Ricerca finanziata dalla Regione Piemonte OBIETTIVI

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1 VALORIZZAZIONE DELLE ARAERISIHE HIMIO-ISIHE E SENSORIALI DI VINI A DENOMINAZIONE DI ORIGINE PRODOI DA UVE ORESE ED ARNEIS, APPLIANDO ENIHE INNOVAIVE DI AINAMENO - PROGEO VARO Ricerca finanziata dalla Regione Piemonte OBIEIVI Mettere a punto un metodo analitico agevole e semplice da impiegare per il monitoraggio in cantina del processo di estrazione delle macromolecole parietali nel vino. Verificare l effetto della tecnica di affinamento sur lies sul processo di estrazione dei colloidi glucidici dalla parete cellulare dei lieviti e sulla composizione aromatica dei vini Arneis e ortese. Verificare la possibilità di impiego di cellule di lievito secco sottoposte ad un trattamento preliminare di attivazione in alternativa alla tecnica classica di affinamento sur lies. Studiare la shelf-life dei vini bianchi ortese ed Arneis ottenuti con le diverse modalità di affinamento. MESSA A PUNO DI UN MEODO RAPIDO PER LA VALUAZIONE DEI OLLOIDI NEI VINI AIVIA Sono stati studiati alcuni metodi di analisi, già utilizzati per altri scopi, per verificarne l applicabilità per la valutazione delle cessioni di mannoproteine dalle cellule del lievito durante l affinamento sur lies, questi sono stati: 1. Il metodo del fenolo, proposto dall O.I.V. per il dosaggio del tenore in mannoproteine nei preparati commerciali. 2. Il metodo di Lowry impiegato per il dosaggio delle proteine nel vino. 3. Il dosaggio per via enzimatica del contenuto in glucosio e mannosio liberati per idrolisi acida delle macromolecole cedute dai lieviti. E stato, inoltre, applicato un procedimento per l isolamento e la purificazione delle mannoproteine dal vino con l impiego di concanavalina A (gel filtrazione). RISULAI 1. Metodo del fenolo Il metodo, denominato Metodo del fenolo (Risoluzione OENO 26/4), consiste nella determinazione spettrofotometrica del cromoforo che si forma per reazione della frazione polisaccaridica in presenza di fenolo in ambiente fortemente acido. Il metodo descritto nella Risoluzione OIV si riferisce all analisi delle mannoproteine purificate; qui è stato adattato per l analisi delle mannoproteine del vino. E stata calcolata la curva di calibrazione per concentrazioni di mannosio comprese tra e mg/l. Questo metodo è stato ritenuto poco adatto per gli impieghi pratici che ci eravamo prefissati perché estremamente laborioso, scarsamente riproducibile e poco adatto ad un impiego presso laboratori poco attrezzati perché richiede l impiego di acidi concentrati e reagenti tossici. 2. Metodo di Lowry E stata verificata la possibilità di monitorare le cessioni in mannoproteine dei lieviti attraverso la determinazione della variazione del contenuto proteico dei vini con l impiego del metodo di Lowry. Questo metodo è basato sulla reattività del legame peptidico con gli ioni u 2+ in condizioni alcaline (reazione di Biureto) e la reazione viene innescata dal reattivo olin-iocalteau, il quale si riduce 1

2 durante l ossidazione degli amminoacidi aromatici (residui di tirosina e triptofano), catalizzata dal rame. L associazione delle due reazioni permette d ottenere una colorazione dei campioni di un blu - verde molto intensa. Poiché il metodo di Lowry è molto sensibile al ph, il valore di ph della soluzione analitica deve essere mantenuto tra 1 e 14. Sono state calcolate le rette di calibrazione utilizzando come standard Mannostab e BSA (Siero Albumina bovina). Le misurazioni sono state effettuate in triplo su soluzioni sintetiche aventi concentrazioni comprese tra 15 e 75 mg/l di standard. La concentrazione delle proteine è maggiore nella BSA rispetto alle mannoproteine del commercio; in base ai risultati ottenuti si è ritenuto che la retta di calibrazione costruita con BSA fosse la più adatta alla quantificazione della frazione proteica delle mannoproteine. Il metodo di analisi risulta pratico e relativamente semplice e può essere impiegato per gli obiettivi proposti in associazione ad un metodo di quantificazione della frazione colloidale glucidica. 