LA GENETICA MOLECOLARE

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1 LA GENETICA MOLECOLARE

2 Obiettivi del corso Studio del genoma Genomica strutturale Genomica funzionale Genomica comparata Studio del trascrittoma Analisi dei profili di espressione Studio del proteoma Proteomica di espressione Proteomica funzionale

3 L era delle omiche Genomica funzionale Genomica CGTCCAACTGACGTCTACAA GTTCCTAAGCT Trascrittomica Proteomica Metabolomica DNA (Geni) RNA PROTEINE Trascrizione Traduzione Reazioni enzimatiche METABOLITI

4 Un pò di nomenclatura Gen Trascritt Prote Metabol ~oma = L insieme di Geni Trascritti Proteine Metaboliti Gen Prote ~omica = Studio e analisi di Genoma Proteoma

5 Genoma Il corredo genetico di ogni individuo Ogni cellula può essere vista come una macchina complessa che esegue delle istruzioni scritte e memorizzate nel proprio genoma

6 Trascrittoma Completo set di trascritti e loro relativi livelli di espressione in particolari cellule o tessuti sotto definite condizioni fisiologiche e/o patologiche e/o in seguito a trattamento (chimico e/o fisico)

7 Proteoma Il proteoma rappresenta l insieme di tutti i possibili prodotti genici, all interno di ogni cellula. Non tutti i geni sono espressi in tutte le cellule Varia nelle diverse cellule, nei diversi tessuti all interno dello stesso organismo e nei differenti stadi di crescita (il proteoma è variabile, il genoma è costante) E condizionato da fattori ambientali, malattie, farmaci, stress, condizioni di crescita (il proteoma è dinamico, il genoma è statico)

8 Le proteine sono la chiave per comprendere la funzione biologica Genome Transcriptome Proteom: The protein complement of genome P Transcription Translation Processing DNA mrna Proteins Modified proteins Biological function ~30,000 Genes >1,000,000 Proteins Each protein associated to 1 function(s) Perchè abbiamo bisogno del proteoma se già conosciamo il genoma? GENOMA: Definisce ciò che può accadere TRASCRITTOMA: Definisce ciò che sta per accadere PROTEOMA: Definisce ciò che sta accadendo

9 Bioinformatica - potenza elaborativa - facilità d uso - creazione di specifici software di analisi, applicazioni ad hoc per risolvere specifici problemi biologici - accesso on-line attraverso il World-Wide Web

10 Il Genoma umano Struttura fisica e contenuto genico

11 Il genoma è l'intero patrimonio genetico di un organismo vivente. Si può paragonare ad un'enorme enciclopedia in cui sono contenute le istruzioni che regolano lo sviluppo e il funzionamento dell'organismo. Il genoma è "scritto" in un composto chimico chiamato DNA (DeoxyriboNucleic Acid, acido desossiribonucleico) Cos é il Genoma?? Il DNA è identico per tutte le cellule di un individuo ed è contenuto nel nucleo

12 La scoperta del materiale genetico Qual è la sostanza responsabile dell ereditarietà dei caratteri? Quali devono essere le sue caratteristiche fondamentali? 1. Possedere l informazione 2. Replicare autonomamente 3. Andare incontro a variazione

13 LA STRUTTURA DI DNA ED RNA Sia il DNA che l RNA sono polimeri I monomeri sono i nucleotidi Il pentoso è uno zucchero a 5 atomi di carbonio

14 LA STRUTTURA DI DNA ED RNA Catena polinucleotidica di DNA. Legame fosfodiesterico 5-3 Nucleotidi del DNA e dell RNA. Le basi sono legate al atomo di C 1 del pentoso da un legame covalente. Nucleotide = pentoso + base azotata + gruppo fosfato Nucleoside = pentoso + base azotata

