Corso di Laurea in Farmacia Insegnamento di BIOCHIMICA. Angela Chambery Lezione 21

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1 Corso di Laurea in Farmacia Insegnamento di BIOCHIMICA Angela Chambery Lezione 21

2 La replicazione del DNA Concetti chiave: La DNA polimerasi necessita di uno stampo e di inneschi (i primer) per sintetizzare il DNA. Il DNA a doppio filamento viene replicato in modo semidiscontinuo. La DNA polimerasi possiede attività esonucleasica 3 5 e, nel caso della Pol I, attività esonucleasica 5 3. La replicazione del DNA necessita di proteine aggiuntive per separare i filamenti del DNA, svolgere l elica, legare il DNA a singolo filamento e sintetizzare gli inneschi di RNA. Una pinza di scorrimento si aggancia allo stampo di DNA per aumentare la processività della DNA polimerasi. La replicazione completa del DNA richiede la presenza della DNA ligasi, di un fattore di terminazione e della topoisomerasi. I livelli bilanciati dei nucleotidi, il meccanismo della polimerasi, la sua attività come correttore di bozze, e le attività degli enzimi di riparazione del DNA contribuiscono all accuratezza della replicazione del DNA.

3 La replicazione del DNA Mappa del cromosoma di E. coli in cui sono indicate le posizioni dei geni che codificano proteine importanti per il metabolismo del DNA

4 L esperimento di Meselson e Stahl L esperimento di Meselson e Stahl (1957) dimostrò che la replicazione del DNA è semiconservativa. E possibile visualizzare il DNA marcato con 14 N e 15 N separato con centrifugazione in un gradiente di densità di cloruro di cesio. Fotografia dopo irradiazione con luce UV Analisi densitometrica

5 L esperimento di Meselson e Stahl

6 La replicazione del DNA John Cairns, mediante marcatura con trizio ( 3 H) dimostrò che entrambe le catene vengono replicate contemporaneamente (la catena nuova èin rosso).

7 La replicazione dei cromosomi batterici è bidirezionale Entrambe le estremità delle anse hanno forcelle di replicazione. Le anse di replicazione iniziano sempre in un punto preciso, chiamato origine.

8 La replicazione del DNA La sintesi del DNA avviene in direzione 5 3 ed è semidiscontinua. Catene di DNA a livello della forcella di replicazione

9 Enzimi che degradano il DNA Gli enzimi che degradano specificamente il DNA sono chiamati nucleasi o Dnasi. Le esonucleasi degradano il DNA a partire da un estremità della molecola. Alcuni enzimi possono operare solo in direzione 5 3, altri in direzione 3 5, rimuovendo rispettivamente i nucleotidi a partire dall estremità 5 o dall estremità 3 di una catena di acido nucleico a doppia elica. Le endonucleasi agiscono sulla porzione interna degli acidi nucleici, degradandoli in frammenti sempre più piccoli. Alcune importanti endonucleasi (es. enzimi di restrizione) effettuano tagli solo in corrispondenza di specifiche sequenze nucleotidiche.

10 Le endonucleasi di restrizione tagliano a livello di siti di riconoscimento specifici Ligasi

11 Il DNA viene sintetizzato dalle DNA polimerasi Arthur Kornberg nel 1955 purificò e caratterizzò la prima DNA polimerasi di E. coli. Questo enzima a singola catena polipeptidica è ora chiamato DNA polimerasi I. In seguito si è scoperto che E. coli contiene almeno altre quattro DNA polimerasi. La DNA polimerasi catalizza la formazione dei ponti fosfodiestere

12 Il DNA viene sintetizzato dalle DNA polimerasi La reazione di allungamento della catena, catalizzata dalla DNA polimerasi, procede attraverso un attacco nucleofilico del gruppo ossidrilico terminale 3 OH del primer sull atomo di fosforo più interno (gruppo fosforico α) di un deossiribonucleoside trifosfato.

