Interfase. La REPLICAZIONE del DNA

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1 Interfase La REPLICAZIONE del DNA

2 REPLICAZIONE del DNA Doppia elica parentale Il modello di replicazione del DNA ipotizzato da Watson e Crick è basato sulla complementarietà delle basi dei due filamenti polinucleotidici della doppia elica, dovuta alla specificità dei legami a idrogeno tra le basi Nuovo filamento Nuovo filamento Doppie eliche figlie

3 La duplicazione del DNA è -semiconservativa -bidirezionale -semidiscontinua

4 Possibili modelli di replicazione del DNA

5 La duplicazione del DNA è semiconservativa Esperimento di Meselson e Stahl Centrifugazione in gradiente di densità all'equlibrio per distinguere DNA contenente 14 N leggero e 15N pesante

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7 La replicazione del DNA è bidirezionale

8 La replicazione del DNA è bidirezionale

9 La sintesi del DNA durante la replicazione avviene in modo continuo su un filamento e in modo discontinuo sull'altro F u g i B 1. 6 a r L z c p r u A N D l d t i s o e n a i. r a l u t c s d o m n i n o v p l f s u t c d o m n e i v a A v o s P t n e B, i d l a m B m a g l o i r c e n o z i d e a 2 9 A E 2 C C s a n E d i e o r b m t c A Figura 6.16B La neosintesi del DNA durante la replicazione in vivo avviene in modo continuo su un filamento stampo e

10 DNA Polimerasi: attività polimerasica 5'-3' Innesco (primer)dipendente Stampo-dipendente

11 Meccanismo di sintesi del DNA da parte di una DNA polimerasi Watson et al., BIOLOGIA MOLECOLARE DEL GENE, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2005

12 Le DNA Polimerasi hanno bisogno di un gruppo OH in 3' per la loro attività di polimerizzazione 5'-3'

13 Negli organismi procarioti ed eucarioti esistono diverse DNA polimerasi

14 Altri enzimi e proteine che intervengono nel processo di replicazione del DNA

15 DNA ELICASI (DNAB in E.Coli, Complesso Mcm negli eucarioti) denatura la doppia elica del DNA a livello della forcella di replicazione Proteina esamerica con conformazione ad anello, con elevata processività Il rilascio della elicasi dalla doppia elica richiede l apertura della conformazione ad anello Watson et al., BIOLOGIA MOLECOLARE DEL GENE, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2005

16 PROTEINE SSB (Single Strand Binding Protein) si legano al singolo filamento mediante legami con i gruppi fosfato e ne stabilizzano la struttura prima della replicazione Una volta ricoperto di SSB il singolo filamento di DNA assume una conformazione distesa che facilita il suo ruolo di stampo. Watson et al., BIOLOGIA MOLECOLARE DEL GENE, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2005

17 Le SSB si legano in maniera cooperativa al DNA denaturato Watson et al., BIOLOGIA MOLECOLARE DEL GENE, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2005

18 TOPOISOMERASI (I-II) rimuovono i superavvolgimenti positivi prodotti dalla formazione e dal movimento della forcella replicativa Watson et al., BIOLOGIA MOLECOLARE DEL GENE, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2005

19 PRIMASI sintetizza corti primer (20nt) di RNA che servono da innesco per la DNA polimerasi (non ha bisogno di stampo)

20 Duplicazione del DNA nei procarioti: DNA polimerasi III e DNA polimerasi I

21 DNApolimerasi III Struttura oloenzima oloenzima con due centri catalitici, altamente processiva, con attività di proof-reading

22 Attività della DNA Pol III Subunità α: Polimerizzazione 5-3 Subunità ε: attività esonucleasica 3-5 Subunità β:si aggancia al filamento stampo rendendo progressivo

23 Struttura del core dell'enzima della DNA polimerasi (rappresentata come una mano destra legata al complesso innesco/stampo). Ruolo dei cofattori metallici Zn++ e Mg++ Uno ione favorisce la perdita del protone da parte del 3 OH, si forma un 3 O- che può effettuare l attacco nucleofilo nel fosfato alfa. Il secondo ione, coordinando le cariche negative dei fosfati beta e gamma, stabilizza il pirofosfato Watson et al., BIOLOGIA MOLECOLARE DEL GENE, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2005

