I cromosomi. I cromosomi. Modello di Saitoh and Laemmli. Anse piccole scaffold Banda G Banda R Banda G Anse grandi. SARs AT-rich.

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1 I cromosomi I cromosomi 1400 nm Modello di Saitoh and Laemmli Anse di cromatina piccole o lunghe G loops R loops G loops R loops Protein scaffold SARs AT-rich Scaffold AT-queue Chromatid fibers Anse piccole scaffold Banda G Banda R Banda G Anse grandi Banda R 1

2 Cromosoma mitotico Eliminazione degli istoni DNA Proteine istoniche Proteine non istoniche (RNA) Organizzazione di un cromosoma umano Tel ORI centromero Tel DNA SINE gene LINE gene gene gene Centromero: DNA altamente ripetuto (es: alfa satellite) Sequenze telomeriche: (TTAGGG)n Origini di : poco conosciute SINE: Short INterspersed Elements (ca. 300 bp) Es: AluI LINE: Long INterspersed Elements (ca bp) Es: L1 Matrice proteica DNA con domini ad anse Funzioni biologiche dei cromosomi Contenere l informazione genetica I geni stanno nei cromosomi Corretta distribuzione del materiale genetico durante la divisione cellulare Si formano i cromosomi mitotici Rimescolamento del materiale genetico durante la formazione dei gameti ricombinazione meiotica segregazione degli omologhi Origini di Sequenze specifiche associate al punto di inizio della sintesi del DNA Sono riconosciute da proteine che legano e destabilizzano il DNA La destabilizzazione apre il DNA in corrispondenza dell'gine di Origine di in E. coli Origine di Replicazione in E. coli Origine di C: 300 bp contenente sequenze ripetute di 9 e 13 bp (9-meri e 13-meri) 13-meri 9-meri Geni Sequenze ripetute Dna A: lega ATP e si associa in molte copie ai 9-meri inducendo lo svolgimento del DNA in corrispondenza dei 13-meri (ricchi in A-T) 2

3 Inizio della Origine di nei lieviti DNA-A Si lega ai 9-meri Complesso DNA-B/DNA-C Il DNA si apre in corrispondenza dei 13-meri Una elicasi estende la regione denaturata ARS: Autonomously Replicating Sequences sequenza di bp la regione consenso (11 bp) é ricca in A-T le sequenze fiancheggianti presentano variazioni La RNA polimerasi riconosce sequenze promot fiancheggianti le ARS in S. pombe sono presenti circa 400 ARS elicasi DNA-B Diversi sottogruppi di ARS sono attivati in tempi diversi DNA polimerasi + altri fatt le ARS inducono la di sottoregioni del cromosoma in un ordine definito regioni a precoce regioni a tardiva Origine di negli eucarioti superi Non ancora identificate ARS per mancanza di un test genetico valido Probabilmente le gini di r eplicazione sono composte da elementi dispersi in regioni molto lunghe Sequenza consenso identificata in diverse gini di WAWTTDDWWWDHWGWHMAWTT dove: W=A/T D=A/G/T H=A/C/T M=A/C Sono molto vicine a promot trascrizionali Condividono sequenze di promot trascrizionali Un gruppo di proteine che legano il CAAT box possono sia iniziare la trascrizione che la Proteine che si legano agli "enhancer" regolano sia la trascrizione che la La RNA polimerasi che trascrive un breve tratto di RNA favsce la denaturazione del DNA necessaria per l'inizio della Origini di cromosoma 100 Kb nel genoma umano cromatidi fratelli G1 S G2 Attivazione dei repliconi nel corso dello sviluppo Anfibi (Triturus) durata fase S distanza fra repliconi Blastula 1 ora neurula 4-6 ore 40 µm adulto 48 ore cellule germinali prima della meiosi fino a 200 ore 100 µm Drosophila durata della fase S embrioni precoci 3,5 min embrioni avanzati 20 min larve ore La differenza della durata della fase S é correlata al numero di repliconi attivati per unità di lunghezza del cromosoma Bandeggio di Replicazione tardiva Replicazione precoce BrdU 3

4 Elementi essenziali di un cromosoma telomero struttura centromero n /crom. 1 funzione gine di tenere uniti i due cromatidi fino alla mitosi corretta divisione dei cromosomi alla mitosi e alla meiosi stabilizzazione della telomero Origine di 2 funzionalità e della lunghezza del cromosoma molte corretta del DNA Centromero Tiene uniti i cromatidi fratelli di un cromosoma Consente la corretta segregazione dei cromosomi durante la mitosi e la meiosi Il centromero appare come una costrizione in un unico punto lungo il cromosoma. gine di centromero Per ogni cromosoma il centromero é sempre nella stessa posizione. gine di Nella maggior parte degli eucarioti ad ogni centromero si attaccano molte fibre del fuso. Nel lievito S. cerevisiae ad ogni centromero si attacca una sola fibra del fuso. gine di Se il centromero é assente il cromosoma non può attaccarsi al fuso e può solo migrare casualmente durante la divisione cellulare telomero Centromeri in S. cerevisiae Il diametro della regione centromerica centrale corrisponde al diametro della fibra del fuso Centromeri in S. cerevisiae Le sequenze CEN sono lunghe circa 220 bp il nucleo centrale della regione centromerica consiste di tre domini dominio I sequenza conservata di 8-12 bp dominio III dominio II regione di bp con elevato contenuto in AT Centromeri in S. cerevisiae sequenza conservata di 26 bp ricca in AT Centromero negli eucarioti superi Composto da tre domini strutturali dominio di appaiamento dominio I dominio II sequenza regione di conservata di bp con elevato 8-12 bp contenuto in AT cinetocoro dominio III sequenza conservata di 26 bp ricca in AT dominio centrale 4

