza del frammento adattatore

36 Sequenziamento con terminatori reversibili Primo ciclo di sequenziamento C T G ggiunta di adattatori liberi e basi marcate

37 Sequenziamento con terminatori reversibili Fluoroforo Sito di taglio del fluoroforo 3'-O-azydomethyl

38 Sequenziamento con terminatori reversibili Primo ciclo di sequenziamento C T G Lettura dell'emissione Laser

39 Sequenziamento con terminatori reversibili Primo ciclo di sequenziamento C T G rimozione del terminatore

40 Sequenziamento con terminatori reversibili Secondo ciclo di sequenziamento C T G ggiunta di basi marcate

41 Sequenziamento con terminatori reversibili Secondo ciclo di sequenziamento C T G Lettura dell'emissione Laser

42 Sequenziamento con terminatori reversibili Terzo ciclo di sequenziamento Lettura dell'emissione C T G Laser

43 Sequenziamento con terminatori reversibili Quarto ciclo di sequenziamento Lettura dell'emissione C T G Laser

44 Sequenziamento Illumina/Solexa Genome nalyzer 1 Caricamento dei campioni 2 ttacco del DN alla superficie 3 Bridge amplification DN a singolo strand si attacca casualmente sulla superficie Nucleotidi ed enzimi sono aggiunti per iniziare l amplificazione su fase solida

45 Sequenziamento Illumina/Solexa Genome nalyzer 4 Il DN diventa a doppio strand 5 Il DN doppio strand viene denaturato 6 L amplificazione e ripetuta La denaturazione lascia DN a singolo strand attaccato alla superficie Vari milioni di gruppi di DN amplificato sono generati alla fine del processo

46 Sequenziamento Illumina/Solexa Genome nalyzer 1 ttacco della prima base 5 Imaging della prima base 6 ttacco della seconda base Si aggiungono i 4 nucleotidi con terminatori reversibili Ogni cluster emettera in base al nucleotide incorporato nella prima posizione Si aggiungono di nuovo I 4 nucleotidi con terminatori reversibili

47 Sequenziamento Illumina/Solexa Genome nalyzer sequence clusters tile Ciclo 1 Ciclo 2 Ciclo 3 Ciclo 4 Ciclo 5 Ciclo 6

48 Sequenziamento Illumina/Solexa Genome nalyzer Illumina Genome nalyzer Flow cell - Divisa in 8 canali (lanes); - Ogni canale può essere caricato con fino a 12 campioni diversi ientificati da diverse tag (multiplexing); - Input: µg; milioni di reads (clusters) per flow cell, ogni cluster contenente ~1,000 copie dello stesso templato lanes

49 Sequenziamento Illumina/Solexa Genome nalyzer Illumina Genome nalyzer Flow cell tile control lane lanes lanes

50 Sequenziamento Illumina/Solexa Genome nalyzer Read Length 1 X 35 bp 2 X 50 bp 2 X 75 bp 2 X 100 bp 2 X 150 bp Run Time (Giorni) Output (Gb) ~ ~ ~ ~ ~

51 Sequenziamento Roche/454 Emulsion-based clonal amplification (empcr) Frammenti di DN sono amplificati per PCR in una goccia d'acqua in olio Nella goccia si trovano biglie ricoperte da primer, nucleotidi e enzimi per la PCR Le biglie sono caricata su una piastra (PicoTiter plate) [Mezker, Nature Rev Genet 2010]

52 Sequenziamento Roche/454 La solforilasi converte il pirofosfato in TP L'TP è idrolizzato dalla luciferasi emettendo luce [Mezker, Nature Rev Genet 2010]

53 Sequenziamento Roche/454 La solforilasi converte il pirofosfato in TP L'TP è idrolizzato dalla luciferasi emettendo luce [Mezker, Nature Rev Genet 2010]

54 Sequenziamento Roche/454 T C GG TTTTTT La solforilasi converte il pirofosfato in TP L'TP è idrolizzato dalla luciferasi emettendo luce [Mezker, Nature Rev Genet 2010]

55 Sequenziamento Roche/454 Flow Order T C G

56 ssemblaggio del genoma

57 Strategie per il sequenziamento di genomi

59 Strategie per il sequenziamento di genomi Coverage (numero totale di basi sequenziate)/ (lunghezza della sequenza assemblata) 31/13=23

60 Strategie per il sequenziamento di genomi Bottom-up Top-down

61 Metodo top-down Top-down (or hierarchical, or clone-based) shotgun sequencing 1 Il genoma è frammentato, e i frammenti sono clonati in un vettore adatto: - YC (yeast artificial chromosome) - BC (bacterial artificial chromosome) 2 I BC o YC sono replicati nelle cellule ospiti per produrre milioni di copie 3 Questi cloni sono poi analizzati cercando dei marcatori specifici (STS, siti di restrizione, etc) 4 Marcatori condivisi da piu' cloni sono utilizzati per determinare l'ordine di questi cloni sul cromosoma da cui originano (tiling path) Gruppi di cloni con regioni sovrapposte sono chiamati contigs 5 Un sottoinsieme di questi cloni e' scelto per massimizzare la copertura della sequenza e al contempo minimizzare il numero di sequenze necessarie, e sottoposto a sequenziamento shotgun

62 Metodo top-down Top-down Method Libreria di YC (Yeast rtificial Chromosome) ~100mln bp YCs ~1mln bp ~40k bp

63 Strategie per il sequenziamento di genomi Top-down Method ~40k bp Libreria di BC (Bacterial rtificial Chromosome) Sequenziamento shotgun Vettore virale, Plasmide

64 Metodo top-down Un clone in un BC 1 Si parte da una libreria di cloni in BC 2 Mappatura dei cloni sul genoma (mediante mappe fisiche) 3 Selezione un set minimo di BC sovrapposti (minimum tiling path)

65 Metodo top-down Mappe fisiche cromosomiche Forniscono la posizione relativa e una stima della distanza di una serie di marcatori: - geni - polimorfismi - siti di restrizione - STS - etc

66 Metodo top-down Un clone in un BC 1 Si parte da una libreria di cloni in BC 2 Mappatura dei cloni sul genoma (mediante mappe fisiche) 3 Selezione un set minimo di BC sovrapposti (minimum tiling path) 4 Sequenziamento di ogni clone per shotgun 5 ssemblaggio 6 Identificazione relazioni a lunga distanza

67 Metodo top-down I BC che sono stati selezionati sono poi purificati dalle corrispondenti colonie batteriche Il DN purificato è rotto con mezzi fisici, e frammenti di dimensione 2 5 kb sono clonati, stavolta in plasmidi Questi frammenti sono poi sequenziate con il metodo di Sanger a partire da una od entrambe le estremità Le sequenze generate sono chiamate reads Le reads le cui sequenze si sovrappongono sono raggruppate (assemblate), e la sequenza che si genera dalla loro sovrapposizione e' chiamata contig di sequenza Questi contigs sono una versione preliminare dell'assemblaggio finale, intervallati da regioni non coperte (gaps) o di scarsa qualità La ripetizione di alcune sequenze, o l'aggiunta di nuovi dati, può aiutare a rifinire l'assemblaggio

68 Metodo top-down Contig: un set continuo di sequenze overlappanti Gap

69 Metodo top-down Read Coverage Lunghezza del segmento assemblato: L Numero di reads: n Coverage C = n l / L Lunghezza media delle reads: l Modello di Lander-Waterman: ssumendo una distribuzione uniforme delle reads, C=10 equivale a 1 gap ogni 1,000,000 di nucleotidi

70 Metodo top-down Read Coverage Coverage Contig Reads