Dr. Tommaso Giordani SEQUENZIAMENTO SANGER E ASSEMBLAGGIO DEI GENOMI

Transcript

1 Dr. Tommaso Giordani SEQUENZIAMENTO SANGER E ASSEMBLAGGIO DEI GENOMI

2 Programma - Strategie di sequenziamento Sanger dei GENOMI COMPLETI sequenziamento gerarchico (clone by clone) sequenziamento shotgun dell intero genoma (WGS, Whole Genome Shotgun - Sequenziamento e annotazione di cloni BAC

3 Col sequenziamento Sanger si ottengono sequenze lunghe al massimo di 1000 bp. Eppure con questa metodica sono stati sequenziati i primi interi genomi!!!

4 Strategie di sequenziamento Sanger dei GENOMI COMPLETI -sequenziamento gerarchico (clone by clone) -sequenziamento shotgun dell intero genoma (WGS, Whole Genome Shotgun)

5 Sequenziamento clone by clone - Sommario Costruzione di una Libreria genomica con grandi (150 kb) inserti cromosomici (es. BAC). Costruzione di una mappa fisica del genoma e selezione del numero minimo di cloni per coprire il genoma (minimal tiling path) Frammentazione casuale e sequenziamento shotgun dei cloni. Assemblaggio delle sequenze

6 Sequenziamento clone by clone 1. Clonaggio di frammenti genomici di grandi dimensioni (50-200kb) in vettori BAC, PAC, e cosmidi

7 Sequenziamento clone by clone 2. Organizzazione dei cloni genomici in una mappa fisica, cioè in un set ordinato di frammenti di DNA su una regione cromosomica, in modo tale da selezionare il Minimal Tiling path cioè la collezione di frammenti genomici in grado di coprire la regione cromosomica con il minor grado di sovrapposizione 3. Sequenziamento shotgun dei cloni BAC selezionati (tiling path) e loro assemblaggio a formare contigs. 4. Assemblaggio dei contigs e ricostruzione della sequenza cromosomica.

8 Sequenziamento Genomico: Mappa Genetica e Mappa Fisica Per poter mettere in ordine i diversi frammenti è necessario disporre di una mappa dettagliata del genoma, ovvero la disposizione di una serie di marcatori lungo ciascun cromosoma. Un marcatore rappresenta un sito unico presente nel genoma.

9

10 Una alternativa al sequenziamento clone by clone è il Sequenziamento shotgun dell intero genoma (WGS, Whole Genome Shotgun) Costruzione di una Libreria shotgun: inserti di varie misure kb Sequenziamento shotgun solo delle estremità degli inserti dei cloni senza determinare il numero minimo di cloni per coprire il genoma (minimal tiling path) Assemblaggio delle sequenze

11 Assemblaggio Sequenze AATGACCG ATTGGCATT TGACCGTCAT GTTCCATCAT CCGTTGATT ATTGGCATGA CATTTCGTT Contig AATGACCGTTGATTGGCATTGGCATGACCGTCATTTCGTTCCATCAT Più contig assembalati formano uno Scaffold Contigs Scaffold

12 Contig (it. contiguo): tratto di sequenza assemblato senza discontinuità. Scaffolds: serie di due o più contigs uniti da lunghi inserti le cui estremità sono in diversi contig ma di cui non si conosce la regione centrale. Contig Contig Scaffold

13 Whole genome shotgun (WGS): riassunto 1. Frammentazione del genoma e costruzione di librerie plasmidiche con inserti di dimensioni tra 2 e 3kbp. 2. Sequenziamento di entrambe le estremità (paired ends) di ciascun clone (sequence reads) 3. Allineamento e assemblaggio di tutte le sequenze ottenute per la produzione di una sequenza consensus (contig) mediante l utilizzo di algoritmi che tengano conto anche della distanza tra seq for e seq rev del medesimo clone (vincoli di vicinanza e di direzione) 4. Assemblaggio dei contig in scaffold e mappatura sui cromosomi

14

15 Più scaffolds assemblati formano un cromosoma. I genomi completi sono organizzati in cromosomi, quelli incompleti rimangono strutturati in scaffolds. Al termine dell assemblaggio si procede con l annotazione ovvero si fornisce un nome a ciascuna sequenza riconoscibile sul genoma. Infine si procede al rilascio della sequenza del genoma in database.