5 Cinetocoro localizzato sulla superficie esterna di ciascun cromatidio fratello responsabile del movimento dei cromosomi appare come un disco trilaminare con le due piastre esterne più dense della centrale piastra esterna: prende contatto con le fibre del fuso piastra interna: prende contatto con il DNA centromerico proteine specifiche dei centromeri (CENtromere Protein) CENP-A 17 kda alla periferia del cinetocoro: è una variante dell istone H3 che sembra essere responsabile della formazione di una struttura della cromatina centromerica diversa dal resto del cromosoma CENP-C 140 kda alla periferia del cinetocoro; si lega ai microtubuli Cinetocoro CENP-C é responsabile del legame con i microtubuli é direttamente coinvolta nella funzionalità del centromero é presente in uguale quantità in tutti i centromeri umani é assente nei centromeri inattivi CENP-B 80 kda associata all'eterocromatina centromerica del dominio centrale in un CEMP-B box di 17pb Dominio centrale Cromatina centromerica (eterocromatina costitutiva) composta da varie famiglie di DNA altamente ripetuto (DNA satellite) a cui è ancorato il cinetocoro Nell'uomo sono stati identificati: Satellite 1 Satelliti 2 e 3 unità di 42 bp ricche in AT comune a quasi tutti i cromosomi alternanza di due tipi di ripetizioni C 17 bp (ACATAAAATAT G AAAGT) A 25 bp (ACCCAAAAT G T A G TATTATATACTGT) ripetizioni di forme varianti del pentanucleotide (GGAAT)n evolutivamente molto conservati e presenti in tutti i centromeri umani possono legare proteine specifiche Satellite alfa l'unità ripetuta é di 171 bp presente in tutti i centromeri contiene una sequenza di 17 bp che lega CENP-B detta CENP-B box 5' CTTCGTTGGAAACGGGA 3' funzionalmente é il più importante Satellite beta l'unità ripetuta é di 68 bp ricche in GC presente solo in alcuni cromosomi: 1, 3, 9, 13, 14, 15, 21, 22, Y Cromatina centromerica Cromatina centromerica Modello di organizzazione del centromero secondo K. A. CHOO DNA del centromero o C-DNA Sequenze fiancheggianti il centromero Non partecipano alla formazione del legame con le proteine del cinetocoro La loro funzione é poco nota 5

6 Dominio di appaiamento Composto da proteine denominate INCENP (INner CENtromere Protein) strettamente associate ai cromatidi fratelli Cromatidi fratelli Presumibilmente coinvolti in almeno tre processi: - mantenimento dell'appaiamento dei cromatidi fratelli - promozione dello slittamento dei microtubuli all'anafase - partecipazione alla formazione di un anello contrattile durante la citodieresi Telomeri Strutture specializzate che si trovano all'estremità dei cromosomi lineari Sono strutture nucleo-proteiche costituite da: - un breve motivo ripetuto in tandem - alcune proteine non istoniche ( TRF1 e TRF2) Il cromosoma senza telomeri é: instabile: degradato dalle esonucleasi altamente reattivo: tende ad appiccicarsi su altri cromosomi tali interazioni determinano la formazioni di cromosomi aberranti che non possono essere correttamente distribuiti dal fuso mitotico INCENP Sequenze telomeriche la sequenza telomerica é evolutivamente molto conservata Telomero Sequenze telomeriche semplici Il telomero é costituito da un esanucleotide ripetuto migliaia di volte Nell uomo: (TTAGGG)n le ripetizioni dell'esanucleotide hanno lunghezza variabile 2-20 kb Uomo kb Topo 5 3 Accorciamento dei telomeri 3 5 Il telomero si accorcia ad ogni ciclo di divisione cellulare Telomerasi Enzima in grado di allungare il DNA telomerico e impedire il progressivo accorgiamento dei cromosomi Presente nelle cellule germinali e staminali Contiene una molecola di RNA nel sito attivo 6

7 Telomerasi Enzima in grado di allungare il DNA telomerico e impedire il progressivo accorciamento dei cromosomi Presente nelle cellule germinali e staminali Contiene una molecola di RNA nel sito attivo CCCAACCCCAA CCCCAA CCCCAA CCCCAA CCCCAACCCC AACCCC AACC RNA primer Telomeri Strutture specializzate che consentono di distinguere la terminazione naturale di un cromosoma da una non naturale (rottura cromosomica) - le telomerasi non sono attive nelle cellule di mammifero, ad eccezione di: Cellule embrionali nello stadio precoce di sviluppo cellule staminali e cellule riproduttive - le cellule prive di attività telomerasica subiscono un accorciamento dei telomeri ad ogni divisione cellulare - l erosione dei telomeri è un fattore limitante la vita delle cellule ( senescenza cellulare) telomerasi RNA complementare alla sequenza telomerica - il mantenimento dei telomeri contribuisce direttamente all oncogenesi 7