15 LA STRUTTURA DI DNA ED RNA Due fonti di informazione: 1. Gli studi di Erwin Chargaff sulla composizione in basi del DNA Indicavano che la molecola di DNA a doppia elica è costituita dal 50% di purine (A, G) e dal 50% di pirimidine (C, T) Quantità di A = quantità di T e quantità di G = quantità di C (regole di Chargaff) % GC varia nei diversi organismi Esempio: %A %T %G %C %GC Homo sapiens Zea mays Drosophila Escherichia coli 26,1 23, ,1 1,00

16 LA STRUTTURA DI DNA ED RNA Due fonti di informazione: 2. Gli studi sulla diffrazione dei raggi X di Rosalind Franklin e Maurice H. F. Wilkins Il DNA è una struttura ad elica con 2 periodicità distintive: 0.34 nm e 3.4 nm

17 IL MODELLO TRIDIMENSIONALE La molecola di DNA è costituita da due catene polinucleotidiche avvolte l una intorno all altra; doppia elica destrorsa; Le due catene sono antiparallele; Lo scheletro zucchero-fosfato si trova all esterno della doppia elica, mentre le basi sono orientate verso l interno; Le basi complementari dei due filamenti opposti sono legate insime da legami deboli (A-T) 2 legami H, (G-C) 3 legami H secondo le regole di Chargaff; Le coppie di basi sono distanziate 0,34 nm, mentre un intero giro dell elica richiede 3,4 nm. Le impalcature zucchero-fosfato della doppia elica non sono ugualmente distanziate tra loro, ciò determina la formazione di un solco maggiore e di un solco minore.

18 IL MODELLO TRIDIMENSIONALE

19 IL MODELLO TRIDIMENSIONALE Il DNA può esistere in diverse forme, A, B, e Z DNA-A DNA-B DNA-Z Destrorsa Destrorsa Sinistrorsa

20 1962: Premio Nobel in Medicina e Fisiologia James D. Watson Francis H. Crick Maurice H. F. Wilkins Watson, Crick e Wilkins ricevettero il Premio Nobel per la Medicina nel 1962 per la scoperta della struttura del DNA. L'esclusione della Franklin dal premio è dovuto alla sua morte di cancro nel 1958, probabilmente a causa delle radiazioni a cui i suoi studi la avevano lungamente sottoposta. Nell'immaginario comune, la scoperta della struttura del DNA è legata ai soli Watson e Crick. Nella comunità scientifica è opinione diffusa che i motivi di ciò siano legati alla scarsa reputazione di Wilkins (che secondo molti era solo "alla ricerca di pubblicità") e, soprattutto, alla morte della Franklin. Rosalind Franklin

21 L ORGANIZZAZIONE DEL DNA NEI CROMOSOMI Il genoma negli organismi eucarioti e procarioti è organizzato in cromosomi Nelle cellule il DNA è associato a proteine formando un complesso denominato cromosoma Le modalità di compattamento sono differenti in cellule procariote ed eucariote: Il compattamento oltre a rendere più stabile il DNA ne favorisce la trasmissione più efficiente alle cellule figlie

22 L ORGANIZZAZIONE DEL DNA NEI CROMOSOMI Genoma = cromosoma o set di cromosomi che contiene tutto il DNA di un organismo (o particella virale) Cromosomi virali - DNA o RNA a singolo o a doppio filamento; - circolare o lineare; - circondato da proteine. TMV T2 batteriofago λ batteriofago Cromosomi procarioti - La maggior parte dei procarioti contiene un singola molecola di DNA a doppio filamento ciircolare, organizzata in una regione densa della cellula detta nucleoide.

23 L ORGANIZZAZIONE DEL DNA NEI CROMOSOMI Problema: Se misurato linearmente, il genoma di E. coli (4.6 Mb) sarebbe volte più grande della sua cellula. Il genoma umano se venisse stirato (3.4 Gb) sarebbe lungo 2.3 m. Soluzioni: 1. Superavvolgimento: La doppia elica del DNA è avvolta nello spazio intorno al suo asse (topoisomerasi) 2. Il DNA è organizzato in domini ad ansa.