3. Metodo enzimatico per la quantificazione della frazione mannanica dei vini. I collodi glucidici presenti naturalmente nelle uve non contengono mannosio; la presenza di mannosio in forma polimerica (mannani) nel vino è esclusivamente dovuta alla liberazione di mannoproteine dalle cellule dei lieviti durante la fermentazione alcolica e nel corso della conservazione dei vini sur lies. Nel corso del processo di conservazione, le cessioni di mannoproteine dalle pareti cellulari dei lieviti possono essere monitorate analizzando le variazioni della concentrazione di mannosio nei vini. A questo proposito è stato messo a punto e validato un metodo spettrofotometrico per il dosaggio del mannosio in forma polimerica. Descrizione del metodo per la valutazione delle cessioni in mannoproteine di un vino affinato sur lies. I vini velati o torbidi devono essere sottoposti a centrifugazione iniziale e poi concentrati 1 volte con il filtro tangenziale. Il campione concentrato è sottoposto a idrolisi acida a caldo (bagnomaria d acqua a 1 ) per 18. Il ca mpione è raffreddato a temperatura ambiente e neutralizzato a ph 7 circa con NaOH. Sull idrolizzato viene effettuato il dosaggio del mannosio e del glucosio per via enzimatica. Il metodo è stato impiegato per determinare la composizione in mannosio e glucosio in forma polimerica di 36 vini del commercio (figura n.1). Arneis Arneis 15, 7, Mannose mg/l 6, Glucose mg/l 125, 5, 1,, 75, 3, 5,, 8 9 Year 8 9 igura 1. Rappresentazione grafica (box-plot) del contenuto in glucosio e mannosio in forma polimerica dei vini Arneis del commercio distintamente per annata di produzione. Year Sono state effettuate ulteriori prove per verificare l applicabilità del metodo ai vini rossi. Nei vini rossi, la presenza di materia colorante e polifenoli potrebbe, infatti, influire sul risultato dell analisi. Allo scopo di valutare le possibili interferenze di questi composti sull analisi è stata approntata un esperienza che è consistita nell effettuazione dell analisi di un vino bianco (ortese) prima e 2

3 dopo l aggiunta di un estratto polifenolico di uve a bacca nera. A 46 ml di vino sono stati aggiunti ml di estratto concentrato di bucce ottenuto da uve ornarea. I tenori in mannosio del teste e della prova aggiunta di antociani risultano prossimi. Emerge una differenza importante (circa mg/l) tra il contenuto in glucosio del teste e della tesi aggiunta di estratto, riconducibile però al glucosio legato agli antociani (antocianine) e ai composti volatili presenti nel concentrato e liberati durante la fase d idrolisi a caldo. MESSA A PUNO DI UNA PROEDURA PER IL RAAMENO DELLE ELLULE DI LIEVIO SEO AIVO, HE VERRANNO ONSERVAE A ONAO DEL VINO DURANE LA ASE DI AINAMENO. AIVIA Sono state condotte prove su piccola scala in mezzo sintetico, volte a verificare, l effetto di fattori fisici, chimici e/o biochimici sull estrazione della frazione mannoproteica dalla parete delle cellule di lievito secco attivo. E stato valutato il rilascio di mannoproteine dalle cellule di lievito sottoposte ad alcuni trattamenti fisici e fisico-chimici (temperature di e 6 e ph pari a 2 e 5 unità) o a diverse modalità di idratazione (in acqua o in un mezzo sintetico contenente sostanze nutritive per il lievito). E stata, inoltre, effettuata una prova di valutazione delle cessioni di mannoproteine in vini bianchi aggiunti di cellule di lievito idratate in presenza o meno di enzimi del commercio aventi un azione β-glucanasica. Sono state quindi effettuate prove di rilascio delle mannoproteine nel corso dell idratazione dei LSA su un mezzo sintetico in condizioni variabili di temperatura, ph