Clonaggio del gene AtHsp101 in vettori binari per la produzione di piante di riso resistenti alle alte temperature.

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1 Neri Andrea n. matricola Clonaggio del gene AtHsp101 in vettori binari per la produzione di piante di riso resistenti alle alte temperature. Introduzione Il riso rappresenta il 35-60% dell energia consumata da quasi 3 miliardi di persone solo in Asia. Problemi come il basso contenuto di Fe e altri oligoelementi di minore entità è causa in questi popoli di malnutrizione; per questo molti progetti sono indirizzati al miglioramento della qualità nutrizionale di questo alimento così largamente diffuso. Il riso è una fonte di cibo importante per i paesi in via di sviluppo nei quali, dato l elevato tasso di crescita, sarà necessario aumentare la produzione Figura 1 Pianta di Oryza sativa. agricola nei prossimi anni (Bennet, 2001). Questo, però, è ostacolato da stress abiotici come elevate quantità di sali nel terreno, siccità e temperature non adatte alla coltura di queste piante che impediscono l incremento dei raccolti (Grover e Minhas, 2000). Infatti, l esposizione a temperature superiori a quelle ottimali riduce la quantità e la qualità della produzione di tutti i cereali (diminuzione di peso ed impoverimento delle caratteristiche nutrizionali della cariosside). Un effetto prolungato della temperatura sovra ottimale porta ad una diminuzione del tasso di germinazione e ad una perdita della robustezza dei semi. La pianta di riso (figura 1) è una pianta erbacea, alta da 120 a 195 cm (può raggiungere anche i 5 metri di altezza) con radici avventizie e embrionali, le quali hanno la caratteristica di sviluppare dei parenchimi aeriferi, permettendo al riso di vivere in ambiente acquatico. Il fusto (detto culmo) presenta internodi cavi e nodi pieni e si sviluppa in maniera simile al frumento. Ha foglie a forma di guaina, lunghe parecchi centimetri e larghe due, con peli bianchi, corti e spessi; la ligula è lunga e sono presenti auricole pelose. All'apice dello stelo presenta una pannocchia (infiorescenza a panicolo) terminale, a maturità pendente, costituita da spighette uniflore con fiori ermafroditi a sei stami e un pistillo; l'ovario contiene un solo ovulo. Il frutto è una cariosside ellittica o sferica con glumelle molto sviluppate; è vestita (risone), presenta un peso di mg, ed importanti sono le sezioni trasversali e longitudinali delle cariossidi per classificare le tipologie di riso. Uno dei parametri è il rapporto lunghezza/larghezza, un altro è l'evidenziazione del dente (presenza dell'embrione). Progetto Lo scopo del progetto è quello di produrre piante di riso transgeniche nelle quali sovra esprimendo il gene hsp101 sia conferita termoresistenza, consentendo la coltivazione delle piante in quelle aree geografiche in cui le condizioni climatiche non lo permettono, aggiungendo così nuovi territori non sfruttati a quelli già esistenti. Sono state già ottenute piante resistenti ad elevate quantità di sali, basse temperature, siccità ed inondazioni ma non sono stati ancora fatti grossi progressi per quanto riguarda la resistenza alle alte temperature. E stato notato che a seguito di uno shock termico le 1

2 Figura 2 Mappa del vettore binario pga3436 Tabella 1 Caratteristiche pga3436. piante iniziano ad accumulare un gruppo di proteine chiamate heat shock protein (HSPs) (Singla et al. 1997, 1998). Nel riso vengono sintetizzate proteine HSP con diverso peso molecolare, Hsp16.9, Hsp70, Hsp82, Hsp100. In Arabidopsis thaliana la HSP101 è la componente che fornisce maggiore termotolleranza alla pianta. Queitsch et al. (2000) hanno sovraespresso il gene hsp101 in A. thaliana dimostrando che la proteina HSP101 prodotta permette alle piante di crescere normalmente nonostante le alte temperature alle quali le piante erano state sottoposte. Controlli sono stati fatti anche in senso opposto, cioè silenziando l espressione del gene hsp101 tramite sirna; in questo caso le piante presentano una diminuzione nella termoresistenza. Esperimenti sono stati fatti anche creando piante di riso transgeniche e facendo sovraesprimere il gene hsp101 di A. thaliana aumentando considerevolmente la tolleranza allo stress da alte temperature (Katiyar- Agarwal et al. 2003). La regolazione dell espressione delle HSPs avviene a livello della trascrizione e questo permette di agire a livello dei promotori per modificare il pattern di espressione delle proteine. Il progetto prevede come primo passo quello di inserire il gene di nostro interesse all interno di un vettore binario, in questo caso pga3436 ( Figura 2 e tabella 1). Il vettore binario è semplicemente un plasmide Ti senza il T-DNA, al posto del quale sono inseriti tra i bordi destro e sinistro il gene da trasferire nella pianta ed un marcatore di selezione. Un altro marcatore è inserito all'esterno dei bordi per la selezione in E. coli e Agrobatterio. Il vettore binario necessita di un plasmide helper per espletare la sua funzione. Questo è un plasmide Ti senza il T-DNA ma con i geni vir. Una volta preparato il vettore come sopra descritto, verranno create piante transgeniche di riso mediante Agrobacterium e/o la tecnica del gene gun. L ultima parte del progetto riguarda la generazione di un linea pura per il gene hsp101 tramite incroci. Inoltre sarà effettuato lo studio dei caratteri morfologici, fisiologici e biochimici delle componenti nutrizionali. 2

