Il superavvolgimento del DNA

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1 Il superavvolgimento del DNA

2 Superavvolgimento del DNA genomico nei procarioti ed eucarioti

3 Plasmide: DNA extracromosomico batterico (circolare) Figura 2.32 DNA circolare rilassato e superavvolto.

4 Il superavvolgimento: Topologia del DNA IL DNA è costituito da due filamenti avvolti a elica intorno ad un asse centrale Il superavvolgimento è l'ulteriore avvolgimento di quell'asse su se stesso (DNA supercoil = DNA superavvolto)

5 Durante i processi che richiedono la separazione dei due filamenti, come la trascrizione e la duplicazione, il DNA si avvolge su se stesso formando superavvolgimenti

6 Figura 2.42 La replicazione e la trascrizione del DNA generano superavvolgimenti della doppia elica. Amaldi, Benedetti, Pesole, Plevani Biologia molecolare - 2a edizione CEA - Casa Editrice Ambrosiana

7 Lo stato superavvolto del DNA cellulare è strettamente controllato. Ogni cellula disavvolge il DNA attivamente attraverso processi enzimatici (Topoisomerasi)

8 Dalla TOPOLOGIA: proprietà delle strutture che si modificano quando sono sottoposte a deformazione formule matematiche che descrivono il DNA superavvolto (modello: DNA circolare covalentemente chiuso= DNAccc)

9 Plasmide: esempio di DNAcircolare covalentemente chiuso (DNAccc) Figura 2.32 DNA circolare rilassato e superavvolto. Amaldi, Benedetti, Pesole, Plevani Biologia molecolare - 2a edizione CEA - Casa Editrice Ambrosiana

10 IL DNA è definito topologicamente dal Numero di legame: Lk (Linking number) proprietà invariante del DNAccc, qualunque sia la struttura geometrica della molecola) Numero di volte che un filamento passa attraverso l'altro Lk DNAccc: è sempre un numero intero ( Numero totale di bp/10.5 numero di basi per giro d'elica)

11 Il numero di legame Lk può essere scomposto in due componenti secondo la equazione Lk= Tw+Wr -Tw (Twist,Torsione) numero di giri della doppia elica rispetto all'asse centrale -Wr (Writhe,Contorsione)numero di volte che l'asse centrale della doppia elica incontra se stesso, formando superavvolgimenti

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13 Se si forza il DNAccc a cambiare il suo Wr, senza tagliare la doppia elica (Lk costante) Lk= Tw+Wr B) E' stato introdotto un giro di superavvolgimento negativo (Wr=-1) aumenta Tw(21) C) E' stato introdotto un giro di superavvolgimento positivo (Wr=+1) diminuisce Tw(19)

14 Variazione del numero di legame Il numero di legame di una molecola di DNAccc può variare quando viene tagliato uno o ambedue i filamenti del duplex, vengono introdotte una o più rotazioni a una estremità e successivamente vengono richiusi covalentemente i due filamenti della molecola circolare

15 Lk= Tw+Wr Variazione del numero di legame Lk (L<L0 ) La molecola di DNA è stata aperta, il Lk ridotto di 2 unità, poi richiusa

16 Variazione del numero di legame Lk (L>L0 ) La molecola di DNA è stata aperta, il Lk aumentato di 2 unità agendo sul twist, poi richiusa

17 Numero di legame applicato a molecola di DNA circolare chiuso di 2100bp Rilassata Lk0=2100/10.5=200 Parzialm. disavvolta di 2 giri: Lk=200-2=198

18 Numero di legame applicato a molecola di DNA circolare chiuso di 2100bp Variazione Lk descritta dalla equazione: Δlk=Lk-Lk0= = -2 Differenza di legame specifica (densità della superelica) σ= Δlk/Lk0 =-2/200= numero di giri eliminati rispetto a quelli presenti nel DNA rilassato Superavvolgimento causato dal parziale disavvolgimento: SUPERAVVOLGIMENTO NEGATIVO

19 σ è la densità di superavvolgimento Il grado di disavvolgimento dei DNA cellulari è compreso tra il 5-7% (σ = ; -0.07) Cioè il DNA cellulare ha il 5% in meno dei superavvolgimenti presenti nella molecola di DNA rilassata Superavvolgimento causato dal parziale disavvolgimento: SUPERAVVOLGIMENTO NEGATIVO

20 Superavvolgimenti negativi e positivi Se Δlk è diverso da 0, la molecola conterrà della tensione e sarà superavvolta Disavvolgimento (underwinding) di 2 giri di elica (Δlk=-2) Superavvolgimento negativo Iperavvolgimento (overwinding) di 2 giri di elica (Δlk=+2) Superavvolgimento positivo La torsione dell'asse del DNA è di segno opposto Due forme di DNA circolare che differiscono esclusivamente per il numero di legame si definiscono topoisomeri

21 IL DNA superavvolto è espressione di una tensione strutturale presente nei DNA cromosomici di tutte le cellule La molecola superavvolta possiede un livello energetico superiore rispetto a quella rilassata. Si può considerare il superavvolgimento come una riserva di energia

22 All'interno della cellula la molecola di DNA deve piegarsi, diventa quindi superavvolta Molti DNA circolari restano superavvolti anche in assenza di proteine e altri componenti cellulari: ciò significa che il superavvolgimento è una proprietà intrinseca della struttura teziaria del DNA Plasmide batterico disavvolto e con diversi gradi di superavvolgimento (m.e.)