ed in presenza o meno di un preparato enzimatico con attività β-glucanasica e su un vino-modello conservato per breve tempo a contatto delle cellule di lievito idratato in condizioni differenti. RISULAI Dai risultati delle prove di laboratorio emerge che le condizioni di idratazione dei LSA intervengono modificando la quantità di mannoproteine cedute dalle cellule di lievito nel corso della fase di idratazione. Si rileva un effetto positivo svolto dall aggiunta del preparato enzimatico con attività β- glucanasica sulla liberazione di mannosio in forma polimerica, in particolare quando si opera in soluzioni aventi ph più elevati. La concentrazione del glucosio in forma polimerica nelle soluzioni di idratazione è fortemente influenzata dall aggiunta della β-glucanasi e dal ph del mezzo: in presenza di β-glucanasi si ha la quasi scomparsa del glucosio polimerico, indipendentemente dal ph del mezzo; mentre in assenza dell enzima, l idrolisi delle forme polimeriche del glucosio è favorita dai ph più elevati (ph 5). I LSA separati per centrifugazione dalla sospensione sono stati aggiunti ad un vino modello per verificare l andamento delle cessioni dalle cellule del lievito in condizioni che simulano quelle di un vino durante la conservazione. Si osserva che le condizioni di idratazione, livello di ph e aggiunta di β-glucanasi, non influenzano in modo significativo e rilevante l entità delle cessioni di mannosio e glucosio in forma polimerica nei vini-modello. Il protocollo di idratazione impiegato per la preparazione delle cellule di lievito da aggiungere ai vini nel corso delle prove condotte in cantina ha tenuto conto di questi risultati. Lo studio dei fattori che influenzano le cessioni di macromolecole dalle cellule dei lieviti, qui avviato è, tuttavia, alquanto complesso e necessita di ulteriori approfondimenti. La possibilità di disporre di un metodo di analisi validato per il dosaggio dei colloidi glucidici derivanti dalla cellule del lievito, sicuramente consentirà una più agevole prosecuzione di questi studi. 3

4 SUDIO DELLA ENIA DELL AINAMENO SUR LIES INI E DELLA PRAIA DELLA ONSERVAZIONE A ONAO ON LE ELLULE DI LIEVIO SEO AIVO NEL ORSO DI ESPERIENZE DI AINAMENO SU SALA DI ANINA DEI VINI ARNEIS E ORESE. VALUAZIONE DELL EEO SULLE ARAERISIHE HIMIO-ISIHE E SENSORIALI DEI VINI AL ERMINE DELL EINAMENO E NEL ORSO DELLA ONSERVAZIONE IN BOIGLIA (SHEL-LIE DEI VINI). AIVIA Insieme al onsorzio utela Vini d Asti e del Monferrato ed al onsorzio utela Barolo Barbaresco Alba Langhe e Roero sono state individuate 2 Aziende in cui sono state rispettivamente avviate le prove di affinamento sur lies impiegando un vino ortese (antina sociale re Secoli ) ed un vino Arneis (Azienda Agricola Angelo Negro ). La prova ha riguardato il confronto di 3 tesi, conservate in barrique di 3 passaggio. Ogni tesi è stata ripetuta 2 volte. esi 1. Il vino è stato conservato limpido (ESE) esi 2: il vino è stato conservato a contatto delle lies fini (le stesse cellule di lievito che avevano svolto la fermentazione alcolica: ceppo Lalvin D47) (LIES). esi 3: il vino è stato aggiunto di cellule di lievito sottoposte ad un preliminare trattamento di attivazione, sono state impiegate cellule di lievito dello stesso ceppo della tesi 2 (Lalvin D47) (ELLULE). Per quanto riguarda la preparazione del vino da impiegare per la prova sperimentale di affinamento sur lies (esi 2), sono state seguite le seguenti indicazioni: - impiego di enzimi pectolitici per la chiarifica del mosto (2 g/hl); - nessun apporto di coadiuvanti di chiarifica del mosto; - nessun apporto di tannini enologici, - apporto adeguato di sostanze nutritive ed attivanti di fermentazione, - impiego dello stesso ceppo di lievito secco attivo in entrambe le aziende. Le partite di vino impiegate per la sperimentazione non hanno avuto problemi di fermentazioni alcoliche lente