24 STRUTTURA DEI CROMOSOMI EUCARIOTI Cromatina Complesso di DNA e proteine (quantità circa doppia rispetto a quella del DNA) Due fondamentali tipi di proteine: Istoni: abbondanti, proteine basiche, cariche positivamente che legano il DNA; 5 tipi principali: H1, H2A, H2B, H3, H4; ruolo cruciale nell impacchettamento del DNA; quantità e proporzioni conservate in tutte le cellule eucariote; evolutivamente conservate. Non-istoni: tutte le altre proteine associate al DNA; meno abbondanti degli istoni; marcate differenze in tipo e quantità.

25 STRUTTURA DEI CROMOSOMI EUCARIOTI Impacchettamento del DNA nei cromosomi: Livello 1 Il DNA si avvolge intorno agli istoni per creare la struttura dei nucleosomi; Livello 2 I nucleosomi si connettono mediante tratti di DNA linker (147 pb). Struttura a filo di perle ; Livello 3 Impacchettamento dei nucleosomi nella fibra cromatinica da 30-nm (H1); Livello 4 Formazione dei domini ad ansa. proteine non-istone: scaffold cromosomico

26 DNA a doppia elica STRUTTURA DEI CROMOSOMI EUCARIOTI Schema di una sezione di un cromosoma metafasico Struttura a filo di perle Cromosomi impacchettati, fibre 30-nm Componenti non-istoniche dell impalcatura Sezione cromosomica estesa Sezione cromosomica condensata Cromosomi metafasici Impalcatura cromosomica Ansa del DNA

27 La grandezza totale del genoma umano aploide è di basi

28 La quantità di DNA contenuta nel genoma aploide è una caratteristica propria di ciascuna specie vivente ed è definita come valore C La quantità nei diversi organismi varia in maniera considerevole e non mostra una relazione diretta con la complessità di struttura e l organizzazione di un organismo: paradosso del valore C Esempi: valore C (bp) Virus e fagi λ 48,502 T4 168,900 HIV-1 9,750 Batteri Escherichia coli 4,639,221 Eucarioti Lilium formosanum (giglio) 36,000,000,000 Zea mays (mais) 5,000,000,000 Amoeba proteus (ameba) 290,000,000,000 Drosophila melanogaster (moscerino della frutta) 180,000,000 Mus musculus (topo) 3,454,200,000 Canis familiaris (cane) 3,355,500,000 Equus caballus (cavallo) 3,311,000,000 Homo sapiens (uomo) 3,400,000,000

29 Nell uomo, il numero di geni è molto inferiore all atteso - Solo ~ il 3% del genoma è costituito da sequenze codificanti -Il genoma umano contiene geni -~60% dei geni hanno splicing alternativo - Nel ~70% dei casi, lo splicing genera sequenze aa diverse, quindi il proteoma è costituito da ~ proteine

30 Non è il numero di geni che fa la differenza!!!!! La somiglianza tra il genoma dell uomo e quello dello chimpanzé è del 99%!! Drospophila ha geni e C.elegans , la pianta Arabidnosis ne ha E evidente che le funzioni e le interazioni fra gruppi di geni simili possono dare risultati molto diversi

31 Il corredo di enzimi metabolici non è sostanzialmente diverso da quello degli altri eucarioti ma il numero dei geni coinvolti in funzioni di regolazione come la trascrizione, la traduzione del segnale e la segnalazione intercellulare è aumentato in proporzione all aumento di dimensioni dell intero genoma

32 Quanti sono i geni essenziali? - Non tutti i geni sono essenziali. Nel lievito e nella mosca <50% dei geni hanno un effetto evidente - Alcuni geni sono ridondanti Non si sa perché sopravvivano nel genoma geni la cui funzione è apparentemente ridondante