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25 DURANTE LA REPLICAZIONE POSSONO AVVENIRE DEGLI APPAIAMENTI NON CORRETTI L attività esonucleasica (3-5 ) della DNA Polimerasi III Attività proof-reading (correzione di bozze) Tasso di errore 1:10-7 Subunità epsilon (con attività esonucleasica 3'-5)' Watson et al., BIOLOGIA MOLECOLARE DEL GENE, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2005

26 Sliding clamp o Pinza beta Watson et al., BIOLOGIA MOLECOLARE DEL GENE, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2005

27 Le sliding clamp permettono lo scivolamento della polimerasi sul DNA ed aumentano la processività della DNA polimerasi Watson et al., BIOLOGIA MOLECOLARE DEL GENE, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2005

28 Cosa significa processività di sintesi della DNA polimerasi

29 Meccanismo d' azione della sliding clamp (pinza beta) La sliding clamp assicura il legame del core dell'enzima con l estremità del DNA in crescita. Quando la DNA polimerasi termina la sintesi del filamento neosinterizzato va incontro a cambiamenti conformazionali, diminuisce la sua affinità per la pinza beta, viene quindi rilasciata e si può legare ad un nuovo sito di sintesi

30 Oloenzima procariotico DNA polimerasi III Sottocomplesso gamma Watson et al., BIOLOGIA MOLECOLARE DEL GENE, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2005

31 Le sliding clamp vengono depositate sul DNA da specifici posizionatori Il sottocomplesso gamma funziona da posizionatore della sliding clamp (negli eucarioti l analogo è il fattore RF-C). La sliding clamp viene caricata ogni volta che incontra una regione di DNA con un 3 OH libero e filamento stampo.

32 L oloenzima DNA polimerasi III di E. coli è - per le sue caratteristiche strutturali/ funzionali- la replicasi che agisce a livello della forca replicativa Watson et al., BIOLOGIA MOLECOLARE DEL GENE, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2005

33 DNA Polimerasi I Frammento di Okazaki

34 DNA polimerasi I attività di proof-reading3'-5' attività polimerasica 5'-3' attività esonucleasica 5-3 ( rimozione dei primers a RNA dei frammenti di Okazaki ). Enzima monomerico con tre diversi domini funzionali. Scarsamente processivo

35 Figura 6.16A La neosintesi del DNA durante la replicazione in vivo avviene in modo continuo su un filamento stampo e in modo discontinuo sull altro. Amaldi, Benedetti, Pesole, Plevani Biologia molecolare - 2a edizione CEA - Casa Editrice Ambrosiana

36 Figura 6.19C Assemblaggio della DNA polimerasi III oloenzima sul DNA. Amaldi, Benedetti, Pesole, Plevani Biologia molecolare - 2a edizione CEA - Casa Editrice Ambrosiana

37 Meccanismo di replicazione del DNA

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39 Assemblaggio del replisoma e modalità di funzionamento N.B. l interazione tra l oloenzima e l elicasi mediata dalle proteine tau (che collegano il posizionatore della pinza beta con i due core della DNA polimerasi). L elicasi è quindi il motore che traina il replisoma Watson et al., BIOLOGIA MOLECOLARE DEL GENE, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2005

40 Watson et al., BIOLOGIA MOLECOLARE DEL GENE, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2005

41 L elicasi interagisce contemporaneamente con le due subunità core della DNA pol attraverso le proteine tau. L esistenza di una giunzione flessibile (nelle proteine tau) rende possibile questa interazione contemporanea, e regola il movimento del replisoma. Watson et al., BIOLOGIA MOLECOLARE DEL GENE, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2005

42 Schema rissuntivo sulla sintesi del filamento veloce e ritardato del DNA

43 Le DNA polimerasi eucariotiche possiedono ruoli differenti all interno della cellula

44 LE CELLULE EUCARIOTE POSSIEDONO DIVERSI TIPI DI DNA POLIMERASI DNA Polimerasi α attività primasica e polimerasica DNA Polimerasi δ attività polimerasica e Eso 3 5 DNA Polimerasi ε attività polimerasica e rimuove i DNA Polimerasi γ presente nei mitocondri DNA Polimerasi β primers a RNA processi di riparazione del DNA? Watson et al., BIOLOGIA MOLECOLARE DEL GENE,