o stentate e non è stata percepita la formazione di idrogeno solforato durante ed a fine A. Le fecce di fermentazione non presentassero odori sgradevoli (odori di ridotto, formaggio). erminata la A, il vino è stato separato dalle fecce grossolane. Sul vino, dopo travaso, è stato determinato il contenuto in fecce (per pesata). Il vino è stato quindi lasciato illimpidire; con la parte superiore della vasca, quella più limpida, dopo alcuni giorni sono state riempite 4 barrique (esi 1 e esi 3). Il deposito è stato quindi rimesso in sospensione e con il vino torbido sono state riempite le 2 barrique della tesi 2 (affinamento sur lies fini). I vini a contatto con le lies e con le cellule di lievito sono stati sottoposti a periodiche risospensioni (batonnages). Il contatto dei vini con le lies fini (esi 2) si è protratto per circa 8 mesi, mentre la permanenza dei vini sulle cellule di lievito è durata circa 1 giorni. Preparazione delle cellule di lievito sottoposte ad un preliminare trattamento di attivazione. Anno 8. Le cellule di lievito sono state idratate alla temperatura di per in una soluzione zuccherina al 5% di saccarosio, contenente 3 mg/l di N in forma ammoniacale, e vitamina B1. La sospensione contenente le cellule è stata quindi posta in un bagno termostatato a per 24 ore. Il rapporto quantità di cellule di lievito/soluzione zuccherina era di 1/1 (225 g di cellule di lievito in 2,25 L di soluzione zuccherina che corrisponde alla quantità impiegata per barrique). Le cellule di lievito sono state quindi separate per centrifugazione ed aggiunte al vino in barrique. Le modalità di idratazione erano volte a favorire l attività β-glucanasica naturale del lievito. Anno 9. Le cellule di lievito sono state idratate in una soluzione tampone a ph 5 (tampone citrato-fosfato). L idratazione è avvenuta alla temperatura controllata di 35 per circa 45 ore, non sono stati aggiunti preparati enzimatici ad attività β-glucanasica. Il rapporto quantità di cellule di 4

5 lievito/soluzione zuccherina era di 1/1 (225 g di cellule di lievito in 2,25 L di soluzione tampone che corrisponde alla quantità impiegata per barrique). Le cellule di lievito sono state quindi separate dal surnatante per centrifugazione ed aggiunte al vino in barrique. RISULAI omposizione chimico-fisica dei vini Vini dell annata 8 I vini Arneis presentano una gradazione alcolica media di 13,8 ed un estratto secco medio pari a,7 g/l. Il tenore in estratto è di circa 1 g/l maggiore nelle tesi affinate sur lies rispetto alle tesi testimoni, mentre le tesi aggiunte di cellule di lievito presentano un contenuto intermedio. Il colore (E 4 nm) è scarico e simile in tutte le tesi. Alcune differenze si rilevano per quanto riguarda il parametro * (croma) che esprime l intensità colorante nel sistema IELAB. I vini testimone presentano una colorazione più intensa delle tesi aggiunte di cellule di lievito, il cui impiego è stato studiato da alcuni Autori proprio per asportare dal vino una parte dei pigmenti bruni. Le lies possiedono una minore capacità adsorbente, perché le loro pareti hanno già adsorbito composti polifenolici durante la A. Infine, le tesi affinate sur lies presentano un contenuto medio in catechine più elevato delle altre 2 tesi. I vini ortese hanno un tenore alcolico (in media pari a 12,5 ) e d un estratto totale (19,1 g/l) inferiori rispetto ai vini Arneis. Si osserva che i vini affinati sur lies presentano un tenore in estratto secco superiore di circa 1,5 g/l rispetto a quello delle altre due tesi. Per quanto riguarda il colore, i risultati sono diversi rispetto a quanto osservato per i vini Arneis: in questo caso i vini affinati sur lies presentano un valore di E 4 e di * significativamente più elevato rispetto alle altre tesi, simili tra di loro. Il maggiore incupimento del colore potrebbe essere dovuto alla dissoluzione di