3 Il gene Nonostante l mrna del gene Athsp101 non è identificabile in assenza di stress ma si trova accumulato ad alti livelli solamente durante l esposizione alle alte temperature, molte HSP sono espresse anche a livelli ottimali di crescita come chaperoni molecolari per assistere il ripiegamento proteico. Queste proteine sono richieste per mantenere una crescita ottimale dell organismo riducendo danni alle cellule indotti dal calore. I membri della famiglia delle Hsp100 sono proteine altamente conservate, scoperte per la prima volta nei batteri come sistema proteasico a due subunità detto Clp. La subunità più grande detta ClpA ha attività di unfolding ATP-dipendente e proteine correlate ad essa sono state rilevate sia nei batteri che negli eucarioti, dove svolgono attività antiaggregante; la subunità più piccola ClpP è una proteasi ed è stata, invece, trovata solo nei batteri, associata a ClpA. La funzione principale delle Hsp100 è quella di promuovere la rimozione di aggregati proteici formatisi in condizioni di stress in una modalità ATP-dipendente: la ClpA favorisce il defolding dell aggregato che può andare incontro ad un processo di refolding o essere idrolizzato dalla subunità ClpP. La famiglia delle Hsp100 ha 2 larghi blocchi di sequenze omologhe appartenenti ai 2 siti di legame per l ATP. Questi sono fiancheggiati da spaziatori e domini N- terminali poco conservati. La dimensione dello spaziatore è utilizzata per delineare le tre sotto famiglie: ClpA, ClpB e ClpC. Le prime hanno uno spaziatore corto, le seconde uno spaziatore lungo e le ultime hanno uno spaziatore di dimensione intermedia fra le due. Lo spaziatore della proteina AtHSP101 è di circa 120 residui amminoacidici, ciò lo colloca nella sotto famiglia delle ClpB. Questa proteina è per il 47,5% identica alla ClpB di E. coli (Schirmer et al. 1994). Il gene Athsp101 si trova nel cromosoma 1 di Arabidopsis tahaliana nel locus AT1G Il gene è lungo 3682 bp compresi gli introni e le zone UTR. Questo contiene 6 esoni separati da 5 introni per una sequenza codificante pari a 2736 bp con una percentuale di coppie CG pari al 46% della CDS. L open reading frame codifica per una proteina citosolica contenente 911 amminoacidi per un peso molecolare di circa 101 kda. La proteina possiede domini ATPasici e domini coinvolti nell attività di chaperonina. Questa è coinvolta nel citoplasma in processi catabolici, di folding proteico, di risposta al calore, risposta ad alti livelli di luce e di perossido d idrogeno. Figura 3 Amplificazione del pprimehsp101 con due coppie di primer. Primo pozzetto amplificazione con Kpn-hsp101 Fw e Spe-hsp101 Rev. Secondo pozzetto amplificazione con M13 Fw e M13 Rev. Terzo pozzetto DNA ladder (1Kb). 3