45 Negli eucarioti a livello della forcella replicativa vengono reclutate diverse polimerasi La polimerasi alfa ha attività primasica, bassa processività e manca di attività proof-reading (viene implicata soltanto nelle fasi iniziali) Le polimerasi delta ed epsilon sono coinvolte nella replicazione delle due eliche stampo, possiedono elevata processività (interagiscono con la PCNA = sliding clamp) ed attività di proof-reading Watson et al., BIOLOGIA MOLECOLARE DEL GENE, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2005

46 Principali proteine che agiscono sulla forcella di replicazione dei cromosomi eucariotici Figura 6.22B La visione più attuale delle principali proteine che agiscono su una forcella di replicazione in SV40 e sui cromosomi degli eucarioti. Amaldi, Benedetti, Pesole, Plevani Biologia molecolare - 2a edizione CEA - Casa Editrice Ambrosiana

47 Inizio della Replicazione del DNA Il sito (o i siti) del DNA in cui inizia la replicazione si chiamano origine di replicazione La lunghezza totale del DNA replicato a partire da un'orgine è chiamata replicone Una volta iniziata, la replicazione di un cromosoma non si arresta e sia il cromosoma che la cellula sono indirizzati verso la divisione.

48 Il genoma delle cellule procariote costituisce un unico replicone Negli eucarioti ogni cromosoma è diviso in numerosi repliconi (I repliconi degli eucarioti sono lunghi Kb)

49 Perché venga replicato, un replicone deve possedere un replicatore (regione del DNA) il quale deve essere riconosciuto da un iniziatore (di natura proteica) Watson et al., BIOLOGIA MOLECOLARE DEL GENE, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2005

50 Watson et al., BIOLOGIA MOLECOLARE DEL GENE, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2005

51 Siti di origine della replicazione di diversi organismi Il replicatore comprende siti di legame (sequenze di DNA) per l iniziatore, e siti (sequenze di DNA) facilmente denaturabili Watson et al., BIOLOGIA MOLECOLARE DEL GENE, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2005

52 ORIGINE DI REPLICAZIONE in E.coli) 3 regioni di 13bp GATCTNTTTATTT GATCTNTTNTATT GATCTCTTATTAG 4 regioni di 9bp TGTGGATAA TTATACACA TTTGGATAA TTATCCACA Watson et al., BIOLOGIA MOLECOLARE DEL GENE, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2005

53 Le DnaA, si legano ai 4 siti da 9bp di oric e oligomerizzano La formazione del complesso chiuso: porta alla denaturazione delle regioni oric da 13bp Hu Le elicasi (Dna B) sono veicolate dalla proteina Dna C Figura 6.18B Inizio della replicazione del DNA in E. coli Amaldi, Benedetti, Pesole, Plevani Biologia molecolare - 2a edizione CEA - Casa Editrice Ambrosiana

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55 Controllo dell'inizio della duplicazione Attraverso la metilazione del DNA DNA Adenina Metiltransferasi: (metila N6Adenina) Watson et al., BIOLOGIA MOLECOLARE DEL GENE, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2005

56 Nel genoma di E.coli esistono diverse sequenze GATC (metilate) nella regione di OriC Man mano che procede la replicazione diventano emi-metilate. Alle GATC emimetilate si lega la proteina SeqA (Seq=sequestro) che impedisce il ripristino della completa metilazione Watson et al., BIOLOGIA MOLECOLARE DEL GENE, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2005

57 Controllo del reinizio della duplicazione da parte di Dam Metilasi, SeqA e DnaA.

58 Proteine richieste per l'inizio della replicazione in E.coli

59 L origine di replicazione di E.coli è coinvolta anche nel processo di distribuzione dei cromosomi nelle cellule figlie Cromosoma circolare (blu) parzialmente replicato legato alla membrana plasmatica attraverso le origini delle due molecole di DNA figlie. Le origini dei cromosomi replicati hanno siti di attacco alla membrana indipendenti l uno dall altro, per cui seguono la crescita della membrana L origine del setto divide la cellula Ciascuna delle cellule figlie avrà un cromosoma legato alla membrana plasmatica. Watson et al., BIOLOGIA MOLECOLARE DEL GENE, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2005

60 Origini di replicazione negli eucarioti Figura 6.7D Ciascun cromosoma degli organismi eucariotici contiene molteplici origini di replicazione. Amaldi, Benedetti, Pesole, Plevani Biologia molecolare - 2a edizione CEA - Casa Editrice Ambrosiana

61 ORIGINI DI REPLICAZIONE degli Eucarioti a origini di replicazione -Regioni di DNA di lunghezza variabile -Definite da diverse combinazioni di elementi di sequenza. -Non è stata trovata una singola combinazione consensus che definisca un origine.