ossigeno durante i batonnages. Le tesi sur lies, infine, conservano un contenuto più elevato in catechine e polifenoli totali rispetto alle altre tesi. Per quanto riguarda la composizione in macromolecole, i vini Arneis affinati sur lies presentano un tenore medio in colloidi totali (analisi per gravimetria) pari a 444 mg/l. Il tenore in colloidi totali delle tesi sur lies è superiore rispetto a quello delle tesi testimoni del 32% circa, non si rilevano, invece, differenze di rilievo tra le tesi testimoni e quelle aggiunte di cellule di lievito. I vini ortese sono più poveri dei vini Arneis in colloidi totali (contenuto medio pari a 357 mg/l). In questi vini la tesi sur lies presenta un tenore in colloidi totali superiore rispetto alla tesi testimone del 78%. Sui vini Arneis e ortese sono stati quindi determinati per via enzimatica il tenore in glucosio e mannosio in forma polimerica. Per quanto riguarda i vini Arneis, si rileva un tenore medio in mannosio in forma polimerica pari a 122 mg/l. Le tesi conservate sur lies contengono il 23% circa di mannosio da polimeri in più delle tesi testimoni. Al contrario, il contenuto delle cellule di lievito risulta di poco inferiore a quello delle tesi testimone. Il contenuto medio in mannosio dei vini ortese è in media pari a 71mg/L, inferiore a quello del vino Arneis. Le tesi conservate sur lies presentano il 52% di mannosio in più rispetto alle tesi testimoni. ome già osservato per i vini Arneis il contenuto in mannosio delle tesi aggiunte di cellule di lievito è minore rispetto a quello delle tesi testimone. I dati del tenore in mannosio sono in accordo con quelli relativi ai colloidi totali. La conservazione a contatto con le cellule di lievito attivate non ha, modificato il tenore in colloidi glucidici, ma ha determinato soltanto un arricchimento del contenuto proteico dei vini. Vini dell annata 9 ome già rilevato nel corso del 8, per i vini Arneis il tenore in estratto totale è di circa 1 g/l maggiore nelle tesi affinate sur lies rispetto alle tesi testimoni e quelle aggiunte di cellule di lievito. Il colore (E 4 ), è scarico e mediamente più intenso nelle tesi affinate sur lies. Il contenuto medio in polifenoli totali risulta medio-basso e medio il tenore in catechine: le tesi affinate sur lies presentano un contenuto in polifenoli totali mediamente più elevato delle altre 2 tesi. I vini ortese hanno un estratto totale inferiore rispetto ai vini Arneis. Si osserva che i vini affinati sur lies presentano un tenore in estratto secco superiore di circa 1 g/l rispetto a quello delle altre due tesi.per quanto riguarda il colore, i risultati sono diversi rispetto a quanto osservato per i vini 5

6 Arneis: in questo caso i vini affinati sur lies presentano un valore di * mediamente più elevato rispetto alle altre tesi, simili tra di loro. Le tesi sur lies presentano un contenuto più elevato in catechine e polifenoli totali. Sono, infine, riportati in tabella n.1 alcuni dati della composizione chimico-fisica dei vini Arneis e ortese dopo 6 mesi di conservazione in bottiglia. Arneis 6 mesi sig. ortese 6 mesi sig. ph 3,41 a 3,45 ab 3,52 b * ph 3,49 3,54 3,52 ns acidità totale g/l 4,95 4,9 5,25 ns acidità totale g/l 4,7 4,7 4,9 ns acidità volatile g/l,28,29,27 ns acidità volatile g/l,,22,21 ns estratto secco g/l 19,9,2 21,1 ** estratto secco g/l 18,8 a 18,7 a, b * E 4nm u.a.,11,9,11 ns E 4nm u.a.,1 a,11 ab,12 b * IELAB: IELAB: L 98,1 98,9 98,4 ns L 98,6 98,3 98,4 ns h -1,38 a -1,33 b -1,34 ab * h -1,35-1,32-1,33 ns 7,82 6,81 8,37 ns 7,46 7,65 8,56 ns polifenoli totali mg/l ns polifenoli totali mg/l 74 a 77 ab 82 b * catechine p-daa mg/l 27,9 a 27,7 a 3,5 b * catechine p-daa mg/l 7,4 7,4 7,9 ns abella n.1: Valori medi dei principali parametri chimici, considerando i vini singolarmente, dopo 6 mesi di conservazione in bottiglia. Lettere diverse indicano tesi