16 Il primo genoma sequenziato con l'approcccio whole genome shotgun Sequenziamento del genoma di ( Mb Hemophilus Influenzae (1.8 l frammenti di 1,6-2 kb l saggi di sequenziamento ( 6.5X l 11,6 Mb di sequenza totale (copertura l 30 ore per assemblare la sequenza su un calcolatore con 512 Mb di RAM Craig Venter et al, 1995

17 Qual'è la strategia migliore di sequenziamento, clone by clone o Whole Genome Shotgun? Il progetto Genoma Umano 3 miliardi di $ 300 milioni di $

18 Qual'è la strategia migliore di sequenziamento, clone by clone o Whole Genome Shotgun? Organismi batterici o eucarioti monocellulari con genomi piccoli (<20Mb) e poche regioni ripetute: WGS Organismi multicellulari con genomi grandi, ricchi in sequenze ripetute: clone by clone? WGS? Miglior compromesso tra velocità e accuratezza: strategia ibrida di sequenziamento

19 Strategia ibrida di sequenziamento (o approccio misto ) Sequenziamento genomico Approccio misto DNA genomico 'reads' Frammenti casuali corti ( kb, clonati in plasmide), di lunghezza media 35-40Kbp (es. fosmidi) e lunghi Kbp (BAC) ( paired-end ) Sequenziamento automatico BIDIREZIONALE Ricostruzione computazionale della sequenza genomica utilizzando informazioni di mappa fisica e sequenziamento di alcuni cloni BAC mappati

20 Problemi dell'assemblaggio shotgun Errori di sequenza: circa % delle basi sono sbagliate (errore intrinseco della tecnologia di sequenziamento) Tempo di computazione: proporzionale al numero di reads (decine di milioni di sequenze da assemblare!)

21 Problema dell'assemblaggio shotgun : le sequenze ripetute La presenza nel genoma eucariotico di sequenze ripetute crea problemi nell assemblaggio delle sequenze Necessità di una copertura adeguata del genoma (numero di basi sequenziate / numero di basi per genoma aploide)

22 Ridondanza e copertura del genoma in un sequenziamento shotgun Con il progredire del progetto aumenta la ridondanza media, che indica quante volte ogni base è stata coperta e quindi aumenta la copertura del genoma. (Es. 4x= numero totale di basi sequenziate è 4 volte quello del genoma=copertura media di 4)

23 Copertura 1X Regione ad elevata copertura Regioni senza copertura Regione a bassa copertura contig Genoma Aumentando la copertura si ottengono contig più lunghi e meno numerosi. contig Super-contig Genoma

24 Simulazione di un progetto di assemblaggio di circa sequenze di circa 600 basi, appartenenti ad un genoma di 4Mbp

25 Ridondanza e copertura in un sequenziamento shotgun Applicando l equazione della distribuzione di Poisson è possibile calcolare la Probabilità (P 0 ) che una base sia stata sequenziata in funzione della ridondanza media (R) Probabilità (P 0 ) = e -R % copertura effettiva =100 * (1 - e - R ) Ridondanza media Copertura effettiva 1 63,20% 2 86,50% 3 95,00% 4 98,20% 5 99,30% 6 99,80%

26 Genome coverage E dato dalla combinazione delle lunghezze di tutti gli inserti in una genoteca diviso il contenuto 1C dell organismo per il quale la libreria è stata costruita. Formula: W = NI/G (W=coverage), N=numero totale di cloni che compongono una genoteca, I=lunghezza media in paia di basi degli inserti, G=1C grandezza del genoma (in paia di basi) dell organismo dal quale la libreria è stata preparata ( vinifera Supponiamo di avere costruito una library BAC per la vite (Vitis 1C DNA content = pb 50,000 cloni con dimensione media degli inserti pb W = (50,000 cloni x pb)/ pb W = 11.5X La libreria contiene una quantità di DNA 11.5 volte la quantità di DNA di in un genoma ( equivalenti (=11.5 genomi Con una copertura 3X, la possibilità di trovare una particolare sequenza genomica nella libreria è approssimativamente 95% Aumentando la copertura a 5X aumenta la probabilità che quella libreria sia rappresentativa di un intero genoma Generalmente una copertura da 7-12X è ritenuta ottimale in entrambi gli approcci

27 Vantaggi e svantaggi dei due approcci l Sequenziamento gerarchico: l Vantaggi: c è una mappa fisica di BAC che pone dei vincoli quindi assemblaggio è più facile; la sequenza risultante è di più alta qualità; l l Svantaggi: devo costruire una libreria BAC e una mappa fisica (fase preparatoria lunga e di difficile coordinazione tra laboratori ( partecipanti Whole genome shotgun: l l Vantaggi: non costruisco una mappa fisica Svantaggi: difficoltà nel risolvere le ripetizioni; computazionalmente problema più complesso; ottengo una sequenza DRAFT del genoma