62 Negli eucarioti le origini di replicazione nonvengono attivate tutte contemporaneamente Una volta attivate, le origini non possono essere ulteriormente attivate (contengono DNA neosintetizzato) Alcune origini sono replicate passivamente (per estensione della/e bolla/e adiacenti); Watson et al., BIOLOGIA MOLECOLARE DEL GENE, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2005

63 La processività della DNA polimerasi varia in relazione alla lunghezza ed al numero dei repliconi Organismo Repliconi Lunghezza Movimento kb bp/min Lievito kb bp/min Drosofila kb bp/min Rospo kb 500 bp/min Topo kb bp/min Piante kb Batterio - Watson et al., BIOLOGIA MOLECOLARE DEL GENE, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2005

64 ORIGINE DELLA REPLICAZIONE in S. CEREVISIAE Il melting (denaturazione) della doppia elica avviene nel sub-dominio B2, ed è indotto dal legame di ABF1 al sub-dominio B3. Le proteine del complesso di riconoscimento dell'origine (ORC) sono legate ai sub-domini A e B1.

65 Tutte le origini di replicazione degli eucarioti sinora identificate mostrano proprietà simili Sono segmenti di DNA che contengono brevi sequenze ripetute multiple Queste sequenze vengono riconosciute e legate da proteine multimeriche specifiche, che giocano un ruolo chiave nell attivazione dell origine e nel successivo assemblaggio delle DNA polimerasi Le regioni dell origine contengono sequenze ricche in AT (appaiamenti che facilitano la denaturazione del DNA) Watson et al., BIOLOGIA MOLECOLARE DEL GENE, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2005

66 CICLO CELLULARE E REPLICAZIONE NEGLI EUCARIOTI Ogni fase del ciclo cellulare è sottoposta a controllo da parte di cicline associate a specifiche chinasi. Watson et al., BIOLOGIA MOLECOLARE DEL GENE, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2005

67 ORI Complesso di Riconoscimento dell'origine Cdc6 e Cdt1 interagiscono con ORC e sono implicate nel caricamento della elicasi (Mcm2-7) Complesso prereplicativo (Pre-RC) [G1]

68 post-rc Cdk:Cyclin-Dependent Kinase

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70 Terminazione della duplicazione nei procarioti

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72 TUS è una controelicasi, cioè impedisce alla doppia elica di DNA di denaturarsi bloccando la progressione della forcella di replicazione

73 In E. coli la decatenazione è catalizzata dalla Topoisomerasi IV. Watson et al., BIOLOGIA MOLECOLARE DEL GENE, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2005

74 Terminazione dei repliconi lineari

75 I telomeri sono costituiti da di ripetizioni in tandem di corte sequenze ricche in TG, localizzate alle estremità dei cromosomi, che variano nel tempo per un fenomeno di estensione-contrazione: (TTGGGG)n in Tetrahymena, (TTAGGG)n nei mammiferi. Le sequenze telomeriche vengono sintetizzate dall'enzima telomerasi

76 La TELOMERASI è espressa: -In tutte le cellule durante lo sviluppo -Nelle cellule staminali e nelle cellule proliferanti nell'età adulta Assenza di telomerasi: progressivo accorciamento dei telomeri (la cellula entra in senescenza dopo un numero critico di duplicazioni: Limite di Hayflick) Nel 90% dei tumori:riattivazione della telomerasi (immmortalizzazione cellulare)

77 Telomerasi - Componente a RNA (TERC) - Componente proteica (TERT) con attività di trascrittasi inversa: estende l estremità 3'in maniera indipendente dallo stampo di DNA. Watson et al., BIOLOGIA MOLECOLARE DEL GENE, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2005

78 Meccanismo d'azione della telomerasi

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80 Estremità telomeriche: T-Loop

81 Figura 6.25 Conservazione distributiva dei nucleosomi su una forcella di replicazione. Amaldi, Benedetti, Pesole, Plevani Biologia molecolare - 2a edizione CEA - Casa Editrice Ambrosiana