13 Il DNA viene sintetizzato dalle DNA polimerasi (dnmp) n + dntp (dnmp) n+1 + PP i DNA DNA allungato di un nucleotide

14 Il DNA viene sintetizzato dalle DNA polimerasi Tutte le DNA polimerasi necessitano di uno stampo. Tutte le DNA polimerasi necessitano di una molecola di innesco o primer. Il numero medio di nucleotidi aggiunti prima che la polimerasi si dissoci determina la sua processività. Le diverse DNA polimerasi sono caratterizzate da processività molto variabili.

15 Il frammento di Klenow della DNA polimerasi I Sono note le strutture tridimensionali di molte DNA polimerasi. La prima struttura determinata è stata quella del cosiddetto frammento di Klenow della DNA polimerasi I di E. coli. Questo frammento comprende le due parti principali dell enzima, l unità con attività polimerasica e l unità con attività esonucleasica 3 5.

16 Tutte le DNA polimerasi hanno proprietà strutturali simili Le DNA polimerasi sono notevolmente simili nella loro forma generale. I domini dita e pollice si avvolgono intorno al DNA e lo tengono in posizione in modo che possa attraversare il sito attivo dell enzima, costituito principalmente da residui del dominio palmo. Oltre al dominio con attività polimerasica, il frammento di Klenow comprende un dominio con attività esonucleasica in direzione 3 5. Tutte le polimerasi catalizzano lo stesso tipo di reazione, che dipende dalla presenza di ioni metallici.

17 Alla reazione di polimerizzazione partecipano due ioni metallici Come tutti gli enzimi i cui substrati sono nucleosidi trifosfato, le DNA polimerasi richiedono ioni metallici (generalmente Mg 2+ ) per il loro funzionamento. Uno ione metallico lega i deossinucleosidi trifosfato (dntp) e il gruppo ossidrilico in posizione 3 del primer. Entrambi gli ioni metallici interagiscono con il gruppo carbossilico di due residui di aspartato del dominio palmo della polimerasi, che contribuiscono a mantenere gli ioni nella giusta posizione.

18 Alla reazione di polimerizzazione partecipano due ioni metallici Lo ione metallico legato al primer attiva il gruppo ossidrilico 3, facilitando l attacco nucleofilo al gruppo fosforico α del dntp. I due ioni metallici stabilizzano la carica negativa che si accumula nello stato di transizione pentacoordinato. Lo ione metallico inizialmente legato al dntp stabilizza la carica negativa sul pirofosfato che viene prodotto.

19 La replicazione del DNA è fedele La replicazione del DNA deve procedere con un grado elevato di precisione. In E. coli viene commesso un errore ogni nucleotidi aggiunti. Nel caso del cromosoma di E. coli, lungo circa 4,6 x 10 6 coppie di basi, questo significa un errore ogni replicazioni. Durante la polimerizzazione, la distinzione tra nucleotidi corretti e sbagliati consiste non solo nei legami idrogeno che conducono ad un corretto appaiamento tra basi complementari, ma anche nel riconoscimento della geometria delle coppie di basi A=T e G C. Le coppie standard A=T e G C hanno una geometria molto simile

20 La replicazione del DNA è fedele La geometria di coppie di basi sbagliate le esclude dal sito attivo perché la DNA polimerasi I ha un sito attivo in cui tali coppie non possono entrare.

21 La replicazione del DNA è fedele Il legame di un nucleoside trifosfato (NTP) alla DNA polimerasi, induce un cambio conformazionale che genera una tasca dove possono alloggiare il nucleotide e il suo complementare sul filamento stampo. Questo cambiamento conformazionale può avvenire solo se il nucleotide da aggiungere corrisponde a quello complementare sul filamento stampo secondo l appaiamento di Watson e Crick.