significativamente diverse tra di loro. In figura n.2 sono riportati i risultati dei controlli analitici dei vini ortese ed Arneis dell annata 11 per quanto riguarda il contenuto in glucosio e mannosio in forma polimerica mg/l Arneis b a c a b glucosio mannosio glucosio mannosio c mg/l ortese b a a ab b a glucosio mannosio glucosio mannosio 6 mesi 12 mesi 6 mesi 12 mesi igura n.2. enori in glucosio e mannosio in forma polimerica dopo 6 e 12 mesi di bottiglia, considerando i vini singolarmente. L affinamento sur lies ha provocato un significativo incremento del contenuto in mannosio in forma polimerica dei vini rispetto sia alla tesi testimone che a quella affinata a contatto con le cellule di lievito. Inoltre, il contenuto in mannosio risulta significativamente più elevato nei vini Arneis rispetto ai vini ortese. I risultati dopo 12 mesi di bottiglia sono simili a quelli ottenuti dopo 6 mesi di bottiglia. Per quanto riguarda il contenuto in glucosio, le differenze non raggiungono mai la soglia della significatività statistica nei vini ortese ed Arneis elaborati separatamente. I vini della tesi testimone presentano contenuti medi minori rispetto alle altre 2 tesi, le differenze tra i valori medi tendono a ridursi passando da 6 a 12 mesi di bottiglia. omposizione in sostanze volatili. I controlli del quadro aromatico dei vini ortese ed Arneis effettuati nel corso delle vendemmie 8 e 9 hanno consentito di evidenziare che le maggiori differenze compositive tra i vini delle diverse prove riguardano essenzialmente i composti di fermentazione ed, in particolare gli acidi grassi a media catena e i rispettivi esteri etilici. Non è stato possibile evidenziare importanti differenze compositive per quanto riguarda i composti di origine varietale e prefermentativa presenti nei vini. Nei primi mesi di affinamento si rileva un aumento della concentrazione di esteri etilici ed acidi grassi a media catena nelle tesi conservate su fecce fini e aggiunte di cellule. Nei vini Arneis si assiste ad una marcata riduzione del contenuto in acidi grassi a media catena nelle tesi sur lies nel corso della conservazione e tale riduzione sembrerebbe direttamente legata al grado di lipofilia delle molecole; il comportamento degli esteri etilici non risulta, invece, univoco nel corso delle due annate. Per questi composti l effetto dell aggiunta di cellule di lievito risulta complessivamente meno marcato rispetto all effetto dell affinamento sur lies. 6

7 Interessante è l andamento nel corso della conservazione del contenuto in acetati degli alcoli superiori. Questi composti, cui sono attribuite note fresche e fruttate, sono prodotti in abbondanti quantità dai lieviti in fase fermentativa e tendono spontaneamente ad idrolizzarsi; tale idrolisi appare più rapida nei vini conservati sur lies e riguarda, in particolar modo, l isoamilacetato e l esilacetato. Analisi sensoriale. In figure n. 3 e 4 sono riportati, a titolo esemplificativo, rispettivamente i risultati dell analisi sensoriale dei vini ortese ed Arneis dopo 6 mesi di conservazione in bottiglia. I vini ortese affinati sur lies () presentato un maggiore volume in bocca e una maggiore persistenza e note olfattive mediamente più intense di agrumi e fiori di acacia. Le differenze tra le tesi tendono a ridursi nel corso della conservazione. Meno marcate risultano le differenze tra i vini Arneis. equilibrio giallo paglierino 6 5 fiori d'acacia * volume in bocca, persistenza 3 agrumi morbidezza 1 pomacee amaro pesca acidità frutta esotica vegetale caramellizzato igura 3. Grafico a radar del profilo sensoriale dei vini ortese 9, dopo 6 mesi di bottiglia. giallo paglierino 5 equilibrio riflessi giallo-verdognoli persistenza 25 fiorale morbidezza agrumi amaro pomacee * acidità vegetale igura 4. Grafico a radar del profilo sensoriale dei vini Arneis 9, dopo 6 mesi di bottiglia. 7