23 Il DNA è mantenuto in uno stato in uno stato parzialmente disavvolto A) PER FACILITARNE IL COMPATTAMENTO Plasmide batterico

24 Il DNA è mantenuto in uno stato in uno stato parzialmente disavvolto B) Per favorire l'attività degli enzimi implicati nella separazione delle due semieliche del DNA (duplicazione, trascrizione, etc)

25 Figura 2.42 La replicazione e la trascrizione del DNA generano superavvolgimenti della doppia elica. Amaldi, Benedetti, Pesole, Plevani Biologia molecolare - 2a edizione CEA - Casa Editrice Ambrosiana

26 Cambiamenti strutturali indotti dall'energia libera contenuta nel DNA superavvolto

27 Strutture come ll DNA cruciforme possono essere favorite dalla tensione di superavvolgimento Struttura cruciforme Sequenza palindromica Figura 2.28 Visualizzazione di una struttura cruciforme. Amaldi, Benedetti, Pesole, Plevani Biologia molecolare - 2a edizione CEA - Casa Editrice Ambrosiana

28 La compattazione del DNA richiede un particolare tipo di superavvogimento IL DNA nella forma circolare chiusa può avvolgersi nello spazio in due modi, essenzialmente: se si avvolge attorno a se stesso lo fa generalmente nel modo plectonemico (plektos=ritorto), se si avvolge intorno ad un oggetto, lo fa in modo solenoidale. In soluzione il writhe (superavvolgimento) isomerizza tra le due forme che sono rapidamente convertibili l'una nell'altra, sebbene la forma a solenoide si osservi solo quando si legano al DNA specifiche proteine

29 Superavvolgimento plectonemico

30 Superavvolgimento Solenoidale Nei nucleosomi il DNA è avvolto a spirale con andamento sinistrorso. Gli avvolgimenti sinistrorsi in una spirale equivalgono a superavvolgimenti negativi. L'impacchettamento del DNA nei nucleosomi introduce quindi una densità di superelica negativa

31 DNA positivamente superavvolto Presente in batteri termofili che vivono in ambienti con elevate temperature (sorgenti termali). - Probabile funzione biologica: I superavvolgimenti positivi possono essere considerati delle forme di immmagazzinamento di energia libera che permette di preservare il DNA dalla denaturazione - Possiedono DNA topoisomerasi in grado di introdurre superavvolgimenti positivi

32 Il Superavvolgimento del DNA è controllato dalle topoisomerasi - convertono (isomerizzano) un topoisomero di DNA in un altro modificando il numero di linking (Lk) provocando una interruzione dei legami fosfodiesterici in almeno una delle semieliche del DNA -intervengono nei processi di replicazione, trascrizione, ricombinazione, condensazione e segregazione dei cromosomi (decatenazione)

33 Topoisomerasi di tipo I Creano delle interruzioni transitorie su un solo filamento del DNA ( modificano Lk: +1) Figura 2.40A Struttura e meccanismo d azione delle topoisomerasi di tipo I. Amaldi, Benedetti, Pesole, Plevani Biologia molecolare - 2a edizione CEA - Casa Editrice Ambrosiana di tipo II Creano delle interruzioni transitorie su entrambi i filamenti del DNA (modificano Lk: +2) Figura 2.41A Struttura e meccanismo d azione delle topoisomerasi di tipo II. Amaldi, Benedetti, Pesole, Plevani Biologia molecolare - 2a edizione Non avviene un rilassamento incontrollato della molecola perchè il DNA non si stacca mai dall'enzima 2014 CEA - Casa Editrice Ambrosiana

35 Attività enzimatica della topoisomerasi di tipo I (Legame covalente Tirosina-DNA) legame covalente 5'fosfotirosil DNA

36 Attività enzimatica della topoisomerasi di tipo I (enzima monomerico) Watson et al., BIOLOGIA MOLECOLARE DEL GENE, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2005 La rottura e il ripristino del legame fosfodiesterico non richiede energia. Viene utilizzata l'energia libera contenuta nel DNA superavvolto

38 Topoisomerasi II (dimeri o multimeri) Idrolisi 2molecole ATP necessaria per apertura cancello N (ADNP) Vengono tagliati entrambi i filamenti del DNA con due tirosine (Tyr -Y) covalentemente legate in 5'(legame fosfotirosil in5') Figura 2.41A Struttura e meccanismo d azione delle topoisomerasi di tipo II.

39 Segmento T TOPOISOMERASI II: meccanismo d'azione Segmento G

40 Cancello N Cancello C TOPOISOMERASI di tipo II

41 DNA Topoisomerasi di tipo I IA: Topoisomerasi I e III batterica di tipo II IIA: Topoisomerasi II eucariotica, Topoisomerasi III eucariotica Topoisomerasi dei batteriofagi Girasi inversa* (+ATP) archeobatteri termofili Girasi** dei batteri,archea, cloroplasti IB: Topoisomerasi I eucariotica, poxvirus, batteri Topoisomerasi IV batterica IIB:Topoisomerasi VI (archeobatteri) IC: Topoisomerasi V (archeobatteri) *introduce superavvolgimenti pos ** introduce superavvolgimenti neg e rimuove superavvolgimenti pos

42 Figura 2F1.1 Topoisomerasi, reazioni di rilassamento, catenazione e decatenazione del DNA, introduzione di superavvolgimenti negativi o positivi.