28 COME VIENE SEQUENZIATO UN GENOMA? La metafora del puzzle

29 RICOMPORRE IL GENOMA: LA METAFORA DEL PUZZLE Grandezza del puzzle = Grandezza del genoma Se la grandezza è molto grande la difficoltà aumenta esponenzialmente

30 grandezza dei pezzi = lunghezza delle sequenze Pezzi più grandi rendono il puzzle più facile = sequenze più lunghe rendono l assemblaggio del genoma più facile tuttavia ottenere sequenze lunghe con metodi di sequenziamento tradizionali (Sanger) è costoso tecniche di sequenziamento di next generation sequencing sono decisamente più economiche ma forniscono sequenze più corte rispetto ai metodi tradizionali Si cerca un compromesso, spesso attraverso soluzioni ibride tra metodi tradizionali e di next generation sequencing

31 Problema dell'assemblaggio: le sequenze ripetute Le parti uniche dell immagine sono più facili da ricomporre Le parti ripetute sono più difficili da ricomporre Per ancorarle è fondamentale disporre di sequenze paired-end ovvero sequenziate alle estremità 3 e 5

32 Sequenza unica con marcatore molecolare Regione con sequenze ripetute, difficile da assemblare Regione di genoma???????? Frammenti di 20000bp Porzione di frammento sequenziato in 5 Porzione di frammento sequenziato in 3

33 Mischiare pezzi di due puzzle molto simili rende molto difficile la ricomposizione = effetto della eterozigosi, ecco perchè si cerca, se possibile, di sequenziare omozigoti o diaploidi

34 Assemblaggio dei genomi L assemblaggio è basato sulla sovrapposizione delle sequenze e sull ancoraggio a una mappa fisica del genoma. Maggiore è la copertura, più sarà possibile coprire tutta la sequenza del genoma Un Programma di Assemblaggio deve: valutare tutte le possibili sovrapposizioni di sequenza in entrambe le direzioni, al fine di determinare la migliore soluzione di allineamento tenendo conto della distanza tra seq for e seq rev (paired ends) del medesimo clone (vedi dopo) generare una sequenza consenso per ogni contig e attribuire un valore di affidabilità ad ogni base della sequenza consenso I programmi attualmente più utilizzati sono ARACHNE, PCAP...

35 Fase di finishing: assemblaggio dei contig La fase di finishing è tanto più difficile, quanti più sono i contig generati dall assemblaggio. I programmi di assemblaggio tengono conto: - della lunghezza media degli inserti di DNA - del fatto che le sequenze ottenute dalle estremità opposte di un medesimo inserto devono collocarsi ad una distanza plausibile nel genoma Per chiudere i buchi fra i contig negli scaffold e fra gli scaffold: 1) sequenziamento interno di un inserto plasmidico che fa da ponte tra due contig 2) sequenziamento di frammenti di PCR che corrispondono alle interruzioni 3) integrazione di dati da DATABASE: sequenze EST, trascritti full length, ecc.

36 Qualità di un sequenziamento genomico I parametri che consentono di misurare la qualità di un progetto di sequenziamento genomico sono: 1. Completezza: % di eucromatina sequenziata (attualmente per il genoma umano,~99% di eucromatina corrispondente a Mb con 308 gaps corrispondenti a 28Mb di eucromatina e 33 gaps corrispondenti a 198Mb di eterocromatina). 2. Correttezza: a) Accuratezza dell assemblaggio delle sequenze, valutata: -misurando la coerenza interna della sequenza: % errore nell allineamento, dei profili di restrizione, distanza corretta tra le paired ends. Si migliora aumentando la copertura del genoma in regioni poco accurate. - confrontando i dati assemblati con mappe genetiche o fisiche preesistenti b) % di errore (genoma umano: < di 1 errore ogni pb ). Si migliora aumentando la copertura del genoma in regioni con ambiguità di sequenza verificabili tramite punteggi di probabilità.

37 Importanza della STRUTTURA GENETICA della specie da sequenziare -La copertura necessaria è diversa a seconda della taglia del genoma della specie: genoma piccolo, medio o grande. (Poliploidia, presenza di sequenze ripetute, es olivo ha 30% seq. ripetute in tandem!! Pinus ha genoma di 18-40Gb senza essere poliploide!!) -La copertura necessaria è diversa a seconda che il genotipo sia omozigote (specie autogame) o altamente eterozigote (allogame). -Nelle specie allogame, si può cercare di utilizzare linee pure (mais), oppure diaploidi ottenuti in vitro (vite). Tuttavia, aumentando molto la copertura è possibile anche sequenziare genotipi eterozigoti.