22 La replicazione del DNA è fedele Tra i meccanismi che contribuiscono ad aumentare la fedeltà della replicazione del DNA da parte delle DNA polimerasi vi sono i legami idrogeno formati da alcuni residui dell enzima con le coppie di basi presenti nel solco minore che si trova in contatto con il sito attivo. Nella scanalatura minore gli accettori di legami idrogeno si trovano sempre nelle stesse posizioni in tutti gli appaiamenti di basi del tipo Watson e Crick. Questi legami idrogeno che si stabiliscono tra l enzima ed il substrato agiscono come righello graduato che misura se nel sito attivo si viene a trovare un appaiamento di basi con una corretta disposizione spaziale.

23 La replicazione del DNA è fedele Accurati studi in vitro hanno dimostrato che le DNA polimerasi inseriscono un nucleotide sbagliato ogni Spesso tali errori accadono perché i nucleotidi si presentano per breve tempo in una forma tautomerica insolita che permette la formazione di legami idrogeno con una base normalmente non complementare. L attività esonucleasica 3 5 (proofreading o di correzione delle bozze) delle DNA polimerasi serve a ridurre questa frequenza di errori.

24 Correzione di bozze La catena polinucleotidica in formazione abbandona occasionalmente il sito polimerasico della DNA polimerasi I e si sposta verso il sito esonucleasico. Il meccanismo di correzione di bozze si basa sul fatto che l estremità di un filamento in corso di sintesi contenente un nucleotide erroneamente appaiato ha una maggiore probabilità di abbandonare il sito attivo della polimerasi e di avvicinarsi al sito esonucleasico.

25 E. coli possiede almeno cinque DNA polimerasi Combinando l attività proofreading e la selezione delle basi, una DNA polimerasi commette circa 1 errore ogni coppie di basi. La maggiore precisione riscontrata nella replicazione del DNA di E. coli èdovuta all azione degli enzimi del riparo. Nel 1969 John Cairns isolò un ceppo batterico in cui il gene della DNA polimerasi I era mutato e l enzima prodotto era inattivo. Il ceppo, sebbene più sensibile all azione di agenti che danneggiano il DNA, era vitale!

26 E. coli possiede almeno cinque DNA polimerasi La DNA polimerasi II ha una funzione altamente specializzata nel riparo del DNA. La DNA polimerasi III èil più importante enzima della replicazione di E. coli. Le DNA polimerasi IV e V, isolate nel 1999, sono coinvolte in un particolare processo di riparazione, la riparazione soggetta ad errori o risposta SOS.

27 DNA polimerasi I La DNA polimerasi I ha una serie di funzioni di pulizia durante la replicazione, la ricombinazione e il riparo. La DNA polimerasi I di E. coli è provvista di attività esonucleasica 3 5. La DNA polimerasi I è l unica DNA polimerasi di E. coli provvista di attività esonucleasica 5 3.

28 DNA polimerasi I Quando la regione contenente l attività esonucleasica 5 3 della DNA polimerasi I viene rimossa mediante un blando trattamento con proteasi, il frammento rimanente (Mr = ) mantiene l attività polimerasica e di proofreading e viene chiamato frammento di Klenow.

29 Nick translation, una attività della la DNA polimerasi I L attività 5 3 esonucleasica della DNA polimerasi I è in grado di degradare una catena di RNA o di DNA legata allo stampo e di sostituire simultaneamente la catena degradata con l attività polimerasica. L interruzione (nick) viene poi eliminata ad opera di una DNA ligasi

30 Confronto tra le polimerasi

31 DNA polimerasi III La DNA polimerasi III èmolto più complessa della DNA polimerasi I. La sua struttura multimerica comprende diverse subunità con massa di circa 900 kda. Le attività di polimerizzazione e di proofreading risiedono in due subunità diverse, le subunità α e ε rispettivamente. Proofreading Polimerizzazione La subunità θ associata con α e ε forma il nucleo della polimerasi, in grado di sintetizzare il DNA anche se con bassa processività (numero di nucleotidi aggiunti prima che l enzima si dissoci). Due nuclei αεθ si organizzano a costituire un dimero asimmetrico. Una subunità τ2 è associata con una parte dell enzima; una subunità γ2 e le subunità (δδ χψ)2 sono dall altra parte.