4 Procedimento Il progetto è iniziato con la trasformazione di cellule di E. coli competenti del ceppo DH5α con i vari vettori binari allo scopo di creare uno stock di cellule da utilizzare per la riproduzione dei plasmidi necessari per il clonaggio. Il passo successivo è stato quello di amplificare il gene tramite PCR usando come template il cdna di AtHsp101, come primer forward i primi 18 nucleotidi della sequenza del cdna preceduti dai nucleotidi del sito di restrizione KpnI e come primer reverse gli ultimi 18 nucleotidi della sequenza del cdna seguiti dai nucleotidi del sito di restrizione SpeI e come polimerasi una Taq high fidelity Hot Start. A seguito di questo passaggio si è purificato il prodotto di PCR, è stata fatta l A-tailing del purificato ed una ligation con il vettore pprime della 5-Prime. Questo plasmide contiene un gene che conferisce ai batteri la resistenza all ampicillina ed alla kanamicina. Inoltre, contiene il gene per la β-galattosidasi all interno del quale è presente il multi cloning site dando così la possibilità di effettuare uno screening biancoblu delle colonie trasformate su piastre petri contenti LBampicillina, IPTG e X-gal. Una colony PCR ha Figura 5 Amplificazione pga3436-hsp101 con 2 primer Fw differenti. Primo pozzetto Hsp bp Fw e Spe-hsp101 Rev. Secondo pozzetto UbiQ Fw e Spe-hsp101 Rev. Terzo pozzetto DNA ladder(1kb). permesso di discriminare falsi positivi da colonie Figura 4 Purificazione da gel tramite kit nucleo spin extract del gene hsp101 digerito con KpnI e SpeI. Primo pozzetto DNA ladder(1kb). Secondo pozzetto gene hsp101. contenenti il gene all interno del vettore. Selezionata la colonia contenente il pprime-hsp101 è stata effettuata una colony con due coppie di primer ( figura 3) per accertarci del corretto clonaggio del gene. Purificato il plasmide si è creato uno stock per inviare i diversi campioni all azienda responsabile del sequenziamento in modo tale da accertarci che durante la replicazione con la Taq polimerasi HF il gene non avesse subito mutazioni di basi nucleotidiche. Una volta avuti riscontri positivi sul sequenziamento si è proceduto con la digestione con gli enzimi KpnI e SpeI del pprime-hsp101 in modo tale da purificare il singolo gene (figura 4). Ottenuto il frammento corrispondente al gene hsp101 si è proceduto al suo inserimento all interno del vettore pga3436 precedentemente linearizzato con gli enzimi di restrizione KpnI e SpeI. Una volta effettuata la ligation del vettore al gene (pga3436-hsp101), questo è stato inserito per elettroporazione nelle cellule competenti DH5α. Questo processo però per svariati fattori ha dato una bassissima 4

5 efficienza di trasformazione. Alla fine è stata ottenuta una colonia contenente il pga3436-hsp101. Le conferme sul corretto clonaggio sono state ottenute mediante una PCR effettuata con un primer reverse disegnato sul gene hsp101 e un primer forward disegnato sul promotore dell ubiquitina presente sul vettore binario (figura 5). Successivamente è stata effettuata una digestione del plasmide con gli stessi enzimi di restrizione che erano stati utilizzati per il clonaggio (figura 6) ed i risultati ottenuti hanno confermato il corretto clonaggio del gene di interesse. Figura 6 Digestione pga3436-hsp101. Primo pozzetto digestione con KpnI e SpeI. Secondo pozzetto DNA ladder (1Kb). 5

6 Bibliografia Bennet J Summing-Up: Cutting-edge Science for Rice Improvement Breakthroughs and Beneficiaries. In: Jamie A. Goode and Derek Chadwick (Eds.) Rice biotechnology: Improving Yields, Stress Tolerance and Grain Quality, Novartis Foundation/John Wiley, UK, pp Grover, Anil ; Minhas, Deepika (2000) Towards production of abiotic stress tolerant transgenic rice plants: issues, progress and future research needs Proceedings of the Indian National Science Academy - Part B: Biological Sciences, 66 (1). pp ISSN Katiyar-Agarwal Surekha, Manu Agarwal and Anil Grover. Heat-tolerant basmati rice engineered by over-expression of hsp101. PLANT MOLECULAR BIOLOGY Volume 51, Number 5 (2003), , DOI: /A: Queitscha Christine, Suk-Whan Hongb, Elizabeth Vierlingb, and Susan Lindquista. Heat Shock Protein 101 Plays a Crucial Role in Thermotolerance in Arabidopsis. Plant Cell, Vol. 12, , April 2000, Copyright 2000, American Society of Plant Physiologists. Schirmer E. C., S. Lindquist and E. Vierling. An Arabidopsis Heat Shock Protein Complements a Thermotolerance Defect in Yeast. THE PLANT CELL, Vol 6, Issue Singla SL, Pareek A. and A. Grover Short-term salinity and high temperature stresassociated ultrastructural alteratios in young leaf cells of Oryza sativa L. Annals of Botany 80: Singla SL, A Pareek and A Grover Plant HSP 100 family with special reference to rice. J. Biosciences 23: Ringraziamenti Al professore Andrea Andreucci, alla mia famiglia e a Simona Pellegrino. 6