32 DNA polimerasi III La processività èconferita dalle subunità β2 e τ2. Le due subunità β della DNA polimerasi III di E. coli formano una struttura a forma di ciambella che avvolge il DNA e agisce come una pinza. Ciascuno dei dimeri di subunità β si associa con un core cataliticamente attivo e scivola lungo il DNA con il procedere della replicazione.

33 DNA polimerasi III La pinza formata dalle subunità β aumenta la processività della polimerasi fino a volte perché evita la dissociazione dell enzima.

34 L elicasi svolge il DNA

35 L elicasi svolge il DNA Inizialmente i domini A1 e B1 legano entrambi DNA a singolo filamento. In seguito al legame dell ATP la tasca tra i due domini si chiude e il dominio A1 scivola lungo il DNA. Dopo l idrolisi dell ATP la tasca si apre, spostando il DNA dal dominio B1 al dominio A1. Man mano che il processo si ripete, il DNA a doppio filamento si srotola. Lo srotolamento locale rende accessibili i filamenti stampo per la replicazione e, allo stesso tempo, genera nella molecola una tensione tale da causare il superavvolgimento delle regioni vicine su cui agiscono le topoisomerasi.

36 SSB impedisce al ssdna di riappaiarsi SSB complessata a dc(pc) 34 PDBid 1EYG

37 Architettura del replisoma Le elicasi si muovono lungo il DNA e separano le catene usando l energia dell ATP. Le topoisomerasi risolvono la tensione topologica nella struttura ad elica del DNA che si genera con la separazione delle catene. Le proteine che legano il DNA a singolo filamento (SSBP) stabilizzano le catene separate. Le primasi sintetizzano i primer (generalmente brevi frammenti di RNA). La DNA polimerasi I rimuove i primer e li sostituisce con DNA. Le DNA ligasi riparano le interruzioni dei legami fosfodiesterici che rimangono dopo l azione della DNA polimerasi I.

38 La replicazione del DNA Inizio Allungamento Termine oric, origine della replicazione di E. coli (245 bp)

39 La replicazione del DNA Inizio Allungamento Termine I monomeri di DnaA si legano ai loro siti di legame per il DNA nell oric, formando una struttura complessa a forma di esamero. Questa struttura segnala l inizio della replicazione e favorisce la separazione dei filamenti di DNA.

40 La replicazione del DNA Inizio Allungamento Termine La DnaA si lega alle sequenze ripetute ricche in AT e le denatura attraverso una reazione che richiede ATP. La proteina DnaB si lega a questa regione denaturata con una reazione che richiede DnaC. Due esameri di DnaB, che funzionano come elicasi, disavvolgono il DNA in entrambe le direzioni, creando due potenziali forcelle di replicazione.

41 La replicazione del DNA L origine della replicazione è influenzata dalla metilazione del DNA da parte della metilasi Dam (5 GAmTC 3 ). La regione oric dell elica neosintetizzata è emimetilata ed interagisce con la membrana plasmatica. La regione oric deve essere nuovamente metilata dalla Dam metilasi prima che possa legare nuovamente DnaA e iniziare la replicazione.

42 La replicazione del DNA Inizio Allungamento Termine La sintesi della catena veloce incomincia con la sintesi da parte di una primasi (DnaG) di un breve primer di RNA (da 10 a 60 nucleotidi) all origine della replicazione. I deossiribonucleotidi vengono poi aggiunti al primer da parte della DNA polimerasi III.

43 La replicazione del DNA Inizio Allungamento Termine Una volta iniziata, la sintesi della catena veloce procede in modo continuo, avanzando di pari passo con la forcella di replicazione. La sintesi della catena lenta viene compiuta tramite corti frammenti di Okazaki.

44 La replicazione del DNA Inizio Allungamento Termine Inizialmente il primer è sintetizzato dalla primasi. Come nella sintesi della catena veloce, la DNA polimerasi III si lega al primer e aggiunge deossiribonucleotidi.

45 La replicazione del DNA Inizio Allungamento Termine Il DNA della catena lenta si piega ad anello, di modo che i due percorsi di polimerizzazione possano procedere insieme.

46 La replicazione del DNA Inizio Allungamento Termine La complessità della replicazione sta nel coordinamento della sintesi delle due catene: entrambe le catene sono prodotte contemporaneamente da un singolo dimero asimmetrico della DNA polimerasi III.

47 La replicazione del DNA

48 La replicazione del DNA

49 La replicazione del DNA Inizio Allungamento Termine Quando il frammento di Okazaki neosintetizzato è completo, il primer viene rimosso dalla DNA polimerasi I e rimpiazzato da DNA. L interruzione che rimane viene ricucita dalla DNA ligasi.

50 La replicazione del DNA Inizio Allungamento Termine La DNA ligasi catalizza la formazione di un legame fosfodiesterico tra l ossidrile all estremità 3 di una catena di DNA e il fosfato all estremità 5 di un altra catena. Il fosfato deve essere attivato tramite adenilazione.

51 Inizio Allungamento Termine Le reazioni catalizzate dalla DNA ligasi

52 Inizio Allungamento Termine Le reazioni catalizzate dalla DNA ligasi

53 Inizio Allungamento Termine Le reazioni catalizzate dalla DNA ligasi

54 Terminazione della replicazione Inizio Allungamento Termine Le due forcelle di replicazione del cromosoma circolare di E. coli si incontrano in una regione terminale contenente copie multiple di una sequenza di 20 coppie di basi detta Ter ( termine ). La proteina Tus (terminus utilization substance) lega la sequenza Ter. Quando una delle due forcelle di replicazione incontra un complesso funzionale Tus Ter, si ferma; l altra forcella si ferma quando incontra la prima forcella già ferma.

55 Formazione e separazione dei cromosomi a forma di catena A replicazione avvenuta, i due cromosomi figli rimangono intersecati, e non possono separarsi perché entrambi sono chiusi covalentemente. In E. coli, la separazione richiede l azione dell enzima topoisomerasi IV, che separa i due cromosomi intersecati rompendo temporaneamente entrambe le catene di uno dei cromosomi e permettendo all altro di passare attraverso l interruzione.

56 La replicazione del DNA negli eucarioti Concetti chiave: La replicazione del DNA eucariotico richiede DNA polimerasi con diversi gradi di precisione e processività. I complessi di pre replicazione si assemblano a livello di origini multiple distribuite all interno dell intero genoma eucariotico. La telomerasi utilizza un RNA stampo per estendere le estremità 3 dei cromosomi eucariotici.

57 La replicazione del DNA negli eucarioti Nel lievito le origini della replicazione sono sequenze di circa 150 coppie di basi dette replicatori (o ARS, autonomously replicating sequences). Il DNA eucariotico viene replicato a partire da origini multiple. L inizio della replicazione in tutti gli eucarioti richiede una proteina multimerica, ORC (origin recognition complex), che si lega a numerose sequenze contenute nel replicatore. ORC interagisce ed èregolata da varie altre proteine coinvolte nel controllo del ciclo cellulare eucariotico.

58 La replicazione del DNA negli eucarioti Come i batteri anche le cellule eucariotiche possiedono vari tipi di DNA polimerasi. La replicazione dei cromosomi nucleari è effettuata dalla DNA polimerasi α, dalla DNA polimerasi δ e dalla DNA polimerasi ε.

59 La replicazione del DNA negli eucarioti Gli eventi molecolari della replicazione del DNA sono strettamente correlati con il ciclo cellulare, durante il quale i processi di sintesi di DNA e divisione cellulare (mitosi) sono coordinati in modo che la replicazione di tutte le sequenze del DNA sia completata prima che la cellula entri nella fase successiva del ciclo. La mitosi (M) avviene solo dopo la sintesi del DNA (S). Due intervalli temporali (G1 e G2) separano i due processi.

60 DNA polimerasi eucariotiche La DNA polimerasi α è un enzima multimerico. Una delle subunità ha attività primasica; la subunità maggiore contiene l attività polimerasica. La DNA polimerasi α non è dotata di attività 3 5 esonucleasica di proofreading e probabilmente funziona per la sintesi dei primer per i frammenti di Okazaki. La DNA polimerasi δ è costituita da due subunità. La DNA polimerasi δ è dotata di attività 3 5 esonucleasica, di proofreading e probabilmente è responsabile della sintesi della catena veloce e della catena lenta agendo come un complesso analogo alla DNA polimerasi III batterica.

61 DNA polimerasi eucariotiche La DNA polimerasi δ è associata a una proteina chiamata antigene nucleare della cellula proliferante (PCNA), che sembra avere una funzione analoga a quella della subunità β della DNA polimerasi III di E. coli formando una sorta di pinza circolare che aumenta la processività dell enzima.

62 DNA polimerasi eucariotiche La DNA polimerasi ε è probabilmente coinvolta nella rimozione dei primer dei frammenti di Okazaki (come DNA pol I di E. coli) e nel riparo del DNA. La proteina di replicazione A (RPA) è una proteina che lega il DNA a singola elica e svolge una funzione analoga a quella della proteina SSB di E. coli. Il fattore di replicazione C (RFC) interagisce con PCNA e facilita l assemblaggio dei complessi replicativi attivi.

63 DNA polimerasi La DNA polimerasi è coinvolta nella replicazione del DNA mitocondriale, nell uomo composto da 16,569 basi e e 37 geni (che codificano per 13 polipeptidi, 22 trna e 2 rrna), coinvolti nella produzione di proteine necessarie alla respirazione cellulare. Tutti i polipeptidi prodotti nei mitocondri non sono enzimi completi ma subunità di complessi multimerici utilizzati per il trasporto di elettroni e per la sintesi di ATP.

64 Telomeri Mentre i genomi di quasi tutti i procarioti sono circolari, i cromosomi degli esseri umani e di altri eucarioti sono lineari. E difficile replicare interamente le estremità di un DNA lineare, perché le polimerasi agiscono solo in direzione 5 3. Dopo la rimozione del primer di RNA la catena ritardata avrà quindi una estremità 5 incompleta. Ogni ciclo di replicazione accorcerà ulteriormente il cromosoma. Ciò non avviene perché le sequenze che si trovano all estremità dei cromosomi, dette telomeri (dal greco telos, fine), hanno caratteristiche di sequenza e strutturali particolari. I telomeri proteggono le estremità del DNA dalla degradazione.

65 Telomeri Il DNA telomerico contiene centinaia di ripetizioni in fila di una sequenza di sei nucleotidi ricca in G su uno dei due filamenti (nell uomo AGGGTT). Il filamento ricco in G èleggermente più lungo dell altro e forma ampie anse a doppia elica. Speciali enzimi, le telomerasi, sono necessari per la sintesi dei telomeri. La telomerasi è una trascrittasi inversa specializzata che contiene il proprio stampo di RNA.

66 La trascrittasi inversa La trascrittasi inversa (o DNA polimerasi RNA dipendente o retrotrascrittasi), è un enzima in grado di sintetizzare DNA utilizzando l'rna come stampo di partenza. Si tratta infatti di un enzima caratteristico dei retrovirus (che usano RNA come materiale genetico). Questo enzima trova ampia applicazione nelle biotecnologie ed in particolare in una tecnica conosciuta come RT PCR che consente di ottenere ed amplificare un frammento di DNA a partire da RNA (utile nella costruzione di librerie di cdna).

67 Sintesi del DNA telomerico La telomerasi contiene una molecola di RNA che funziona da stampo per l allungamento del filamento guida. Il filamento guida allungato funziona a sua volta da stampo per l allungamento del filamento ritardato. In tal modo il cromosoma non si accorcerà anche dopo molti cicli di replicazione. Le telomerasi potrebbero rivestire un ruolo chiave nella biologia delle cellule tumorali e nell invecchiamento cellulare.